Seçilen aday bakteri ve fungal izolatların in vitro testlerde antagonistik

In vitro‘da yapılan çalıĢmalara baĢlamadan önce izolasyon çalıĢmaları sonucunda elde edilen bakteriler KOH, Oksidaz testleri ile koloni, renk, biçim ve kenar özellikleri dikkate alınarak gruplandırılmıĢ ve 16 adet bakteri izolatının antagonistik etkilerini belirlemek için ön petri denemleri yapılmıĢtır. Bakteri izolatlarından 11 tanesinin S. sclerotiorum‘un geliĢimini engelleyemedikleri ve bu nedenle zon oluĢturamadıkları tespit edilmiĢtir.

Bu elemenin sonucunda in vitro ve in vivo denemelerine alınacak bu bakteriler 16S rRNA gen dizi analizi ile tür seviyesinde tanımlanmıĢtır. Analiz sonuçları, bakteriyel izolatların Bacillus cereus, Bacillus simplex, Brevibacterium frigoritolerans, Bacillus toyonensis ile yakından iliĢkili olarak tanımlandığını göstermiĢtir. Dizi benzerliği, NCBI'da mevcut olan dizilere göre Bacillus cereus‘da % 99 iken diğer bakterilerin dizi benzerlikleri %100 olarak analiz edilmiĢtir.

In vitro‘da testlenen aday bakterilerin S. sclerotiorum‘a gösterdiği etkililik durumları ve ‗Tukey Çoklu KarĢılaĢtırma Testi‘ sonuçlarına göre gruplandırması Çizelge 4.10‘da verilmiĢtir.

Çizelge 4. 10. Aday bioajan bakterilerin Sclerotinia sclerotiorum‘a karĢı in vitro etkileri S.sclerotiorum

Hırkatol Ġzolatı Eskil Ġzolatı Bakteri türleri Engelleme zonu

(mm) Engelleme oranı (%) Engelleme zonu (mm) Engelleme oranı (%) Bacillus cereus 10,17 a 57,95 a 10,33 a 50,49 a Bacillus simplex 10,5 a 54,6 a 10,3 a 49,19 ab Bacillus toyonensis (B1) 10,17 a 54,44 a 9,5 a 44,51 ab Bacillus toyonensis (B2) 7,2 b 50,25 a 9,5 a 44,09 ab Brevibacterium frigoritolerans 7 b 46,5 b 7 b 40,62 b

P≤0.05 (Aynı sütünda aynı harfle ifade edilen ortalamlar arasında istatistiki açıdan fark yoktur)

Çizelge 4.10‘da görüldüğü gibi, in vitro test sonuçlarına göre biyolojik mücadele ajanı antagonistik bakterilerin S. sclerotiorum‘un 2 izolatına karĢı antibiyosis etkileĢim gösterip göstermediği belirlenmiĢtir. Laboratuvar çalıĢmalarında S. sclerotiorum’a karĢı

en yüksek etkiye sahip bioajan bakteriler ġekil 4.12‘de, laboratuvar çalıĢmalarında S. sclerotiorum’a karĢı en düĢük etkiye sahip bioajan bakteriler ġekil 4.13‘de gösterilmiĢtir.

ġekil 4. 12. In vitro testlerde Sclerotinia sclerotiorum‘a karĢı yüksek engelleme zonu gözlenen bakteriler.

a) Bacillus cereus, b) Bacillus simplex ve c) Bacillus toyonensis (B1)

ġekil 4. 13. In vitro testlerde Sclerotinia sclerotiorum‘a karĢı düĢük engelleme zonu gözlenen bakteriler.

a) Brevibacterium frigoritolerans ve b) Bacillus toyonensis (B2)

Bütün bakteriyel ajanlar petride inhibasyon zonu oluĢturmuĢ ve antagonistik etki göstermiĢlerdir. Engelleme zon ölçümleri sonunda elde edilen değerler ölçüsünde en fazla antagonistik etki Hırkatol izolatında 10,5 mm ve Eskil izolatında 10,3 mm inhibisyon zon ölçümüyle Bacillus simplex‘de yine S. sclerotiorum‘un iki izolatında sırasıyla 10,17 mm ve 10,33 mm engelleme zon ölçümüyle Bacillus cereus ‗da bulunmuĢtur. Bacillus toyonensis (B1), Hırkatol izolatında diğer bakteriler gibi (10,17 mm) yüksek engelleme zonu oluĢtururken Eskil izolatında daha düĢük etki göstermiĢtir. En düĢük engelleme zonu ölçümü ise Brevibacterium frigoritolerans ve Bacillus toyonensis (B2)‘ de belirlenmiĢtir.

Antagonist bakterilerin yüzde engelleme oranları her iki izolatta genel olarak %38,62-57,95 oranında değiĢtiği tespit edilmiĢtir. Hırkatol izolatında en yüksek etki %57,95 engelleme oranıyla Bacillus cereus‘ da gözlenirken onu Bacillus simplex %54,6 ve Bacillus toyonensis (B1) %54,44 oranlarıyla takip etmiĢler ve bu üç bakterininde

a b c

istatistiksel olarak farklı olmadığı kaydedilmiĢtir. Bacillus toyonensis (B2), %50,25 ve Brevibacterium frigoritolerans %46,5 oranlarında engelleme göstermiĢler ve bunlar istatistiksel olarak kendi aralarında farklı bulunmuĢtur. Antagonist bakteriler Eskil izolatından da benzer derecede engelleme göstermiĢ ve yüzde engellemeleri en yüksek Bacillus cereus %50,49 ve Bacillus simplex‘de %49,19 görülmüĢtür. Brevibacterium frigoritolerans in vitro koĢullarda S. sclerotiorum‘a karĢı en düĢük etkiyi gösteren bakteri olarak belirlenmiĢtir.

Farklı araĢtırmacılar tarafından yapılan daha önceki çalıĢmalar Bacillus türlerinin in vitro testlerde S. sclerotiorum'un misel büyümesini ve sklerotial üretimini inhibe ettiğini göstermiĢtir (Soylu ve ark., 2005; Zhang ve Xue, 2010 ; Onaran ve Yanar 2011; Ji, 2013). Benzer Ģekilde çalıĢmamızda da %40,62-57,95 oranında misel büyümesini inhibe ettiği ve sklerotiyal üretimi önemli ölçüde ve farklı Ģekillerde inhibe ettiği gözlenmiĢtir. B. cereus, B. simplex, B. toyonenensis ve Brevibacterium frigoritolerans sırasıyla en etkili olanlar olarak belirlenmiĢtir. Ayrıca in vitro da bir haftalık inkübasyon sonrasında antagonistik bakterilere maruz bırakılan S. sclerotiorum'un inhibasyon bölgesine yakın misellerinde koyu kahverengi ölümler meydana gelmiĢtir (ġekil 4.12‘de a ve c görünümü) ve buda bu suĢların güçlü antifungal etkisine iĢaret etmektedir (Abdullah ve ark. 2008; Rahman ve ark., 2016).

Bacillus türleri biyolojik mücadele de çok yaygın olarak kullanılan bakteriler olup bu türlere ait B. subtilis, B. cereus, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, Bacillus megaterium ve Bacillus pumilus izolatlarının farklı bitkilerde S. sclerotiorum ve toprak kökenli fungal patojenlere karĢı oldukça etkili oldukları bildirilmiĢtir ( Zazzerini ve ark., 1987; Georgakopoulos ve ark., 2001; Mansour ve ark., 2008; Ajilogba ve ark., 2013; Tozlu ve ark., 2016).

Çok sayıda çalıĢma Bacillus suĢlarının fitopatojen funguslara karĢı antifungal etkisinin lipopeptit (surfactins, iturins, fengycins, polimixins, kurstakins ve bacitracins) sentezine bağlı olduğunu göstermiĢtir (Hathout ve ark., 2000; Price ve ark., 2007; Ongena ve Jacques, 2008; Banat ve ark., 2010; Yánez-Mendizábal ve ark., 2011; Béchet ve ark., 2012; Chandler ve ark., 2015; Torres ve ark., 2017; Sabaté ve ark., 2017).

ÇalıĢmamızda izole edilen Bacillus cereus suĢu Bacillus thuringiensis bakterisi ile çok yakından iliĢkilidir (Han ve ark., 2006). Bacillus thuringiensis, dünya çapında biyopestisit olarak kullanılan ve iyi bilinen entomopatojen bakteridir. Aynı zamanda B. thuringiensis ve B. cereus ile yapılan çeĢitli çalıĢmalarda S. sclerotiorum'a karĢı etkili biyolojik kontrol ajanı olarak da bildirilmiĢtir (Duncan ve ark, 2006; Zeng ve ark.,

2012; Gao ve ark., 2014; Ouhaibi-Ben Abdeljalil ve ark., 2016) . Bütün bulgular bizim çalıĢmalarımızla parallelik göstermekte ve B. cereus in vitro da %57,95 engelleme zonu ile en etkili biyoajan olarak tanımlanmıĢtır. Toprak patojenlerinin kontrolünde biyoajan bakterilerinin kitinaz enzimi üretmesinin önemli bir etken olduğu ve antibiyosis etkinin kitinolitik aktiviteden kaynaklandığı belirtilmektedir (Rocha ve Moura, 2013). B. cereus ve B. thuringiensis'in antibiyotik ve kitinolitik aktivitelerinin patojenin parazitizminde oldukça önemli olabileceği bildirilmiĢtir (Sung ve Chung 1997; Chérif ve ark., 2002).

Kamal ve ark., (2015), kanolada yaptıkları çalıĢmada S. sclerotiorum'un neden olduğu kök çürüklüğünde B. cereus ve B. subtilis antagonistik suĢlarının in vitro da misel geliĢimini önemli derecede azalttığını, sklerot çimlenmesini ise tamamen inhibe ettiğini tespit etmiĢlerdir.

Bacillus simplex ve Bacillus subtilis arasında bir iliĢki olup her ikiside aynı ekolojik görev için toprakta bulunmakta ve rekabet etmaktedirler (Sikorski ve Nevo, 2007; Earl ve ark., 2008). Fakat B. subtilis ürettiği surfactin ile güçlü antibakteriyel, antiviral ve antifungal etki göstermekte ve toprakta bulunan B. simplex dâhil olmak üzere pek çok Bacillus türlerine antagonistik etkileĢimde bulunarak aktivitelerini bozmaktadır. Bu durumun bakterilerin ortama bıraktıkları metabolitlerden kaynaklanabileceği düĢünülmektedir.Yapılan çalıĢmalar B. toyonensis kolonilerininde çoğunlukla B. subtilis tarafından eradike olduğunu göstermiĢtir (Rosenberg ve ark., 2016). Pek çok çalıĢmada B. simplex‘in bitki büyümesini desteklediği bildirilmekte (Gutiérrez-Luna ve ark., 2010; Hassen ve Labuschagne 2010; Erturk ve ark., 2010) bazı çalıĢmalarda ise bu tür PGPR olarak tanımlamaktadır (Ash ve ark., 1991; Xu ve Côte 2003). B.subtilis türleri özellikle ürettikleri siderefor özellikte olan basillibaktin ile yaygın olarak biyolojik kontrol ajanı olarak kullanılır ve diğer PGPR‘ların etkilerine sahiptir. Farklı bitkilerin kök rizosferinden izole edilen B. simplex ve B. subtilis ile in vitro da karĢılaĢtırmalı yapılan bir çalıĢmada B. subtilis suĢunun daha hızlı inhibasyon zonu oluĢturduğu gözlenmiĢtir. Fakat her ikiside antifungal aktivite sergileyerek biyo kontrolde kullanım potansiyelinin olduğunu göstermiĢtir (Schwartz ve ark., 2013). B. simplex in vitro da fitopatojenlere karĢı kullanımı ile ilgili çok az çalıĢma yapılmıĢ ancak çalıĢmamızda elde edilen sonuçlar güçlü biyoajan olarak S. sclerotiorum‘a karĢı kullanılabileceğini göstermiĢtir.

ÇalıĢmamızda allelopatik olabilecek bakterilerin olmaması bizi izole ettiğimiz Bacillus türleri sonucuna götürmüĢtür. B. toyonensis, B. cereus ailesinin bir üyesidir ve

bu grup içerisinde B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B .pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. cytotoxicus bakterileri bulunmaktadır (Jiménez ve ark., 2013). Grubun tüm üyeleri toprak kökenli organizmalar olup, bu grubun bazı türleri patojen ve biyolojik ajan olarak kabul edilmektedir (Rasko ve ark., 2005). B. toyonensis ürettiği toyocerin aktif bileĢeni sayesinde ekonomik öneme sahip probiyotik bir bakteridir ve uzun yıllardır hayvan beslenmesinde yem katkı maddesi olarak kullanılmaktadır (Williams ve ark., 2009).

Domatesde yapılan bir çalıĢmada Ralstonia syzygii subsp. indonesiensis’nin neden olduğu bakteriyel solgunluk hastalığının kontrolünde B. toyonensis ve B. cereus‘un etkili olduğu bulunmuĢtur (Yanti ve ark., 2018) .

ÇalıĢmamıza benzerlik gösteren bir çalıĢmada sağlıklı domates bitkilerinin köklerinden izole edilen bakteriler 16S rRNA gen dizi analizi sonucunda B. toyonensis ve B. cereus olarak tanımlanmıĢtır. In vitro da ikili kültür tekniği sonucunda Fusarium solgunluğu (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)‘na karĢı yüksek antagonistik etki göstermiĢler ve fungusun misel geliĢimini tamamen durdurmuĢlardır (Rocha ve ark., 2017).

Bu çalıĢmada Bacillus cinsine ait Brevibacterium frigoritolerans diğer bakterilere kıyasla daha az inhibasyon zonu oluĢturmuĢ ve %46,5 engelleme oranı ile antagonistik etki sergilemiĢtir. Nitekim Aloe vera rizosferinden izole edilen B.frigoritolerans‘ın ilk kez toprakta fosfatı çözme ajanı olabileceği bildirilmiĢ (Tara ve Saharan, 2017) ve IAA üretimi yüksek olan bu bakteri in vitro da %38.6 siderofor üretimi sayesinde patojenlerin büyümelerini sınırlandırarak biyolojik mücadelede kullanılma potansiyeli göstermiĢtir (Park ve ark., 2005; Tsavkelova ve ark., 2007; Tara ve Saharan, 2017). Sideroforlar, gerekli olan Fe-III bağlayarak, fungal patojenlerin spor oluĢumunu engellemekte ve hastalığı ortadan kaldırmaktadır (Montesinos ve ark., 2002). Bitki büyümesini geliĢtiren bakteriler olarak bilinen bazı Pseudomonas türlerinin Bacillus türlerinden daha fazla siderofor ürettiği bilinmektedir (Kannahi ve Kowsalya, 2013). Sonuçlarımız, B. frigoritolerans‘ın güçlü siderofor üretimine sahip olabileceğini göstermekte ve biyoajan olarak kullanılma olasılığını daha da arttırmaktadır.

Son yıllarda ülkemizde de B. frigoritolerans ile yapılan çalıĢmalara rastlanılmaktadır. Aydın ilinde farklı meyve bahçelerinden toprak örnekleri toplanmıĢ ve bakteri çeĢitliliği incelenmiĢtir. Ġzole edilmiĢ bakteriler, 16S rRNA dizilimi ile aralarında Brevibacterium frigoritolerans ve B. cereus‘da bulunduğu türler olarak tanımlanmıĢtır. Topraktan izole edilen bu bakterilerin toprak ekosistemini

düzenlemedeki ve tarım uygulamalarındaki rollerinin çok önemli olduğu vurgulanmıĢtır (Yörükçe ve ark., 2017).

Sonuç olarak görülmektedir ki birçok Bacillus suĢları ile sıklıkla karĢılaĢılabilmektedir çünkü bu gruptaki bakteriler çok çeĢitli ekolojik niĢlerde yaĢayabilme yeteneklerinden dolayı oldukça yaygındırlar (Connor ve ark., 2010). Biyoteknolojik açıdan ise en önemli özelliği sekonder metabolitleri ve yapısal olarak farklı çok çeĢitli antagonistik maddeleri üretme kabiliyetlerinden dolayı bitki patojenlerine karĢı biokontrol ajanı olabilecek özelliktedirler (Felske, 2004; Pignatelli ve ark., 2009).

ÇalıĢmamızda ve birçok çalıĢmada farklı bitkilerin rizosferinden izole edilen Bacillus türlerinin sadece S. sclerotiorum‘a değil çok önemli fungal patojenlere (Alternaria solani, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Phytophthora infestans, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium culmorum ve birkaç Fusarium türüne) karĢı da in vitro da mükemmel antagonistik özelliklere sahip olduğu gösterilmiĢtir (Toure ve ark., 2004; Soylu ve ark., 2005; Rebib ve ark., 2012; Yánez- Mendizábal ve ark., 2011 ; Béchet ve ark., 2013; Falardeau ve ark., 2013; Zhang ve ark., 2013; Li ve ark., 2014; Guo ve ark., 2014; Hinarejos ve ark., 2016).

Bitki kök ekosistemlerinde en sık izole edilen toprak mantarları arasında Trichoderma türleri bulunmaktadır. Bu cinse ait birçok tür, önemli fitopatojenik fungusları parazitleyen veya antagonist olarak etkili olan biyolojik kontrol aktiviteleri ile bilinirler (Harman ve ark., 2004).

ÇalıĢmamızda izole etiiğimiz ve yapılan in vitro testlerde S. sclerotiorum‘a karĢı etkili bulunan iki fungal izolatın tanılanması sonucunda Trichoderma brevicompactum olduğu saptanmıĢtır. Aday biyolojik mücadadele ajanı antagonist fungusların in vitro testi sonuçlarına göre S. sclerotiorum‘a gösterdiği etkililik durumları ve ‗Tukey Çoklu KarĢılaĢtırma Testi‘ sonuçlarına göre gruplandırması Çizelge 4.11‗de verilmiĢtir.

Çizelge 4. 11. Aday bioajan fungusların Sclerotinia sclerotiorum‘a karĢı in vitro etkileri

Fungus türleri S. sclerotiorum’u kapatma süresi (gün)

Hırkatol izolatı Eskil izolatı

T.brevicompactum (T1) 20 b 16 b

T. brevicompactum (T2) 12 a ÇGM 10 a (ÇGM *)

P≤0.05 (Aynı sütünda aynı harfle ifade edilen ortalamlar arasında istatistiki açıdan fark yoktur) ÇGM *: Çok güçlü mikoparazitizm: Antagonist patojenin kolonisini tamamen kaplar

T. brevicompactum izolatlarının in vitro koĢullarda etkisi ikili kültür tekniğinde (Çizelge 4.11) S. sclerotiorum’u kapatma süresine göre değerlendirilmiĢtir. In vitro da ikili kültür tekniği, biyolojik kontrol ajanlarının seçim sürecinde önemli analizlerdir. Bu testler sıcaklık, nem, ıĢık ve toprak mikroflorasının değiĢken etkilerini en aza indiren kontrollü koĢullar altında gerçekleĢtirildiği için biyoajanların etkinliği ve patojenlerin ajanlara duyarlılığı hakkında oldukça önemli sonuçlar vermektedir (Stentelaire ve ark., 2001; Mello ve ark., 2007; Scharf ve ark., 2016) .

Test sonuçlarına göre T. brevicompactum‘un her iki izolatının da engelleme zonu olusturmadan S. sclerotiorum‘un koloni geliĢimini farklı sürelerde engelledikleri (Patojen X antagonist interaksiyonu) ve S. sclerotiorum‘un üzerini tamamen kaplayarak hiperparazitik (mikoparazitizm) etki gösterdiği belirlenmiĢtir. Çünkü Aydın ve Turhan, (2009) tarafından in vitro da yapılan bir çalıĢmada, Trichoderma türlerine ait ve antagonistik etkisi olduğu belirlenmiĢ izolatlar PDA besi ortamında patojenle karĢılıklı olarak geliĢtirildikten sonra, mikroskobik inceleme sonunda patojen fungusun hiflerini saran ve penetre edenler mikoparazitik etkili antagonistler olarak belirtmiĢlerdir.

Trichoderma türlerinin etki biçimlerinin araĢtırıldığı çalıĢmalarda, izolatlar petri kaplarında patojenik izolat ile karĢılıklı ekilmiĢ, antagonist fungusun petriyi doldurduğu süre sonunda geliĢen kolonilerdeki etkileĢimler antibiosis ve hiperparazitik (çok güçlü mikoparazitm, güçlü mikoparazitm, orta dercede mikoparazitzm ve zayıf mikoparazitizm) etki olarak ayrıldığı bildirilmiĢtir (Rodriguez ve ark., 2011; Atanasova ve ark., 2013; Aydın, 2019).

Kontrol olarak S. sclerotiorum‘un geliĢimi oldukça hızlı olup 5 gün sonra bütün petri yüzeyini kaplamıĢtır. T. brevicompactum‘un kontrolde koloni geliĢimini tamamlaması yaklaĢık 10 gün sürmüĢtür.

Çizelge 4.11 incelendiginde, T2 izolatı; en hızlı hiperparazitik etkiyi Eskil izolatına karĢı göstermiĢ ve inkübasyonun 7. günü baĢlayan ilk yüzleĢme 10. gün petriyi tamamen kaplayarak patojenin misel geliĢimi baskılanmıĢtır (ġekil 4.14). Petri kabındaki patojen kolonisini tamamen ve ilk kaplayan antagonist görünümünde olduğu için çok güçlü bir hiperparazitik etki gösterdiği kabul edilmiĢtir. Diğer patojen olan Hırkatol izolatı üzerindeki etkisi ise 9 ile 12 gün arasında sürmüĢ ve patojenin üzerini tamamen kaplamıĢtır.

ġekil 4. 14. Trichoderma brevicompactum (T2)‘un Eskil izolatına karĢı göstermiĢ olduğu hiperparazitik

etki. a) Kontrol, b) Mikoparazitik etkinin baĢlangıcı (7.gün) ve c) Petriyi tamamen kaplaması (10.gün)

T1 izolatının petrideki geliĢimi daha yavaĢ olarak gözlenmiĢ ve bu durum S. sclerotiorum’u baskılama süresini oldukça etkilemiĢtir. Eskil izolatının misellleri ile ilk mikoparazitizm etki 11. gün baĢlamıĢ ve yayılması devam ederek petrinin üzerini kapatma süresi 16. gün olarak kaydedilmiĢtir (ġekil 4.15). Benzer etkiyi Hırkatol izolatına karĢıda göstermiĢ ve engelleme baĢlangıcı 15. gün olup 20. gün petriyi kaplamayı tamamlamıĢtır. T. brevicompactum‘un her iki izolatıda gösterdikleri çok güçlü mikoparazitik etkiden sonra geliĢmeye devam etmiĢ ve petride kalın bir tabaka meydana getirmiĢlerdir. Antagonistik izolatların in vitro da etkilikleri arasında süre (gün) açısından istatistiki olarak fark görülmektedir. Testlerde T2 izolatının, patojen fungusun üzerini en kısa sürede tamamen örterek, yüksek oranda parazitleme gösterdiği saptanmıĢtır.

ġekil 4. 15. Trichoderma brevicompactum (T1)‘un Eskil izolatına karĢı göstermiĢ olduğu hiperparazitik

etki. a) Kontrol, b) Mikoparazitik etkinin baĢlangıcı (11.gün) ve c) Petriyi tamamen kaplaması (16.gün)

Yeni bir tür olan T. brevicompactum 2004 yılında ilk olarak morfolojik, moleküler ve filogenetik analizlerle doğrulanmıĢtır (Kraus ve ark., 2004) ve bu türle ilgili araĢtırmaların çok az olduğu görülmektedir. Degenkolb ve ark., (2008) tarafından yapılan bir çalıĢmada ayçiçeği (Helianthus annuus), mısır (maize), kako (Theobroma cacao), kabak (Cucurbita maxima) ve sedef otu (Glycosmis sapindoiodes) rizosferinden

a b c

izole edilen altmıĢ altı farklı Trichoderma türünün içerisinde T. brevicompactum da tanılanmıĢtır.

In vitro çalıĢmalarda kullanılan T. brevicompactum izolatları güçlü bir mikoparazittir. Mikoparazitizm karmaĢık bir süreç olup birlikte hareket eden mekanizmaların kombinasyonuna bağlıdır. Bu olaylar sırasında seconder metabolitler olan antibiyotik üretiminin patojenlerin geliĢmesine engelleyici etkiye sahip olabileceği düĢünülmektedir (Druzhinina ve ark., 2011; Mukherjee ve ark., 2012; Brotman ve ark., 2013).

Sekonder metabolitlerin üretimi ile mikoparazitizm arasında önemli bir iliĢki vardır ve Trichoderma‘nın patojen hifi etrafında sarılmasına, penetrasyon yapılarının oluĢumuna neden olan morfolojik değiĢimlere yardımcı olmaktadır (Lu ve ark., 2004; Lin ve ark., 2012). Sarımsaktan izole edilen T. brevicompactum'un sıvı kültürlerde yaklaĢık 86 mgL-1

trichodermin ürettiği ve Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lindemuthianum‘a karĢı in vitro da güçlü antifungal aktiviteye sahip olduğu tespit edilmiĢtir. Bu etkinin çok güçlü bir protein sentezi inhibitörü olan Trichodermin tarafından sağlandığı belirlenmiĢtir. Sonuçlar trichodermin‘in B. cinerea üzerinde daha güçlü ve inhibe edici etkisi olduğunu ve fitopatojen fungusların türüne göre bu etkinin farklılık gösterdiğini belirtmektedir (Shentu ve ark., 2014). T. harzianum (Th008)'un sıvı kültürde yaklaĢık 92.67 gL-1 trichodermin ürettiği önceki raporlarda (Bertagnolli ve ark., 1998) belirtilmiĢ, buna kıyasla T. brevicompactum‘un trichodermin üretiminde belirgin bir baĢarı sağladığı görülmektedir. Bu bağlamda S. sclerotiorum ile etkileĢimlerinde hifsel geliĢimin baskılamasında ortaya çıkan mikoparazitik etki yanında trichodermin‘in de iĢlemin birkaç aĢamasında oldukça önemli olduğu düĢünülmektedir. Sekonder metabolit olan trichodermin geniĢ spektrumlu ve güçlü antifungal aktiviteye sahip bir antibiyotik olarak ( Carrasco ve ark., 1973; Bailey ve ark., 2008; Samuels ve ark., 2006; Tijerino ve ark., 2011a) bilinmesine rağmen fitopatojenlere karĢı aktivitesi ile ilgili raporların oldukça az olduğu görülmektedir (Bertagnolli ve ark., 1998; Holmes ve ark., 2004; Tijerino ve ark., 2011b).

T. brevicompactum‘un biyolojik kontrol materyali olarak baĢarısı kısmen bu mantarların sekonder metabolitlerin üretme kabiliyetinden kaynaklanmaktadır (Zeilinger ve ark., 2016). Bu nedenle, yüksek trichodermin üretimi ve yüksek antifungal etkinliği T. brevicompactum izolatının antibiyotik üretiminde potansiyelini vurgulamaktadır (Nielsen, 2005).. Ayrıca T. brevicompactum‘un peptaibiyotik üretimi

belgelenmiĢ (Degenkolb ve ark., 2008) ve peptaibiyotiklerin üretiminin fitopatojen fungusların hücre duvarlarının bozulmalarına önemli katkıda bulunduğu (Lorito ve ark., 1996) bildirilmiĢtir.

Brezilya‘da yapılan bir çalıĢmada aralarında T. brevicompactum‘da bulunduğu kırk dokuz Trichoderma izolatının S. sclerotiorum'a karĢı in vitro da antagonistik aktiviteleri test edilmiĢ ve tüm izolatların maksimum %77 oranında misel geliĢimini engellediği ve sklerotia üretiminin tamamen durdurduğu tespit edilmiĢtir. Antagonistik parametreler göz önüne alındığında ise T. koningiopsis ve T. brevicompactum‘un en umut verici biyokontrol ajanlar olduğu bildirilmiĢtir (Marques ve ark., 2016). Gräfenhan (2006) tarafından asma da geriye doğru ölüm (Eutypa lata ) ve Esca hastalığı ( Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum )‘na karĢı T. brevicompactum‘un Ģimdiye kadar biyolojik kontrolde kullanılan Trichoderma (T. atroviride, T. harzianum, T. koningii ve T. viride) türlerinden daha etkili olduğu rapor edilmiĢtir. Nitekim yaptığımız çalıĢmada T. brevicompactum‘un toprak kökenli fungal patojenlerin misel büyümesine karĢı inhibe edici aktivitesinin trichodermin ve peptaibiyotikden kaynaklandığı düĢünülürse tarımsal uygulamalarda potansiyel değeri olduğunu göstermektedir.

Dünya literatüründe yapılan çalıĢmalara bakıldığında Trichoderma‘ların antagonistik etkisinin mikoparazitizm ( Monteiro ve Ulhoa, 2006 ; Almeida ve ark., 2007), hücre dıĢı hidrolitik enzimlerin üretimi ( Benítez ve ark., 2004; Monteiro ve ark., 2010), besin ve yer için rekabette avantaj sağlayan proteinlerin varlığı ( Elad, 2000a) ve antifungal aktiviteye sahip sekonder metabolitlerin üretimi gibi farklı mekanizmalardan kaynaklandığı bildirilmektedir ( Küçük ve Kıvanç 2003; Monaco ve ark.,. 2004; Kredics ve ark., 2003; Rubio ve ark., 2009; Cardoza ve ark., 2011; Tijerino ve ark., 2011b; Palmieri ve ark., 2012; Harel ve ark., 2014; Martínez-Medina ve ark., 2016).

Trichodermalar kimyasal bir uyaranla bitki patojeninden etkilenmekte ve büyümeye baĢlamaktadır Bu sinyaller fiziksel temas olmadan belli bir mesafeden Trichoderma tarafından hücre duvarı parçalayıcı enzimlerin etkisiyle salınabilmektedir. Patojen ile temasda Trichoderma hifin etrafını sarmakta veya hif boyunca büyüyerek hücre duvarına penetre olmaya yardımcı yapılar oluĢturmaktadır. Bu nedenle penetrasyon, kitinaz dâhil olmak üzere bir dizi hücre duvarını bozan enzimin salgılanmasıyla hem mekanik hem de enzimatik olarak meydana gelmektedir (Vinale ve ark., 2008; Viterbo ve Horwitz 2010; Bansal ve Mukherjee, 2016). Kitinaz ve β-1,3

glukanların da Trichoderma'nın bitki patojenlerini kontrol etme yeteneği ile iliĢkili olduğunu gösteren birçok rapor vardır (Kubicek ve ark., 2001; Brimner ve Boland 2003; Wang ve ark., 2003; Reithner ve ark., 2005; Harighi ve ark., 2007). Bu enzimler fitopatojenik fungusların hücre duvarlarını parçalayarak yıkıma uğratmak Ģeklinde etki etmektedir. Yapılan benzer çalıĢmalarda T. harzianum tarafından üretilen glukanaz veya kitinaz gibi enzimlerin fungus hücre duvarı sertliğini sağlayan polisakkaritler, kitin ve β-1,3 glukanların bozulmasını sağlayarak, hücre duvarı bütünlüğünü yok ettiğini, toprak kökenli bitki patojenlerinin baskılanmasında ve engellenmesinde etkili oldukları bildirilmiĢtir (Howell 2002; Küçük ve Kıvanç, 2004).

Son yıllarda yapılan çalıĢmalarda Trichoderma‘ların biyolojik kontrol etkinliğinde farklı alternatif bilgiler de edinilmiĢtir. Trichoderma türleri tarfından üretilen cerato-platanin (CP) familyasından gelen proteinler karbonhidratları bağlar ve buda kitin polimerlerinde olduğu gibi fitopatojen fungusların hücre duvarının yapısal bileĢenlerinde fiziksel boĢlukların açılmasını tetikleyebileceğini gösterir (Frischmann ve ark., 2013; Baccelli ve ark.,2014; Bonazza ve ark., 2015). T. brevicompactum karbonhidratla iliĢkili bileĢikleri diğer Trichoderma taksonlarına göre çok daha verimli