3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.6 Ölçüm Metodları
3.6.3 PPL reaktörde bakteri inaktivasyonunun izlenmesi
3.6.3.1 PPL reaktör düzeneğinin hazırlanması ve sterilizasyonu
PPL reaktörün, deneysel çalışmalar öncesinde tamamen sterilize (S) edilmesi amacıyla %70 etil alkol çözeltisinin 20 dakika boyunca sistemde peristaltik pompa vasıtası ile çevrimi sağlanmıştır. Ardından, PPL reaktör distile su ile durulanmıştır(D). Son aşamada ise sisteme 10 dakika boyunca peristaltik pompa ile yalnızca hava verilerek PPL reaktör düzeneğinin kurutulması (K) sağlanmıştır. S+D+K prosedürü her deneysel çalışma öncesinde izlenmiştir. Reaktör ve hortum vb baglantı noktalarının tamamen kuruması sağlanarak olası farklı bakteri, mantar vb. türlerin oluşumunu minimize etmek amaçlanmıştır. Ve dönem dönem yapılan testler ve referans koşullarda katı besiyerine yapılan ekimler ile düzeneğin kontamine olup olmadığı deneysel olarak test edilmiştir. Kuru halde bırakılmış sistem, bir sonraki gün yapılacak bakteri inaktivasyonu deneysel çalışmaları öncesinde, tekrar SDK prosedürüne tabi tutulmuştur. Ayrıca reaktör dışı, hortum vb. baglantı ve tesisat ekipmanları ve deneysel çalışmaların yürütüldüğü laboratuvar ortamı, her gün zefisol ve %70 etil alkol çözeltisi ile sterilize edilmiştir.
3.6.3.2 Bakteri kültürünün fotokataliz deneyleri için hazırlanması
Farklı sol-jel metodları ile üretilen ince-filmlerin fotokataliz ile bakteri inaktivasyonu potansiyelleri karşılaştırılırken E.coli ATCC 25922 kültürü kullanılmıştır. PPL fotoreaktörde yürütülen deneylerde ise E.coli DSM 498 kültürü kullanılmıştır. PPL reaktörde yürütülen çalışmalarda ayrıca E.faecalis, E.coli ve Enterococcus.sp. çevresel izolat kültürleri de kullanılmıştır. Farklı bakteri kültürü üzerinde yürütülen fotokataliz deneyleri ilgili başlıklar altında anlatılacaktır. Bu bölümün amacı, fotokatalitik bakteri inaktivasyonu çalışmaları öncesinde bakteri kültürünün hazırlanması ve deney başlangıç koşullarına uygun konsantrasyonun belirlenmesi aşamalarını izah etmektir.
Başlangıç bakteri konsantrasyonu belirlenirken spektrofotometrik ölçümlere ve McFarland standartlarına dayanan metod izlenmiştir. Bu metoda göre, %0.8 NaCl çözeltisini referans alan, 600 nm dalgaboyunda spektrofotometrik ölçümlerle 0.100 ABS değerine ulaşan bakteri çözeltisinin 108 CFU/mL e karşılık geldiği belirtilmektedir. Uygun koşullarda saklanan
81
sağlandıktan sonra spektrofotometre cihazında okumalar ile hedeflenen değere ulaşılmaktadır. Buzdolabında +4 0C koşullarda katı besiyerinde muhafaza edilen bakteri kültürü, oda
sıcaklığında 30 dakika bekletilmesi ardından, steril öze yardımı ile oda sıcaklığındaki bir miktar steril %0.8 NaCL çözeltisine transfer edilmektedir. Özenin karıştırıcı olarak kullanılması ile katı besiyerinden aktarılan bakteri kolonisinin çözünmesi sağlanmaktadır. Bu şekilde elde edilen 108 CFU/mL yoğun kültür, seri seyreltme metodundaki prosedür izlenerek 1ml bakteri kültürü - 9 mL NaCl çözeltisi olacak şekilde seri seyreltilerek, hedeflenen başlangıç konsantrasyonuna ulaşılır. Bakteri inaktivasyonu deneylerinin yürütüleceği toplam sıvı hacmine göre, hedeflenen başlangıç konsantrasyonuna uygun son seyreltme, distile su veya tercih edilen su kaynağı ile yapılmaktadır. Örnek olarak 107 CFU/mL lik bakteri kültüründen 5
mL alınıp 495 mL distile suya ilave ederek, 105 CFU/mL bakteri konsantrasyonu hedefine
ulaşılabilmektedir. Fotolitik veya fotokatalitik bakteri inaktivasyon çalışmaları öncesinde ve sırasında bakteri kültürü manyetik karıştırıcı ile yavaşça karıştırılmaktadır. Deneysel çalışmalarda zamana karşı alınan 1,5 mL hacminde numune 2 mL lik ependorflarda 1-2 dakika süre ila muhafaza edilmektedir. Normal şartlarda maksimum 1 haftalık süre ile buzdolabında saklanan hazır katı besi yeri dökülmüş plastik petri tabakları, buzdolabından çıkarıldığında sıcaklık farkı sebebiyle oluşan nemlenmenin giderilmesi amacıyla 35-40 0C’de kapağı açık ve
ters şekilde 10-15 dakika bekletilmektedir. Alınan numune seri seyreltme metoduna uygun olarak seyreltilip katı besi yerine 100 uL hacminde ekimi gerçekleştirilmiştir. Ardından steril öze ile katı besi yeri yüzeyine yayılması sağlanır ve 37 0C de ayarlı inkübatöre koyulur.
82
3.6.3.3 Seri seyreltme ve koloni sayımı metodu
Şekil 3.14. Seri seyreltme ve katı besi yerinde koloni sayımı metodu
Besleyici çözelti olarak laktoz besiyeri tercih edilmiştir. PPL fotoreaktörde bakteri inaktivasyonuna etki eden parametrelerin belirlenmesinde ve matematiksel model eldesi çalışmalarında, E.coli DSM-498 kültürü kullanılmıştır. E.coli DSM-498, Enteroccus faecalis ATCC-14506 laboratuvar standart kültürü ve doğal izolatları üzerinde yürütülen çalışmalarda da aynı bakteri inokulasyon ve sayım metodu izlenmiştir.
Deneysel çalışmalar sırasından alınan sıvı numuneler, seri seyreltme metoduna uygun olarak steril tuzlu su çözeltisi ile uygun seyreltileri hazırlanması ardından, katı besiyerine (0,1 mL) miktarda ilave edilerek, metal öze yardımı ile katı besiyeri yüzeyine yatay ve dairesel hareketlerle yayılmıştır. İnkübatör içi nem koşulunu uygun aralıkta tutabilmek amacıyla 24 saat sürede tükenmeyecek miktarda steril distile su bir beher içerisinde inkübatöre yerleştirilmiştir. 24 saat sonunda katı besiyerinde koloni sayımı gözle yapılmıştır (Şekil 3.14). Koloni yapı ve şekilsel özellikleri göz önünde bulundurularak kolonilerin oluşturduğu karakteristik yuvarlak şekiller gözlemlenmiştir. Sayımı yapılan kolonilerin mikrobiyolojik olarak anlamlı alt ve üst limitler arasında olmasına dikkat edilmiştir. Numune alımı sonrası seyreltme oranlarının bu değer aralıklarını sağlayacak şekilde yapılmasına özen gösterilmiştir. Maksimum koloni sayısı 300’ü geçmeyecek şekilde seyreltmeler yapılmıştır (Venieri ve ark. 2014b; Ferro ve ark. 2015; Sousa ve ark. 2013; Marugán ve ark. 2015).
3.6.3.4 Bakteri kültürünün doğal ortamdan izole edilmesi
E.coli ve E. faecalis toplam koliform bakteri grubunun varlığını belirlemek amacıyla
deniz suyundan öğle saatlerinde alınan numunelerden filtrasyon tekniğiyle bakteri kültürü izolasyonu sağlanmıştır. Toplanan sıvı numunelerin her birinden 100 mL alınarak nitro-selüloz
83
(0.45-0.47 um gözenek boyutlu= Pall-Gelman marka membran filtrelerden süzülmesi ve kalan süzüntüden (bakteri kültürünün tutulduğu filtre üzeri kalıntı) bakteri kültürünün alınarak seçici besi yeri ortamına (Triptone Bile-X Glucuronide ekilmesi) prosedürü izlenmiştir (Şekil 3.15). Prosedüre göre toplam koliform ve enterococcus s türleri için 37 0C’de 48 saat, E.coli için 44 0C’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Membran filtrasyon metodu şişelenmiş su ve ortam
numunelerinde kalitatif ve kantitatif çalışmalar yürütülebilecek en esnek metod olarak öne çıkmaktadır (Reasoner, 2004).
TBX besiyerinde oluşan koloniler, oluşturdukları renk özelliklerine göre değerlendirilerek en koyu siyah tonlarda olan koloniler tercih edilip öze ile alınarak, Slanetz Bartley besi yerine ekilmiştir (OXOID) (Manaia ve ark. 1990; Warburton ve ark. 1998). Son olarak 24 saat süre ile inkübasyona bırakılıp, süre sonunda koloni oluşumu takip edilmiştir. Bu metod ile izole edilen enterokok bakteri türleri Enterococcus. sp. olarak adlandırılmıştır.
Şekil 3.15. Membran filtrasyon tekniğiyle doğal ortam sıvı numunesinden bakteri kültürü izole
edilmesi prosedürü; Sırasıyla, sterilize edilebilir cam Whatmann filtrasyon düzeneği, Selülozik membran filtre, Seçici besi yeri
3.6.3.5 Bakteriler için minimum inhibe edici antibiyotik konsantrasyonunun (MİK) belirlenmesi
Antibiyotiklere dirençlilik seviyeleri belirlenirken, besiyeri mikroseyreltme metodu ile hedef antibiyotik türü için MİK değerleri hesaplanmıştır. MİK; bir organizmanın bir gecelik inkübasyon süresi sonunda gözle görülür büyümesini (toplam koloni sayısında artış) inhibe edebilen en düşün antibiyotik konsatrasyonu olarak tanımlanmaktadır. Metod, 96 adet steril hazneden oluşan mikroplakalarda, seçilen antibiyotiğin seri seyreltilmesi ile her bir hücrede azalan konsantrasyonlarda olacak şekilde test hücrelerinin hazırlanmasına dayanmaktadır.
84
Ardından Mueller-hinton besiyerinde başlangıç konsantrasyonu 105 CFU/mL ‘e ayarlanmış
bakteri çözeltisi her bir hücreye eşit hacimde aktarılır. (5 uL). Referans hücrelerin yalnızca M- H çözeltisi içerecek şekilde hazırlanmıştır. Ardından, mikro plaka 37 0C de 24 saat süre
inkübasyona bırakılmıştır
Şekil 3.16. Mikro-plaka metodu ile MİK belirleme çalışmalarına ait görüntüler, Mikro-plaka
ve Mikro-plaka okuyucu.
Test edilen konsantrasyon aralıkları, Levofloksasin, Eritromisin, Sefaklor, Klaritromisin, Amikasin, Ampisilin, Sulfametoksazol antibiyotikleri için sırasıyla 0.5-16, 2.5- 40, 16-512, 2.5-40, 0.5-32, 0.5-32 ve 2-32 ug/L olarak belirlenmiştir. Bu değer aralıklarının belirlenmesinde EUCAST verileri ve literatürde rastlanan çalışmalar baz alınmıştır (Michael, Rizzo, C. S. McArdell, ve ark. 2013; Rizzo, Della Sala, ve ark. 2014; Rizzo, Sannino, ve ark. 2014; Kahlmeter ve ark. 2003). Dirençlilik profilinin belirlenmesi çalışmaları, fotokatalize maruz kalmamış hücrelerde ve fotokataliz sonrasında yaşamsal faaliyetlerini sürdüren bakteri hücreleri üzerinde yürütülmüştür. Fotokataliz prosesi sırasında alınan numunenin, 24 saatlik inkübasyon süresi sonunda koloni oluşumu gözlenmiştir. Oluşan kolonilerden steril öze ile alınarak terkar katı besiyerine ekilmiş ve bir kez daha 24 saat süreyle 37 0C’de inkübasyona
bırakılmıştır. Tekrar gelişim gösteren kolonilerin, fotokataliz prosesi sonrasında yaşamsal faaliyetlerini sürdürebilen bakteri hücrelerini temsil ettiği kabulu ile dirençlilik belirleme çalışmalarına geçilmiştir.
Mikro-plaka üzerindeki referans hücrelerdeki (yalnızca MH içeren) bakteri gelişimi referans alınarak, diğer hücrelerdeki büyüme hesaplanmaktadır. Bu amaçla, 630 nm’de optik mikro- plaka okuyucu cihazında 1 dakika süre ile ön-karıştırma (yatay eksende titreşim ile) sonrası spektrofotometrik ölçüme tabi tutulmuştur. (Lab-Tech LT-4000). Elde edilen sonuçlar cihaza özel Manta LML yazılımı ile toplanarak değerlendirilmiştir (Şekil 3.16).
85
3.6.3.6 Bakteri kültürünün doğal ortamdan izole edilmesi
Uygulanan inaktivasyon prosesi sonrasında çıkış akımından alınan sıvı numuneden sabit hacimde katı besiyerine ekim yapılmıştır. Ayrıca uygulanan proses süresi ile eşit sürede Mueller-Hinton besin çözeltisi veya %0.8 NaCl (gr/gr) çözeltisinde bekletilen çıkış numunesi, bu ön işlem ardından katı besi yerine ekilmiştir. Her iki koşulda da, katı besiyeri inkübatörde 37 C0 ‘de sıcaklık koşullarında 24 saat süre ile bekletilmiştir. 24 saat süres sonunda oluşan koloni sayısı üzerinden bakteri yeniden büyüme davranışı sonuçları belirlenmiştir. Bu amaçla çalışmalar, solar fotoliz, UV-A fotokataliz, Solar fotokataliz ve Solar Mn dopantlı fotokataliz prosesi sonunda (tamamen bakteri inaktivasyonu sağlanan proses süreleri baz alınmıştır ve sonuçlar bölümünde ifade edilmektedir) alınan numuneler üzerinde yürütülmüştür. NaCl ve Mueller-Hinton çözeltilerinde bekletme ön işlemi, proses çıkışından alınan numunede bakteri hücrelerinin yeniden büyüme ve yaşamsal faaliyetleri üzerinde etkilerini belirleyebilmek amacıyla uygulanmıştır (A. G. Rincón & Pulgarin 2004a; Fiorentino ve ark. 2015)