Tek Ortak Anlamı Olan Maddeler

Para verificar se as hASCs eram capazes de se diferenciar na linhagem adipogênica, as células, na 4a passagem, foram semeadas na densidade de 1x103 _células/cm2 _{em placas de 6 poços (Techno Plastic Products) e cultivadas}

em meio de cultura adipogênico específico a 37°C, em atmosfera úmida e 5% CO2. O meio foi trocado a cada 2 dias. hASCs cultivadas em meio basal foram

mantidas como controle.

Após 21 dias de indução, as culturas foram lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2 e fixadas em formaldeído 10% por 1 hora a temperatura ambiente. As células fixadas foram lavadas com isopropanol 60% e em seguida, submetidas à coloração de Oil Red O (Thermo Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram incubadas com solução de Oil Red O em isopropanol 60%, por 5 minutos, lavadas com água deionizada e contra- coradas com hematoxilina por 1 minuto.

Oil Red O é um corante de lipídeos neutros e a diferenciação adipogênica pode ser confirmada pela coloração em vermelho dos lipídeos acumulados no interior das células, quando observado em microscópio óptico (Olympus IX70). A fotodocumentação foi realizada utilizando-se câmera (Olympus Evolt E-300) acoplada ao microscópio.

3.6.2. Diferenciação condrogênica

Para promover a diferenciação condrogênica as hASCs, na 4a passagem, foram cultivadas em um sistema de pellet de células. Para criar o pellet, aproximadamente 5x105 células foram recolhidas em 1 mL de meio de cultura basal em tubos de polietileno de 15 mL (Sarstedt) e centrifugadas a 800 g por 5 minutos. Em seguida, o meio sobrenadante for removido cuidadosamente e os pellets foram incubados com 1 mL de meio condrogênico específico nos tubos de polietileno de 15 mL, a 37°C, atmosfera úmida e 5% CO2, por 21 dias. O meio condrogênico foi renovado 1 vez por semana. Como

controle hASCs foram cultivadas em meio de cultura basal nas mesmas condições.

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Após 21 dias, os pellets foram lavados com PBS 0,15 M, pH 7,2 e fixados com formaldeído 10%, por 1 hora. Em seguida, os pellets foram processados e incluídos em parafina, de acordo com os protocolos utilizados no Laboratório de Biologia do Desenvolvimento, do Departamento de Morfologia, ICB, UFMG. Os pellets foram desidratados em banhos de concentrações crescentes de etanol: 70%, 80%, 90%, 100% (2 vezes), por 4 minutos em cada um deles. Após a desidratação, os pellets foram diafanizados com dois banhos de 10 minutos em líquido miscível com o meio de inclusão (xilol/toluol). Para a inclusão os pellets foram embebidos na parafina líquida. Os blocos de parafina obtidos foram submetidos à microtomia. Cortes de 5 µm de espessura foram montados em lâminas histológicas e corados com Alcian Blue 8GX (Sigma-Aldrich).

Para isso, as lâminas foram desparafinizadas em estufa a 60°C por 15 minutos, seguido por banho em xilol (14 minutos) e hidratados em série gradual de etanol: 100% (2 vezes), 95%, 70% (4 minutos em cada banho). Após a lavagem em água, as lâminas foram incubadas com o corante Alcian Blue 1% em ácido acético pH 2,5, por 30 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente por 2 minutos e os núcleos corados com hematoxilina, por 40 segundos. Após a lavagem em água corrente, os cortes foram desidratados em uma série crescente de etanol 70%, 95%, 100% (2 vezes). As lâminas foram montadas e observadas ao microscópio óptico (Olympus BX-41) e fotografadas por câmera acoplada (Q-Color3 digital da QImaging) revelando proteoglicanas e glicosaminoglicanas coradas em azul.

3.6.3. Diferenciação osteogênica

Para promover a diferenciação osteogênica as hASCs, na 4a passagem, foram semeadas na densidade de 2,5x103 _células/cm2 _{em placa de 24 poços}

(NUNC) e incubadas com meio osteogênico a 37°C, atmosfera úmida e 5% CO2 por 21 dias. Como controle hASCs foram cultivadas em meio de cultura

basal nas mesmas condições. O meio de cultura foi renovado a cada 2 dias. Após 21 dias, a diferenciação osteogênica foi avaliada pela coloração de von Kossa, que indica calcificação da matriz extracelular.

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As culturas foram lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2 e fixadas em etanol 70% por 24 horas. Em seguida, as células foram lavadas com água, incubadas com solução de nitrato de prata 5% (Vetec) e expostas a luz ultravioleta por 1 hora. As células foram lavadas com água destilada e incubadas com solução de tiossulfato de sódio 5% (Cinética Química Ltda), por 5 minutos, e coradas com eosina, por 40 segundos. As culturas foram observadas ao microscópio óptico (Olympus IX70) e fotografadas (Sony Cyber-shot DSC-H3) para demonstração da presença de mineralização indicada pela coloração negra ou marron.

3.7. Expressão de Ki-67

As hASCs cultivadas em meio de cultura basal suplementado com SFB e SH, na 4a _{e 10}a _{passagem, foram analisadas em relação a expressão do}

marcador de proliferação Ki-67. As células foram semeadas na densidade de 1x105 células em lamínulas de vidro de 22 x 22 mm e cultivadas por 24 horas nos respectivos meios de cultura basal. Em seguida, as células foram fixadas em formaldeído 10%, por 30 minutos a temperatura ambiente.

As hASCs fixadas foram lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2 e a membrana plasmática foi permeabilizada utilizando-se Triton-100X (Sigma) 0,2% em PBS 0,15 M, pH 7,2, por 10 minutos. Após a permeabilização, as células foram novamente lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2 e foi feito o bloqueio da reação com solução 3% PBS/BSA, por 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, as células foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente com os anticorpos primários: coelho anti-Ki-67 (1:50; Abcam) e para verificar a morfologia das células-tronco, foi utilizado o anticorpo de camundongo anti-α- tubulina (1:1000; Sigma), diluídos em solução 1% PBS/BSA.

Após incubação com anticorpo primário, as células foram novamente lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2 (3 vezes/10 minutos) e, em seguida, foram incubadas com o respectivo anticorpo secundário: Alexa Fluor 488 goat anti- coelho (1:500; Molecular Probes) e Alexa Fluor 555 goat anti-camundongo (1:500; Molecular Probes), diluídos em solução 1% PBS/BSA, por 1 hora em câmara úmida, protegido da luminosidade e em temperatura ambiente. Em seguida, as células foram incubadas com Hoechst 33258 pentahydrate

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(Invitrogen) por 20 minutos para marcação do núcleo e as lamínulas montadas em lâminas de vidro utilizando Hydromount Aqueous (National Diagnostics).

As lâminas foram observadas em microscópio confocal LSM 5 Live (Zeiss) e as imagens foram analisadas utilizando a ferramenta Cell counter do programa Image J (National Institutes of Health) para a quantificação das células positivas para o marcador Ki-67 (fluorescência verde) em relação ao número total de núcleos (azul), sendo 10 diferentes imagens analisadas para cada amostra e o resultado expresso em percentagem.