2.15.1. MDA (Malondialdehyde)
Peroksidasyona uğramış olan poliansatüre yağ asidlerinden oluşan reaktif bileşiklerden biri olan üç karbonlu MDA bir ketoaldehiddir [117] (Şekil 13). Araşidonik asidden, birçok lipoksidden, hidroperoksidlerden, endoperoksidlerden, prostaglandinlerden ve
tromboksanlardan oluşabilen MDA’nın ana kaynağı ansatüre yağ asidlerinin
peroksidasyonudur [118].
Birçok makromolekül ile hızlı bir şekilde tepkimeye giren ve çok reaktif bir bileşik olan MDA, serbest olarak veya farklı doku bileşenleri ile kompleks oluşturmaktadır. Doku lipid peroksidasyonu sonucu oluşan MDA hücresel düzeyde metabolize edilir. Karaciğer aldehid dehidrogenazı tarafından enzimatik yıkılıma uğrayan MDA, CO2’e metabolize
olmakta veya mitokondriyal yolla yıkılabilmektedir. İdrarda asit ile hidrolize edilebilen formda küçük miktarlarda ekskrete edilir. Eritrosit membranının aminofosfolipid organizasyonunu bozan MDA, hücre hasarında ve yaşlanma pigmenti olan lipofuksinlerin oluşumunda etkili gösterilmiştir. MDA’nın mutajenik olduğu ve kimyasal karsinojen gibi davrandığı da bilinmektedir [119].
O O
Şekil 13: MDA’nın kimyasal yapısı [117].
Biyolojik örneklerde lipid peroksidasyonunun ve serbest radikal aktivitesinin belirlenmesinde kullanılan en kolay ve yaygın yöntem, MDA’nın TBA ile tepkimesidir [97]. Lipid peroksidasyonunun belirlenmesi için kullanılan ve spesifik olmayan bir yöntem olmasına rağmen TBA tepkimesi, MDA üretiminin iyi bir göstergedir. Ayrıca, TBA testinin kaynatma aşamasında daha önce oluşmuş olan lipid hidroperoksidlerinin yıkılımı sonucunda artefakt bir MDA üretimi olmaktadır. Okside lipidlerde bulunan 2,4-alkadienler ve 2- alkenaller de TBA ile pozitif sonuç vermektedir. HPLC, serbest MDA ölçümünde en güvenilir yöntemdir [120].
2.15.2. SOD (Superoksit dismutas)
Hücre içerisinde enzimatik veya enzimatik olmayan yollarla meydan gelen süperoksit anyonunun uzaklaştırılmasını sağlar. Süperoksitin hidrojen peroksit ve oksijene dönüşümünü katalizler. Bu reaksiyonun hızı spontane bir dismütasyondan 10.000 kat daha fazladır [117] (Şekil 14).
Şekil 14: SOD ile dismutasyon görünümü [117]
Süperoksidin protonlanmış formu olan HO2 ile doğrudan oksitleme, bakır (Cu+2) ile demir (Fe+2) gibi metallerle veya seruloplazminle katalizlenen tepkimeler ve NO• ile O2• – arasındaki tepkimelerde oluşan reaktif peroksinitritler aracılığıyla LDL değişikliğe uğramaktadır. Damar duvarındaki O2• – kaynakları arasında endotel hücreleri, düz kas hücreleri, makrofajlar ve adventisyal fibroblastlarda bulunan NAD(P)H oksidazlar, lipoksijenazlar, ksantin oksidazlar, ve NO sentazlar bulunmaktadır [121].
Süperoksid anyon radikallerine karşı ana savunma aracı olan SOD, süperoksidin hidrojen perokside dismutasyonunu katalizleyen bir metalloenzimdir [117]. Genetik olarak 21. kromozomda lokalizedir. SOD tarafından katalizlenen tepkimenin hızı 2x109/ms’dir. Hücre içi SOD aktivitesindeki artış dioksijenin toksisitesine karşı gelişen bir direnç artışına neden olur [118].
Tüm süperoksit dismütazlar metaloprotein yapısındadır. Metal olarak Cu, Zn veya Mn taşırlar. Dokulara bakıldığında SOD enzimi hücreler arası matrikste ve hücre içerisinde bulunmaktadır. İntraselüler olarak bulunan SOD enzimi üç farklı alanda mevcuttur [117].
- Cu, Zn- SOD (sitozol)
- Mn- SOD (mitokondri matriksi)
- Cu, Zn-SOD (mitokondri membranlar arası aralık) - Cu, Zn-SOD- ekstraselüler aralık [117] (Tablo 3)
Tablo 3: İnsan dokularının Cu, Zn-SOD içeriği [117]
Doku Cu,Zn-SOD (ug/mg protein)
Karaciğer 4.7
Serebral gri madde 3.7
Testis 2.2 Renal korteks 1.9 Kalp kası 1.8 Renal medulla 1.3 Hipofiz 1.0 Akciğer 0.5 2.15.3. Katalaz (CAT)
Katalaz enzimi hücrelerde peroksizomlarda bulunur ve aşağıdaki reaksiyon çerçevesinde hidrojen peroksidi zararsız hale getirebilir (Şekil 15).
Şekil 15: CAT, SOD ve GPX reaksiyonlarının şematik gösterimi [117]
Katalaz enzimi hücre içinde peroksizomlarda ve sitozolde bulunmaktadır. Hidrojen peroksit (H2O2) molekülünü, iki basamaklı bir reaksiyonla H2O ve O2 moleküllerine parçalar
[122].
SOD reaksiyonu yada hücre içi O2 radikali tarafından oluşturulan intraselüler H2O2 nin
2.15.4. Glutatyon peroksidaz (GPX)
Glutatyon peroksidaz enzimi (GPX) ise sitozol ve mitokondri matriksinde bulunur. Glutatyon peroksidaz enziminin kataliz işlemi için indirgeyici bir ko-substrat olarak glutatyon (GSH) bileşiğine gereksinimi vardır. GSH tüm hücrelerde yaygın olarak bulunan tripeptid yapılı (γ-glutamilsisteinil glisin) antioksidan bir bileşiktir. Beyin dokusu göreceli olarak daha düşük düzeylerde GSH içerir. Yaşlanma ile birlikte beyinde GSH düzeyleri giderek azalmaktadır. GSH spesifik olarak hücrelerde redoks homeostazisini koruyan bileşiktir. Glutatyon hücrelerde indirgenmiş (GSH) ve yükseltgenmiş (GSSG) olmak üzere iki şekilde bulunabilir [117] (Şekil 15). GSH’un yanı sıra Tiyoredoksin/Tiyoredoksin redüktaz (Trx/TrxR) ve Redoks faktör-1 (Ref-1) molekülleri de hücresel redoks homeostazisinin korunmasında yardımcıdırlar [117].
Hücresel redoks homeostazisinin korunmasının önemi ve GSH’un hücresel fonksiyonları;
Enzim aktivasyonu DNA sentezi
Hücre döngüsünün regülasyonu
Spesifik genlerin transkripsiyonel aktivasyonu Sinyal iletimi
Apoptozisin regülasyonu
Hücresel redoks homeostazisinin korunmasında rol alan bu enzimler dokulara göre farklı miktarda bulunurlar [117](Tablo 4).
Tablo 4: İnsan dokularının Katalaz ve GPX içeriği [117]
Doku Katalaz(ünite mg/protein) GPX(ünite mg/protein)
Karaciğer 1300 190 Eritrositler 1000 19 Böbrek korteksi 430 140 Akciğer 210 53 Pankreas 100 43 Kalp 54 69 Beyin 11 79
3-MATERYAL METOT
Bu çalışma, Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hayvan Etik Kurulu’nun 65/2013 protokol nolu onayı ile laboratuvar hayvanları bakım ve koruma kılavuzu (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals-Institute of Laboratory Animal Resources Commission on Life Sciences National Research Council, USA) kriterleri dikkate alınarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın deneysel araştırma kısmı Ege Üniversitesi Deneysel Araştırma ve Hayvan Laboratuvarı kapalı olduğu için Dokuz Eylül Üniversitesi Multidisipliner Deneysel Araştırma ve Hayvan Laboratuvarı’nda, histopatolojik araştırmaları Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı’nda, biyokimyasal analizleri ise Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü ve AREL laboratuarında yapılmıştır.
Çalışmada Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Yetiştirme Merkezi’nden temin edilen, 200-300 gr. ağırlığında sağlıklı, dişi-erkek Wistar albino sıçanlar kullanıldı. Deney hayvanları, normal gece gündüz siklusunda, yaşadığı ortama adaptasyonu için en az enerji harcayarak uyum sağladığı optimal sıcaklıkta (20-22°C), hayvanların fizyolojik faaliyetlerinin bozulmamaları için gürültüden uzak, temiz bir ortamda kafeslerde gözetim altında tutuldu. Deney hayvanları deney sürecinde, gelişimleri için ihtiyaç duydukları iyonları alabilmesi için çeşme suyu ve standart (ticari) yapay fare yemi ile ad libitum beslendi. Çalışma süresince hayvanlar, kenarları sert plastik ve üstünde çelik ızgara bulunan deney grubuna göre işaretlenmiş kafeslerde (19x12x12 cm) aynı cinsiyette sosyal olarak aktif ve stresi azaltmak için üçlü veya dörtlü olarak barındırılmıştır. Deney süresince, uygun şekilde ışık almaları sağlanan bir ortamda, 12 saat aydınlık/ karanlık siklusu içinde ve günde bir kez temizlenen kafeslerde barındırılmışlardır. Yem ve suları ad libitum olarak verilmiş, altlık olarak talaş kullanılmıştır. Kontrol ve bakımları aralıksız ve düzenli yapılmıştır.