J.P Morgan Gelişmekte Olan Piyasalar Global Endeksi (EMBI Global)

RESUMO – O desenvolvimento mamário de novilhas leiteiras é governado por

um complexo processo envolvendo o sistema endócrino e fatores produzidos localmente. As citocinas são sintetizadas pelas células mamárias e podem estar envolvidas no processo de mamogênese. O presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos da adição de IL-6 recombinante humana na atividade mitogênica basal ou estimulada por IGF-1 ou FBS, em cultura de linhagens de células epiteliais mamárias - MAC-T. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualisados (n=8) com 6 tratamentos e 2 repetições/bloco. Os dados foram analisados em PROC GLM (SAS). O tratamento com IL-6 (30 ng/mL) tendeu a aumentar em 35,8% a proliferação celular quando adicionado ao meio de cultura basal (P<0,07). Em meio de cultura contendo IGF-1 (5ng/mL), a adição de IL-6 diminuiu a atividade mitogênica das células em 16,87% (P<0,03), enquanto que essa diminuição foi maior (33,79%) quando as células foram tratadas com 1% FBS como fator estimulador da proliferação celular (P<0,001). Os resultados apontam para o envolvimento da IL-6 na atividade mitogênica das células epiteliais mamárias quando da presença de fatores de crescimento no meio de cultura, podendo ser um dos inúmeros fatores envolvidos no desenvolvimento parenquimal mamário de ruminantes.

1. INTRODUÇÃO

As citocinas, mediadores solúveis que exercem diversas atividades biológicas no organismo, foram implicadas no complexo processo de desenvolvimento da glândula mamária (IMAGAWA et al., 2002). Elas podem ser sintetizadas no próprio epitélio, assim como no tecido estromático exercendo funções autócrinas e parácrinas no desenvolvimento parenquimal (IMAGAWA et al., 2002). A produção de IL-6 foi detectada em cultura de células epiteliais mamárias de humanos (BASOLO et al., 1993; SHUSTER et al., 1993) e de bovinos (OKADA et al., 1997; OKADA et al., 1999a). Além disso, a presença de mRNA para as mais diversas citocinas como IL-1Į, IL-1ȕ, IL-2 IL- 6, IL-8, IL-12, IL-10, IL-18 (interferon-_{Ȗ) e TNF-Į (tumor necrosis factor) foram} identificados na glândula mamária normal (LEUTENEGGER et al., 2000; ALLUWAIMI & CULLOR 2002; ALLUWAIMI, 2004).

As citocinas atuaram através de seus receptores pela ativação do sistema intercelular JAK/STAT e seus efeitos mitogênicos dependeram de outros fatores de crescimento no sentido de estimular ou inibir a proliferação celular (ALLUWAIMI, 2004). Enquanto que o TNF-Į estimulou o crescimento e desenvolvimento de células epiteliais e morfogênese dos ductos mamários (SHEA-EATON et al., 2001), a IL-6 parece exercer efeito inibidor nesse processo já que sua adição ao meio de cultura causou diminuição na proliferação de células mamárias epiteliais primárias de bovinas estimuladas com isoprotiolane e soro fetal bovino - FBS (OKADA et al., 1999b).

A suplementação de bST a novilhas pré-púberes causou diminuição na expressão gênica do precursor de IL-18 (interferon- Ȗ, IFN-Ȗ) e do receptor para IL-2 e aumentou a expressão gênica do receptor de TNF (Capítulo 2, Tabelas 3a e 3b). Esses resultados apontaram para participação das citocinas nos ciclos bioquímicos envolvendo o estímulo do desenvolvimento parenquimal pelo bST. Além disso, a IL-6 seria uma adipocina, ou seja, uma proteína sintetizada pelos adipócitos (TRAYHURN & WOOD, 2004), e portanto, sua síntese poderia aumentar em novilhas com aumento de gordura na glândula.

O presente trabalho focou em verificar as conseqüências da adição de IL-6 na proliferação induzida por IGF-1 através da utilização de um modelo in vitro utilizando linhagens de células MAC-T.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Cultura de Células

Para verificação dos efeitos da IL-6 na proliferação celular in vitro, foram utilizadas linhagens de células epiteliais mamárias imortalizadas MAC-T (HUYNH et al., 1991; Nexia Biotechnologies, Ste-Anne-de-Bellevue, Quebec, Canadá).

Na incubação utilizou-se 4 placas de 24 poços (Corning, NY), previamente incubadas por uma hora para obtenção de revestimento com 250 µL/poço de solução contendo 50 µg/mL de colágeno tipo I de cauda de rato (Fisher Scientific, Pitsburg, PA) suspensa em 0,02 N de ácido acético

Após a retirada do nitrogênio líquido, os peletes com as células foram rapidamente descongelados em banho Maria a 37ºC. Centrifugou-se as células após a lavagem com tampão PBS. Para contagem das células e verificação de viabilidade das mesmas, 50 µL da solução de células foram coradas com 25 µL de “trypan blue” a 0,4%, e 10 µL dessa solução foram depositados em cada uma das duas partes (superior e inferior) de um hematócrito e analisadas em um microscópio. Após o cálculo da quantidade de células por mL, diluiu-se a solução para atingir uma densidade de 5X103//mL e adicionou-se 1.0 mL da solução de células a cada um dos poços para incubação.

O meio de cultura inicial utilizado durante as primeiras 24 horas de incubação continha solução de Dubelco´s Modified Eagle Media/F12, suplementado com 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina, 0,25 µg/mL de anfotericina B (DMEM/F12 Invitrogen, Calrsbad, CA), 2 ng/mL de insulina, 1 µg/mL de glutationa, 1

µg/mL de inibidor de tripsina de soja, 5 µg/mL de apo-transferina e 10 % soro fetal bovino – FBS (Sigma, St. Louis, MO).

Após 24 horas retirou-se o meio de cultura inicial por aspiração e lavou-se os poços com PBS, sendo em seguida adicionado meio de cultura livre, contendo os compostos acima mencionado porém sem adição de FBS. As células permaneceram em incubação nesse meio de cultura por mais 48 horas.

As culturas de células foram realizadas durante todo o experimento em incubadora com temperatura constante de 37ºC e 5% de CO2.

Após os três dias inicias de cultura, os tratamentos foram adicionados ao meio de cultura.

Tratamentos

Seguindo-se a padronização anterior (SILVA et al., 2002) a quantidade utilizada de IGF-1 (Gro-Pep Pty Ltd, Adelaide, South Austrália), nos experimentos foi de 5 ng/mL e 1% de FBS. No entanto, para determinarmos a eficiência do produto foi realizado um experimento piloto com 3 diferentes doses de IGF-1 (0,1; 1 e 10 ng/mL) e 2 doses de FBS (10 e 1%) com a intenção de atingir isomolaridade entre os hormônios testados, a IL-6 humana recombinante (Sigma, St. Louis, MO) foi utilizada na dose de 30 ng/mL.

Cada uma das placas de 24 poços foi dividida em dois blocos de 12 poços e os seis tratamentos (controle, IL-6; FBS, IGF-1; IGF-1+IL-6 e FBS+IL-6) colocados aleatoriamente totalizando 2 poços/bloco/tratamento. No total foram testados 8 blocos por tratamento, com 2 repetições/bloco. As células foram então incubadas com os tratamentos por 24 horas.

Quantificação da Proliferação Celular

Após a incubação por 24 horas, foi adicionado aos poços 50 µL de solução contendo 0,5 µCi/mL de [3H]-thymidine (ICN, Irvin, CA) e levadas a incubação por 2 horas. Após esse procedimento, cada um dos poços foram lavados 8 vezes para

remoção do excesso de material radioativo, sendo 2 X com solução salina balanceada de Hank´s, 2 X com 90 % etanol, 2 X com ácido tri-cloroacético e por fim mais 2 X com 90 % etanol. Para promover a lise das células foi utilizado 250 µL de tampão contendo 0,1% Triton X-100, e a radioatividade mensurada com líquido cintilador em um contador beta.

Análise dos Dados

Os dados da incorporação de [3_{H]-Thymidine foram obtidos a partir da desintegração por} minuto (DPM). A eficiência do experimento foi calculada com base na relação dos canais 1 e 2, para cálculo da intersecção da curva e do grau de inclinação, como demonstrado na Figura 1.

Figura 1. Cálculo da eficiência do experimento a partir da relação dos canais 1 e 2.

Para obtenção do DPM calculou-se primeiro a eficiência a partir das seguintes fórmula:

E = In + SL X (CPM1,⁄ CPM2); Onde:

E = Eficiência;

Eficiência Calculada com a relação do Canal

y = -0.7988x + 0.8056 R2 _{= 0.9995} 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45% 50% 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 (CH2/CH1) E ficiência

In = Intersecção do eixo;

SL = Slope (inclinação da curva);

CPM1 = contagens por minuto (canal 1); CPM2 = contagens por minuto (canal 2)

DPM = E ⁄ CPM1; Onde:

DPM = desintegrações por minuto; E = eficiência;

CPM1 = contagens por minuto (canal 1).

Utilizou-se o programa Microsof Excel 2000 para obtenção dos resultados.A análise estatística dos dados foi realizada utilizando-se o procedimento “general linear model” – PROC GLM (SAS, 2000), com o seguinte modelo:

Y = Tratamento + Placa + Tratamento X Placa

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O IGF-1 é um potente fator mitogênico das células epiteliais mamárias (WEBER et al., 1999) e as respostas encontradas no presente experimento seguiram um padrão esperado e muito semelhante a resultados obtidos anteriormente por SILVA et al. (2002). A síntese de DNA das células MAC-T aumentou linearmente com o aumento nas concentrações de IGF-1 testadas (Figura 2).

A adição de FBS 1% às culturas de células estimulou a taxa de síntese de DNA em 8,13 vezes, enquanto que a adição de 10% do produto causou um aumento de 9,78 nessa taxa (Figura 3). Os dados relativos à adição de 1% de FBS foram similares a resultados anteriores (SILVA et al., 2002) e essa quantidade foi a utilizada nos experimentos para verificação de possíveis efeitos da IL-6 no estímulo de proliferação celular pelo FBS.

Figura 2. Efeitos do IGF-1 na incorporação de [3H]-Thymidine pelas linhagens de células epiteliais mamárias “MAC- T”. As células foram incubadas com o tratamento durante 24 horas e adição de [3H]-Thymidine deu-se durante 2 horas após a aplicação do tratamento. Os valores são expressos em desintegração por minuto (DPM) e apresentada pela média dos tratamentos aplicados (Lsmeans) ± SE (erro padrão), n = 4 blocos por tratamento.

Figura 3. Efeitos do FBS (“fetal bovine serum”) na incorporação de [3H]-Thymidine pelas linhagens de células epiteliais mamárias “MAC-T”. As células foram incubadas com o tratamento durante 24 horas e adição de [3H]-Thymidine deu-se durante 2 horas após a aplicação do tratamento. Os valores são expressos em desintegração por minuto (DPM) e apresentada pela média dos tratamentos aplicados (Lsmeans) ± SE (erro padrão), n = 4 blocos por tratamento.

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 0 1 10 FBS (%) In ccorporação de 3H -Thym idi n e (D P M ) 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 0,1 1 10 IGF-1 (ng/ml) Inccorporação de 3H -Thym id in e (D P M )

A adição da IL-6 ao meio contendo 1% FBS reduziu em 33,7% a síntese de DNA na cultura celular (P<0,001, Figura 4). Esses resultados coincidiram com um trabalho anterior conduzido com cultura de células mamárias epiteliais primárias extraídas de vacas em lactação aonde a adição de IL-6 ao meio de cultura contendo FBS a 5% reduziu a proliferação dessas células em 30 % (OKADA et al., 1999b).

Também quando testada com IGF-1 como fator estimulante da proliferação celular, a IL-6 reduziu em 16,87% a síntese de DNA das células (P<0,03, Figura 4). O IGF-1 é um dos mediadores do bST no estímulo do desenvolvimento parenquimal e novilhas pré-púberes suplementadas com bST apresentaram aumento na quantidade de 47% DNA parenquimal e diminuição na gordura da glândula (RADCLIFF et al., 1997). A diminuição na proliferação celular quando da adição de IL-6 ao meio de cultura sugere a participação dessa molécula nos ciclos celulares que ocorrem in vivo quando do estimulo do bST no desenvolvimento mamário de novilhas. Essa participação provavelmente ocorre através de efeitos parácrinos ou seja, com sua síntese no tecido adiposo (TRAYHURN & WOOD, 2004). Nos experimentos conduzidos in vivo, a administração de bST não alterou a expressão de IL-6 no tecido parenquimal e diminuiu na expressão gênica de IL-18 (Tabelas 3a e 3b, Capítulo 02). Isso reforça a teoria de que a IL-6 pode estar envolvida nos mecanismos que levam o bST a aumentar o desenvolvimento mamário já que um dos fatores que induzem a produção de IL-6 por células não-patológicas é a IL-18 (ou IFN-Ȗ) (VAN SNICK, 1990). Já que a administração de bST leva a diminuição na expressão de IL-18 no parênquima, haverá diminuição no estímulo de produção de IL-6 pelo tecido adiposo, com conseqüente diminuição na quantidade de IL-6 circulante no tecido mamário.

O oferecimento de dietas com níveis energéticos elevados na fase pré-púbere aumenta a concentração de IGF-1 no plasma e esse aumento não é acompanhado de aumento no desenvolvimento parenquimal (AKERS et al., 2000). A diminuição de proliferação celular induzida pelo IGF-1 quando da adição de IL-6 ao meio de cultura, sugere a participação dessa molécula nos efeitos antagônicos do IGF-1 no desenvolvimento parenquimal de novilhas em crescimento acelerado. A IL-6, assim como a leptina atua através de ativação de STAT3 (proteínas tradutoras de sinais e

ativadoras de transcrição3) ativando sinais de apoptose celular. A leptina diminuiu a proliferação celular in vitro induzida pelo FBS e IGF-1 (SILVA et al., 2002) seguindo um padrão muito semelhante aos encontrados no presente trabalho para IL-6. Uma vez que a dieta elevada aumenta a quantidade de gordura na glândula (RADCLIFF et al., 1997), e já que a IL-6 é produzida nos adipócitos, um aumento nas concentrações de IL-6 na glândula mamária poderão levar a uma subseqüente diminuição no desenvolvimento mamário.

A participação da IL-6 na proliferação celular parece depender de outros estímulos presentes, como o IGF-1 e outros fatores e hormônios presentes no FBS já que no presente estudo, quando da adição de IL-6 ao meio de cultura basal (sem adição de FBS ou IGF-1) encontrou-se uma tendência (P<0,07, Figura 4) a um aumento na síntese de DNA em relação a cultura em meio basal sem IL-6. Existem relatos de estímulo da proliferação celular in vitro quando da adição de IL-6 recombinante ao meio de cultura basal, sem adição de outros estímulos (GROSSMAN et al., 1988). No entanto, as razões que levaram a uma tendência ao aumento na proliferação celular quando da adição de IL-6 ao meio de cultura encontrado no presente trabalho não são muito claras e estudos in vitro e in vivo deverão ser realizados para verificação da participação das citocinas no desenvolvimento mamário de novilhas pré-púberes.

4. CONCLUSÕES

O aumento na gordura mamária pode levar a diminuição no desenvolvimento parenquimal através do estímulo da produção de citocinas, como a IL-6 já que a mesma diminuiu a proliferação celular induzida pelo IGF-1. Futuros trabalhos in vitro e in vivo devem ser conduzidos no sentido de uma melhor compreensão do envolvimento de citocinas no desenvolvimento parenquimal.

Figura 4. Efeitos da adição de interleucina-6 recombinante humana – IL-6 (30 ng/ml) em meio de cultura basal (colunas azuis), com FBS (colunas amarelas) e IGF-1 (colunas vermelhas) na incorporação de [3H]- Thymidine pelas linhagens de células epiteliais mamárias MAC-T. As células foram incubadas com o tratamento durante 24 horas e adição de [3_{H]-Thymidine deu-se durante 2 horas antes da retirada dos}

tratamentos. Os valores são expressos em desintegração por minuto (DPM) e apresentada pela média dos tratamentos aplicados (Lsmeans) ± SEM (erro padrão médio), n = 8 blocos por tratamento. Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os tratamentos (P<0,05) a* indica que o tratamento com IL-6 em meio de cultura basal causou uma tendência (P<0,07) a um aumento na incorporação de [3H]-Thymidine c* indica que houve uma tendência maior síntese de incorporação de [3H]-Thymidine em meio de cultua contendo IGF-1 combinado com IL-6 do que quando da adição de IL-6 ao meio de cultura estimulado com FBS (P<0,08). 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 basa l IL-6 30ng _FBS1 % FBS+ IL-6 IGFI 5ng IGFI +IL- 6 in cor por ação de [ 3 H ]- Thym idi ne (D P M ) a* c c* a b b

5. REFERÊNCIAS

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CAPÍTULO 5 – IMPLICAÇÕES

Através da utilização da técnica de microarranjos, pode-se identificar diversos genes putativamente relacionados ao desenvolvimento do tecido parenquimal alterados pela administração de bST e pela alimentação com dietas contendo níveis protéicos e energéticos elevados. Tais genes incluíram fatores de crescimento, moléculas de adesão celular, fatores da matriz extra-celular, receptores, hormônios e inibidores do ciclo celular.

A administração de bST estimulou genes positivamente relacionados ao desenvolvimento tecidual enquanto que a dieta teve pouco efeito sobre esses genes. Esse efeito tênue também deve ser considerado já que muitas vezes, a alteração de um único gene pode levar a efeitos no desenvolvimento mamário e posterior produção leiteira, portanto, cada um dos genes de interesse alterados deverão, em trabalhos futuros, ser analisados através de outras práticas em biologia celular e molecular, adotando-se procedimentos in vitro e in vivo para apreciação dos mesmos.

Além disso, a utilização de uma técnica desenvolvida tão recentemente como é a técnica de microarranjos, levou a questionar alguns dos resultados obtidos e portanto, para que se possa obter resultados conclusivos sobre os genes alterados, diversos ensaios experimentais deverão ser conduzidos.

Pode-se determinar que tanto a alimentação com dieta contendo níveis protéicos e energéticos elevados como a administração de bST alteraram a expressão gênica da leptina no parênquima mamário. Sendo a leptina uma proteína hipoteticamente envolvida na proliferação celular aumento ou diminuição em sua produção poderá causar alterações no desenvolvimento e nas futuras produções leiteira. Também em relação a possíveis envolvimentos da leptina no desenvolvimento mamário, trabalhos futuros devem ser conduzidos.

A utilização de um modelo in vitro para verificação dos efeitos da IL-6 na proliferação celular induzida pelo IGF-1 foi de grande valia já que nos permitiu criar uma nova teoria, a de que as citocinas podem estar envolvidas no processo de inibição do

estímulo do IGF-1 no desenvolvimento parenquimal de novilhas criadas em regime de crescimento rápido. A condução de experimentos in vivo poderão auxiliar numa melhor compreensão dos efeitos das citocinas no desenvolvimento mamário.

Não poderia deixar de considerar o fato de que tendo sido os trabalhos conduzidos nos Estados Unidos, os animais receberam um manejo bastante diferente do aplicado em nosso país, assim sendo, em nível de campo, pouca informação seria aplicável às nossas condições.

Curiosamente, durante a realização de revisão de literatura, pude notar a falta de trabalhos relacionados ao desenvolvimento da glândula mamária desenvolvidos no Brasil. Trata-se de uma área de enorme importância e aplicação não somente no setor da pecuária leiteira, como nos outros setores da agropecuária, já que um bom desenvolvimento mamário implica em boa disponibilidade de alimentação para o neo nato. Assim sendo, pesquisas voltadas ao estudo do desenvolvimento mamário deveriam ser realizadas tanto com bovinos com também com as mais diversas espécies de mamíferos.

Como conclusão geral, acrescenta-se que ambos os manejos aplicados alteraram o complexo processo de desenvolvimento a nível molecular. Caso as proteínas sintetizadas a partir desses transcritos sejam igualmente alteradas, poderão haver conseqüências no processo posterior de produção leiteira, com uma possível diminuição no caso de dietas com níveis protéicos e energéticos elevados e aumento no caso da administração de bST.