Animais Utilizados e Coleta de Tecidos
No presente trabalho utilizou-se tecidos de 32 novilhas da raça Holandesa de um experimento prévio conduzido em 1994 no Dept. de Ciências Animais da Michigan State Unversity (MSU) (RADCLIFF et al., 1997) Os animais com peso médio de 126 kg foram divididos em 4 grupos, em um delineamento experimental em fatorial 2 X 2 e os tratamentos tiveram início quando as novilhas atingiram 120 dias de idade.
No grupo controle (LC) os animais receberam alimentação ad libitum com uma ração completa (Tabela 01), formulada para proporcionar ganho de 0,8 kg/dia. No segundo grupo (LB) os animais foram alimentados ad llibitum com a dieta controle e injetados diariamente com somatotropina bovina recombinante – bST (25 µg/kg de peso corporal, Pharmacia and Upjohn Inc., Kalamazoo, MI.; grupo LC + bST = LB). No terceiro grupo (HC = dieta elevada sem administração de bST), as novilhas foram alimentadas com uma ração completa contendo níveis energéticos e protéicos elevados formulada para ganho de peso de 1,2 kg/dia (Tabela 01). Por fim, o quarto grupo experimental (HB = dieta elevada e suplementados com bST) compreendeu animais alimentados com a dieta elevada e injetados diariamente via intra-muscular com bST (25 µg/kg de peso corporal). Os animais foram abatidos conforme atingissem a idade fisiológica correspondente a fase luteal inicial do 5o ciclo estral, ou seja em média 71 dias após o início da puberdade, tendo as novilhas dos grupos LC e LB atingido essa idade fisiológica aproximadamente 276 dias após o início do experimento com ganho de peso médio diário de aproximadamente 0,8 kg e as dos grupos HC e HB após 218 dias, com ganho de peso médio diário de 1,23 kg (RADCLIFF et al., 1997).
No presente trabalho, o grupo dieta controle “L” compreende os grupos dieta controle suplementados ou não com bST (L = LC + LB), enquanto que grupo dieta elevada “H”, refere-se as novilhas em dieta elevada, independente da administração de bST (H = HB + HC). No tocante aos efeitos do bST, dois grupos são considerados: grupo controle para bST “C”, que compreende animais que não receberam administração de bST, independentemente da dieta (C = LC + HC) e grupo “B”, que compreende animais recebendo bST em ambas as dietas (B = LB + HB).
A glândula mamária dos animais foi removida ao abate e separadas no ligamento suspensório médio em metade direita e esquerda. O parênquima foi isolado do tecido adiposo e imediatamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a - 80°C para análises posteriores.
Tabela 01 Composição média das dietas controle e elevada (adaptada de RADCLIFF et al., 1997) Composição* Dieta Controle Dieta Elevada
Ingrediente Concentrado % MS 10 75
Milho moído 91,4 74,2 Farelo de soja 0 20
Proteína de origem animal 2 0 3,7 Suplemento vitamínico mineral 3 1,21 0,16
Sal 2,0 0,4 Fosfato monocalcico 1,0 1,0 Deccox-10X 4 4,4 0,6 Volumoso (% MS) 90 25 Mcal/Kg EMm5 1,05 1,28 Mcal/Kg Emg6 0,45 0,65 PB (% MS)7 17,3 18,8 PNDR (%MS)8 25 24 FDN (% MS)9 55,8 47
Nutrientes Médios Totais
FDN, % na MS9 49,6 19,4 EMm, Mcal/Kg5 1,17 1,83 EMg, Mcal/Kg6 0,57 1,20 PB, % na MS7 16,3 19,4 PNDR (% PB)10 29,9 38,0 Proteína absorvida (%PB)10 8,8 13,3 1MS Matéria Seca
2mistura de proteína animal (APB63; Purina Mills, Lansing,MI)
3 composição do suplemento vitamínico-mineral (9,9% Ca; 7,8% P; 6,3% S; 4,2% Fe; 3,4% Mn; 3,4% Zn; 8500 ppm
de Cu; 510 ppm de I; 250 ppm Se; 85 ppm de Co; 2100 UI/kg de vitamina A; 310 UI/kg de vitamina D e 23 UI/kg de vitamina E)
4DECCOX-10x£ - anticocciostático (Purina Mills, Atlanta, GA) 5 EMm = Energia Metabolizável de manutenção
6EMg = Energia Metabolizável de ganho 7PB = Proteína Bruta
8PNDR = Proteína não=degradável no rúmen 9FDN = Fibra em detergente neutro
10estimado pelo NRC (1989)
* As dietas foram formuladas para fornecimento de 100% dos requerimentos de vitaminas, minerais e proteína (NRC, 1989)
Extração de RNA
O RNA total foi extraído com a utilização do Ribopure Kit (Ambion) a partir de 100 mg de tecido parenquimático de 32 animais (8/tratamento). Após a extração, o RNA foi ressuspenso em água MiliQ livre de RNAse em quantidade suficiente para atingir uma concentração mínima de 1,25 µg/mL, as amostras foram analisadas em espectrofotômetro, para determinação da concentração e a pureza do RNA avaliada pela relação entre a absorbância em 260 e 280 nm.
Para verificar a qualidade, 1,0 µL da solução contendo de 100 – 500 ng de RNA foi analisada no Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), que elimina a necessidade da realização de gel eletroforese. O RNA foi considerado de boa qualidade quando a relação entre os picos 28 18 S foi 0,9. As amostras foram armazenadas a - 80°C até a realização dos experimentos de microarranjos e qRT-PCR.
Microarranjos – Delineamento Experimental e Protocolo Utilizado
O delineamento experimental em fatorial 2 X 2 foi utilizado nos experimentos de microarranjos. As amostras de RNA total foram agrupadas (2 amostras/”pool”), gerando um total de 16 “pools” de amostras (4/tratamento). O experimento foi constituído de 4 “loops” independentes, cada um com diferentes ordens e marcação dos tratamentos, de tal modo que todas as seis possíveis combinações (LC x HC; LC x LB; HC x HB; LB x HB; LC x HB, HC x LB), fossem representadas ao menos uma vez em ambas as direções.
Para a realização dos experimentos foi utilizada uma biblioteca específica para bovinos, a “National Bovine Functional Genomic Consortium - NBFGC” contendo 19.200 pontos. Esses pontos representam 18.263 diferentes seqüências de genes (etiquetas de sequências expressas – ESTs), além de 96 ESTs de B. Taurus ß-actin, 96 ESTs de B. Taurus GAPDH, 120 ESTs de lambda Q, 241 ESTs negativas (3 X SSC) e 384 ESTs “blank”. O arranjo é configurado em 12 linhas por 4 colunas, totalizando 48 “patchs”, cada um deles contendo 20 X 20 pontos (400 pontos em cada um dos “patchs”). Um exemplo das imagens obtidas após escaneamento com os arranjos utilizados pode ser encontrado no Capítulo 1 (Considerações Gerais). A descrição detalhada da biblioteca NBFGC foi reportada no trabalho de SUCHYTA et al. (2003).
Cada um dos “pools” de amostra de RNA total (10 µg) foram então processados em reação de transcriptase reversa (Atlas PowerScript Fluorescence Labeling system, BD Bioscences, Alameda, CA) para obtenção de cDNA, com oligo (dT)18 como “primer”. Após a síntese de “first-strand” o cDNA foi marcado com n-hydroxisuccinate (NHS)-derivatized Cy3 e Cy5 fluoróforos (Amersham Bioscencies) antes da hibridação.
Após marcação, as amostras foram purificadas para remoção do fluoróforo e cDNA não incorporados utilizando-se o kit de purificação QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGENE group, USA) e as duas amostras testadas combinadas e concentradas a 10 µL com a utilização dos tubos Microcon 30 Spin Concentrator (Milipore). Às sondas finais foi então adicionado 100 µL de solução SlideHyb 3 (Ambion) pré-aquecida a 70°C, e somente então aplicadas no microarranjo pré-aquecido pela porta da hibridizadora (GeneTAC Hybridization Station microarray hybridization chamber, Genomic Solutions, Ann Arbor, MI).
As lâminas foram lavadas antes de utilizadas. A lavagem foi realizada em 2 vezes SDS 0,1% (a preparação foi feita adicionando-se 950 mL de água bi-destilada a 50 mL de SDS a 20% - 200 g de SDS gel de eletroforese dissolvidos em 900 mL de H2O bi destilada) em temperatura ambiente por 2 minutos, 2 vezes em água miliQ por 1 minuto (temperatura ambiente), 1 vez em água miliQ fervendo por 3 minutos e 1 vez em 100% etanol por 30 segundos (no gelo) e imediatamente secos em centrífuga por aproximadamente 2 minutos (temperatura ambiente). Após as lavagens os arranjos foram imediatamente colocados na hibridizadora e pré-aquecidos para posterior aplicação das sondas.
A hibridação foi então realizada durante 18 horas, em temperaturas variando de 65°C a 42°C em vácuo. Após esse processo, a estação realizou três lavagens automáticas: duas com tampão de estringência média e uma com tampão de estringência alta (Genomic Solutions).
Depois de retirados da hibridizadora as lâminas foram então lavadas em tampão 2 X SSC (NaCl 0,3 M e Citrato de Sódio 0,03M) e água bi-destilada e então secos por centrifugação a 1.000 RPM, em temperatura ambiente por aproximadamente 2 minutos, dentro de tubos cônicos de 50 mL.
Após secos, as lâminas foram imediatamente escaneadas em um escaner dual especial para microarranjos (GeneTAC LS IV microarray scanner, Genomic Solutions)
Para o processamento das imagens, alinhamento dos pontos e integração dos arquivos gerado pelas imagens e geração de relatório de intensidade dos dados, foi utilizado o programa de informática GeneTAC integrator 4.0. O relatório final foi então
gerado em forma numérica em um arquivo separado por vírgulas compatível com Microsoft Excel e com o programa de análise estatística SAS.
Normalização dos dados e análises estatísticas
O potencial de intensidade dos fluoróforos no microarranjo foi visualizado utilizando-se uma curva de dispersão de M vs A contruída para cada um dos arranjos, aonde a relação de intensidade de log M =log(Cy3/Cy5)=logCy3−logCy5 foram plotados contra a média de intensidade de log A=(logCy3+logCy5)/2 para cada um dos pontos dos arranjos como descrito por Yang et al. (2002). A normalização dos dados de cada um dos arranjos foi realizada considerando-se uma técnica de regressão local robusta (CLEVELAND & GROSSE, 1991) utilizando-se o procedimento de LOESS do SAS (SAS, 2000). A eficiência de normalização com LOESS foi avaliada pela monitoração da curva M vs. A (YANG et al., 2002) e dispersão da curva de dados do
3
logCy contra logCy em cada um dos arranjos antes e depois da normalização. Os 5 dados normalizados foram então novamente transformados antes das análises estatísticas utilizando-se a fórmula: logCy3* = A+M*/2 e logCy5* = A−M*/2 aonde
*
3
logCy e *
5
logCy são os dados de intensidade de log normalizadas. Nesse caso, M
M
M* = − ˆ representa cada um dos valores de M sendo Mˆ o valor LOESS predito para cada um dos pontos. As intensidades de log ajustadas em LOESS foram então analisadas utilizando-se um modelo misto consistente de duas etapas (WOLFINGER et al., 2001). A primeira etapa envolveu a normalização da variabilidade espacial específica do arranjo e a segunda etapa, análises específicas do genes para testar os efeitos da dieta e bST no perfil gênico de cada um dos genes. O modelo de normalização na primeira etapa incluiu os efeitos gerais de tratamentos, arranjos, “pools”, marcadores e “patch” dentro de um determinado arranjo. A segunda etapa das análises estatísticas consistiu de modelos específicos do gene para residuais estimados obtidos do processo de normalização descrito anteriormente. Para cada gene, um modelo linear misto foi considerado, o qual foram incluidos os efeitos fixos da dieta e do
bST e a interação entre eles, e os efeitos dos marcadores, bem como os efeitos aleatórios de replicação (“pools”), arranjos e efeitos residuais. Os valores “p” para esses testes foram então convertidos a valores “q” para estabelecimento da significância estatística baseada na taxa de falsos resultados de 5% para testes múltiplos (STOREY, 2002). As análises foram computadas com o uso de procedimentos MIXED do SAS (SAS, 2000).
Para o cálculo de variação entre os tratamentos de interesse, utilizou-se a média final obtida nos dois tratamentos testados, elevando-se esses resultados ao exponencial 2, obtiveram-se então os valores de variação para os tratamentos que se quer analisar.
A seguir, as seqüências de cDNA impressas representando genes onde a expressão gênica variou significantemente, foram submetidos a análises de BLASTn para identificação da identidade e funções desses genes determinados posteriormente, a partir de uma extensa pesquisa e análise na literatura (PubMed). Essas informações foram então utilizadas para clusterização preliminar dos genes alterados em categorias funcionais amplas para a apresentação nos resultados.
PCR em tempo real (qRT-PCR)
Com o objetivo de validar a técnica de microarranjo, seis genes foram testados em qRT-PCR. RNA total de 32 amostras não combinadas (non-pooled) foram utilizadas para síntese de cDNA com RNAse H- Superscript II, 10 nM dNTP mix, 0,1 M DTT (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 100 uM “primer” dT18. A quantidade e qualidade de cDNA foram então determinadas no espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Rockland, DE).
Os “primers” para os genes testados foram desenhados no software Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA). As seqüências dos “primers” reverso e “forward” são representados na Tabela 02.
Tabela 02. Seqüências dos “Primers” Utilizados em qRT-PCR: Controle: Glucoronidase ß (GUS); Proteína ligante 3 do fator de crescimento semelhante a insulina (IGFBP3); Serine Protease Hepsin; Insulin-Like Growth Factor Acid Labile Subunit (IGFALS); Fibroblast Growth Factor Receptor (FGF-R); Transforming Growth Factor Ǻ Receptor III (Tgfȕ-R III); Cell Cycle Division 42 (CDC42).
Gene e “primer” Sequência GUS “forward” TGTCATCGCACACAGAGCAA reverso CACAAAATCCAGGTGAGAAGCTT IGFBP3 “forward” ATCGTCCAAATATGATAGCACCTATACTAG reverso GCGCCCCCAGGAGAGT Hepsin “forward” CAGGGCCCGAGCTGATCTA reverso CGCCACTGTGGAGGACCTT IGFALS “forward” CTGGATCTGAGCCGGAACA reverso TCTGGAGCTTGGGCAGCTT FGF-R “forward” ACACGACACCAGGTCCTTGAA reverso CCACCCGGGATGGAGTATT TGFȕ-R III “forward” GCAAATGTTATTGGCTATTGTAAGATCA reverso TGGCAGGAAGCAGCTTCTG CDC42 “forward” TGGAAATTTGTTTGTTGTGTAGGATATC reverso ATGCAGACAATTAAGTGCGTTGTT
As análises de qRT-PCR foram realizadas no Applied Biosystems 7000 DNA sequence detection system (Perkin Elmer Corp., Foster City, CA) utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os valores de Ct foram obtidos utilizando-se o software ABI Prism 7000 SDS versão 1.1 (Applied Biosystems). Os dados de expressão foram então normalizados contra glucoronidase ß (GUS) e os níveis relativos de expressão foram calculados de acordo com o método de ǻǻCt (LIVAK & SCHMITTGEN, 2001). O teste de ANOVA (SAS, 2000) foi aplicado para comparação de similaridade dos padrões obtidos entre as técnicas. A Figura 01 demonstra o padrão de comportamento dos genes nas duas diferentes técnicas.
Figura 01. Padrões de Comportamento dos Genes: Hepsina, IGFBP3 (proteína ligante tipo 3 de IGF), IGFALS (subunidade ácida de proteína ligante de IGF), CDC42 (Ciclo de Divisão Celular 42), FGF Receptor (receptor tipo 2 de fator de crescimento de fibroblastos), TGF Beta Receptor (receptor de fator de crescimento transformador), Testados nas Duas Diferentes Técnicas: microarranjos (linhas azuis) e qRT-PCR, representada (linhas cor de rosa ). As Barras Verticais Representam o Erro Padrão Dentro das Médias de Tratamentos Analisadas. LC representa o grupo controle; LB representa o grupo dieta controle com administração de bST; HC representa o grupo dieta elevada sem administração de bST e HB representa o grupo dieta elevada com administração de bST