As pesquisas para classificação dos genes de acordo com sua função fisiológica foram efetuadas no website do CAFG da MSU (http://gowhite.ans.msu.edu/), e posteriormente classificados de acordo com sua função molecular e biológica no Gene Onthology (http://www.godatabase.org/), entre fevereiro e agosto de 2004.
Dentro dos contrastes principais (B X C; H X L), 1083 genes foram diferencialmente expressos (P<0,05). A administração de bST alterou a expressão gênica de 620 genes enquanto que a alimentação com níveis energéticos e protéicos
IGFBP3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 LC LB HC HB IGFALS -2.7 -2.2 -1.7 -1.2 -0.7 -0.2 0.3 LC LB HC HB CDC42 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 LC LB HC HB FGF Receptor -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 LC LB HC HB
TGF Beta Receptor III
-3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 LC LB HC HB HEPSIN -1.4 -0.9 -0.4 0.1 0.6 1.1 1.6 LC LB HC HB ls means tr ans for mad as em ex pr es são gêni ca ls means tr ans for mad as em ex pr es são gêni ca
altos alterou um total de 463 genes (P<0,05). Existem diversas maneiras de se explorar a significância biológica de resultados obtidos em experimentos de microarranjos. Uma delas é através da organização dos genes dentro de grupos funcionais por exemplo de ciclos ligados a uma certa função para examinar a regulação de “cluster” desses genes. No presente trabalho o interesse maior foi o de identificar genes envolvidos em indução ou inibição do desenvolvimento tecidual alterados pela administração de bST ou pela dieta oferecida. Efetuou-se então a clusterização dos genes alterados classificando-os em diferentes categorias de acordo com sua função biológica. Após análise e clusterização, verificamos que dentre os genes alterados pelo bST e que puderam ter sua função determinada, 28% foram relacionados a funções que envolvem a formação tecidual como proliferação, ciclo, adesão, crescimento, divisão e apoptose celular (Figura 02).
Quando da clusterização dos genes alterados pela dieta elevada (grupo H) em relação aos animais alimentados em dieta moderada (grupo L), 22% dos genes alterados pela dieta foram enquadrados na função de formação tecidual (Figura 03).
Após a classificação inicial e identificação das funções biológicas dos genes alterados pelos efeitos principais, uma nova análise foi realizada com o intuito de, através da análise da quantidade de genes relacionados a formação tecidual e presentes na biblioteca utilizada, verificar a proporção desses genes alterados pelos tratamentos. Dos 18.263 genes presentes na biblioteca NBFGC, 448 foram relacionados a proliferação, adesão, ciclo, crescimento, divisão, morte celular e apoptose. As 4 primeiras categorias anteriormente mencionadas, foram denominadas no presente trabalho de “genes proliferativos” e as duas últimas de “genes anti- proliferativos”.
Figura 02. Classificação dos genes alterados pela administração de bST como efeito principal (grupo B) quando comparados aos genes dos grupos sem administração de bST (grupo C). Após a clusterização, 28% dos genes que puderam ter sua função biológica identificada foram classificados com genes relacionados a formação de tecidos (P<0,05)
Figura 03. Classificação dos genes alterados pela dieta elevada como efeito principal (grupo H) quando comparados aos genes dos animais alimentados com dietas moderadas (grupo L). Após a clusterização dos genes, 22% dos genes que puderam ter sua função biológica identificada foram classificados com genes relacionados a formação de tecidos (P<0,05)
Quando comparados com o grupo controle para bST (C), os animais que receberam bST (B) tiveram a expressão de 53 (11,8%) desses genes alterada (P<0,05), sendo estimuladas a expressão 34 genes proliferativos (Tabelas 03a e 03b) e dois genes anti-proliferativos (Tabela 04) (DEAD-box protein abstrakt (ABS) e Growth-arrest specific 8), e inibidas a expressão de 17 (Tabelas 05 e 06) desses genes sendo pelo menos 6 deles identificados como genes anti-proliferativos, 5 relacionados a apoptose (IGFBP3, caspase recruitment domain family, member 11; inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase gamma; interleukin 2 receptor; interleukin 18) e um relacionado a regulação negativa da proliferação celular (BRCA1 associated protein-1 (ubiquitin carboxy-terminal hydrolase) (Figura 04).
A dieta por sua vez (grupo H) apresentou um efeito menos acentuado nesses genes, tendo alterado a expressão de 26 genes, estimulando a expressão de14 proliferativos 2 genes anti-poliferativos (Tabela 07) e inibido a expressão de 10 genes proliferativos (Tabela 08) (Figura 04).
Figura 04. Número de genes proliferativos (colunas vermelhas) e anti-proliferativos (colunas azuis) alterados pela administração de bST (B) e dieta elevada (H) (p<0,05). bST estimulados = número de genes proliferativos ou anti-proliferativos estimulados pela administração de bST (B vs C); bST inibidos = número de genes proliferativos ou anti-proliferativos inibidos pela administração de bST (B vs C); estimulados dieta H = número de genes proliferativos ou anti-proliferativos estimulados pela administração de dieta com níveis energético e protéico elevados (H vs L); inibidos dieta H = número de genes proliferativos ou anti-proliferativos inibidos pela alimentação com dieta com níveis protéico e energético elevados (H vs L).
52
BvsC LC LB HC HB SE4 Pbst Pdiet Pinter
• Adesão Celular
NBFGC_BG691961 catenin (cadherin-associated protein), alpha 1, 102kDa 2,07 0,402 1,163 0,432 1,776 0,375 0,012 0,373 0,405
NBFGC_BE588613 collagen, type XIV, alpha 1 (undulin) 1,92 -0,248 0,447 -0,085 1,103 0,567 0,027 0,291 0,507
NBFGC_BE589641 chemokine (C-X-C motif) receptor 3 1,73 -1,014 -0,431 -0,854 0,139 0,413 0,043 0,316 0,556
NBFGC_BE480007 integrin, alpha 3 (antigen CD49C, alpha 3 subunit of
VLA-3 receptor) 1,13 -1,482 -1,365 -1,532 -1,308 0,298 0,023 0,964 0,415
NBFGC_BF230242 vascular cell adhesion molecule 1 1,09 0,443 0,458 0,383 0,620 0,134 0,042 0,446 0,066
• Ciclo Celular
NBFGC_BE663477 sirtuin (silent mating type information regulation 2
homolog) 2 (S. cerevisiae) 1,29 -2,540 -2,367 -2,740 -2,175 0,197 0,000 0,953 0,011
NBFGC_AW481824 cyclin D1 (PRAD1: parathyroid adenomatosis 1) 1,27 -0,859 -0,607 -1,141 -0,695 0,316 0,006 0,143 0,342
NBFGC_BF230594 TNF receptor-associated factor 6 1,27 -2,672 -2,316 -2,572 -2,231 0,337 0,018 0,543 0,952
NBFGC_BE809775 Homo sapiens pleckstrin homology domain containing,
family B (evectins) member 1 (PLEKHB1), mRNA 1,23 -0,708 -0,350 -0,857 -0,621 0,258 0,043 0,169 0,641
NBFGC_BE754205 PECAM 1 1,22 -0,893 -0,741 -1,126 -0,709 0,190 0,043 0,441 0,303
NBFGC_BG689207 spectrin, alpha, non-erythrocytic 1 (alpha-fodrin) 1,20 2,701 2,856 2,760 3,123 0,358 0,032 0,163 0,335
NBFGC_BF605019 microtubule-associated protein 1B 1,17 -0,310 -0,214 -0,296 0,061 0,181 0,023 0,149 0,149
NBFGC_BE722663 Homo sapiens PAC clone RP5-886O8 from 7, complete
sequence 1,15 0,033 0,291 0,061 0,207 0,343 0,028 0,773 0,487
NBFGC_BF654231 histidine triad nucleotide binding protein 1 1,15 -0,176 -0,159 -0,278 0,121 0,134 0,021 0,287 0,031
NBFGC_BG691656 cyclin G1 1,15 1,329 1,433 1,211 1,499 0,138 0,009 0,703 0,151
NBFGC_AW656282 transmembrane, prostate androgen induced RNA 1,14 0,291 0,428 0,382 0,621 0,123 0,013 0,064 0,426
NBFGC_BE808490 CHK2 checkpoint homolog (S. pombe) 1,13 0,833 0,961 0,834 1,053 0,178 0,047 0,619 0,559
1 Seqüência do gene na biblioteca NBFGC, a lista completa pode ser acessada em http://gowhite.ans.msu.edu/public_php/NBFGC_GeneLink.html
2 Variação entre os grupos B (animais suplementados com bST = HB+LB) e C (animais dos grupos controles para bST = HC+LC) , os valores de variação são
calculados com base nas médias dos tratamentos elevados ao exponencial 2
3 médias obtidas dos tratamentos LC = animais em dieta controle sem administração de bST; LB = animais em dieta controle e suplementados com bST; HC =
animais em dietas elevadas e sem bST; HB = animais em dieta elevada e suplementados com bST
4erro padrão das médias dos tratamentos
53
Sequência1 Nome/Classificação Biológica GO variação2 Média dos tratamentos3 Valor P5
BvsC LC LB HC HB SE4 PbST Pdiet Pinter
• Crescimento Celular
NBFGC_BG688950 ubiquitin specific protease 4 (proto-oncogene) 2,31 0,680 1,571 1,194 2,716 0,545 0,031 0,673 0,757
NBFGC_BE480028 chromosome 10 open reading frame 6 1,88 1,065 1,967 1,532 2,446 0,362 0,021 0,204 0,987
NBFGC_BE485484 hepsin (transmembrane protease, serine 1) 1,58 -0,064 0,244 -0,475 0,544 0,528 0,011 0,830 0,122
NBFGC_BE810065 collagen, type XI, alpha 2 1,37 -2,425 -2,011 -2,523 -2,020 0,298 0,005 0,689 0,727
NBFGC_BE589677 transforming growth factor, beta receptor III (betaglycan,
300kDa) 1,33 -1,456 -0,988 -1,209 -0,858 0,307 0,020 0,302 0,695
NBFGC_AW336151 novel protein similar to SEL1L (sel-1 (suppressor of lin-
12, C.elegans)-like) 1,21 -0,944 -0,863 -1,091 -0,612 0,314 0,028 0,699 0,096
NBFGC_BE846147 annexin A2 1,20 2,274 2,550 2,428 2,681 0,294 0,035 0,253 0,915
NBFGC_BE684128 fer (fps/fes related) tyrosine kinase (phosphoprotein NCP94) 1,18 0,332 0,551 0,393 0,655 0,441 0,007 0,349 0,760
NBFGC_BG690462 putative translation initiation factor 1,15 -0,747 -0,534 -0,955 -0,767 0,292 0,050 0,067 0,894
NBFGC_AW426175 annexin VIII 1,13 -0,377 -0,362 -0,369 -0,030 0,123 0,046 0,072 0,063
• Proliferação Celular
NBFGC_BG690064 tumor protein D52-like 2 2,18 -0,206 0,581 -0,384 1,072 0,560 0,025 0,718 0,442
NBFGC_BG688237 hepatoma-derived growth factor (high-mobility group
protein 1-like) 1,20 2,263 2,348 2,294 2,747 0,222 0,049 0,122 0,154
NBFGC_AW660490 RAB26, member RAS oncogene family 1,18 -1,005 -0,756 -0,940 -0,719 0,167 0,043 0,676 0,893
NBFGC_BF073564 glutamyl aminopeptidase (aminopeptidase A) 1,15 0,219 0,340 0,048 0,333 0,174 0,049 0,415 0,386
NBFGC_BE479946 peroxiredoxin 1 1,11 1,532 1,579 1,393 1,658 0,237 0,025 0,683 0,093
NBFGC_BF606672 insulin-like growth factor binding protein, acid labile
subunit 1,27 -1,916 -1,745 -1,984 -1,466 0,374 0,021 0,496 0,193
NBFGC_BE755280 RAB37, member RAS oncogene family 1,10 1,237 1,371 1,382 1,519 0,227 0,030 0,048 0,977
1 Seqüência do gene na biblioteca NBFGC, a lista completa pode ser acessada em http://gowhite.ans.msu.edu/public_php/NBFGC_GeneLink.html
2 Variação entre os grupos B (animais suplementados com bST = HB+LB) e C (animais dos grupos controles para bST = HC+LC) , os valores de variação são
calculados com base nas médias dos tratamentos elevados ao exponencial 2
3 médias obtidas dos tratamentos LC = animais em dieta controle sem administração de bST; LB = animais em dieta controle e suplementados com bST; HC =
animais em dietas elevadas e sem bST; HB = animais em dieta elevada e suplementados com bST
4erro padrão das médias dos tratamentos
54
BvsC LC LB HC HB SE4 PbST Pdiet Pinter
• Apoptose Proliferação negativa
NBFGC_BE482798 growth arrest-specific 8 2,02 0,955 1,665 1,068 2,381 0,514 0,047 0,380 0,512
NBFGC_BG693382 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 41 1,80 1,840 2,459 1,714 2,789 0,355 0,020 0,753 0,469
1 Seqüência do gene na biblioteca NBFGC, a lista completa pode ser acessada em http://gowhite.ans.msu.edu/public_php/NBFGC_GeneLink.html
2 Variação entre os grupos B (animais suplementados com bST = HB+LB) e C (animais dos grupos controles para bST = HC+LC) , os valores de variação são
calculados com base nas médias dos tratamentos elevados ao exponencial 2
3 médias obtidas dos tratamentos LC = animais em dieta controle sem administração de bST; LB = animais em dieta controle e suplementados com bST; HC =
animais em dietas elevadas e sem bST; HB = animais em dieta elevada e suplementados com bST
4erro padrão das médias dos tratamentos
5 níveis de significância P para os efeitos principais de bST (Pbst), Dieta (Pdiet) e Interação entre os tratamentos (Pinter)
Tabela 05 Genes Anti-Proliferativos Inibidos pelo bST (P<0,05) de acordo com sua classificação biológica no GO (Gene Onthology http://www.godatabase.org/cgi-bin/amigo/go.cgi).
Sequência1 Nome/Classificação Biológica GO variação2 Média dos tratamentos3 Valor P5
BvsC LC LB HC HB SE4 PbST Pdiet Pinter
• Apoptose
NBFGC_AW654871 BRCA1 associated protein-1 (ubiquitin carboxy-terminal
hydrolase) -1,19 0,466 0,279 0,518 0,197 0,256 0,010 0,864 0,415
NBFGC_BE752216 caspase recruitment domain family, member 11 -1,28
-
0,659 -1,225 -0,758 -0,899 0,303 0,033 0,508 0,165
NBFGC_BE752722 inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-
cells, kinase gamma -1,30
-
1,645 -2,253 -1,831 -1,973 0,388 0,046 0,813 0,184
NBFGC_BF652935 interleukin 18 (interferon-gamma-inducing factor) -1,31 -
2,074 -2,535 -1,904 -2,219 0,384 0,034 0,224 0,648
NBFGC_BE756772 interleukin 2 receptor -1,36 1,200 - -1,442 -0,815 -1,463 0,415 0,022 0,321 0,239
NBFGC_BF654852 Bos taurus insulin-like growth factor binding protein-3
(IGFBP3) gene, complete cds -1,31
-
1,674 -2,113 -1,507 -1,850 0,217 0,005 0,118 0,670
1 Seqüência do gene na biblioteca NBFGC, a lista completa pode ser acessada em http://gowhite.ans.msu.edu/public_php/NBFGC_GeneLink.html
2 Variação entre os grupos B (animais suplementados com bST = HB+LB) e C (animais dos grupos controles para bST = HC+LC) , os valores de variação são
calculados com base nas médias dos tratamentos elevados ao exponencial 2
3 médias obtidas dos tratamentos LC = animais em dieta controle sem administração de bST; LB = animais em dieta controle e suplementados com bST; HC =
animais em dietas elevadas e sem bST; HB = animais em dieta elevada e suplementados com bST
4erro padrão das médias dos tratamentos
55
BvsC LC LB HC HB SE4 PbST Pdiet Pinter
• Adesão Celular
NBFGC_BE683087 RIKEN -1,10 0,937 0,815 0,933 0,771 0,179 0,030 0,729 0,723
NBFGC_BE808135 integrin, alpha 7 -1,14 0,909 0,785 0,925 0,661 0,173 0,039 0,545 0,408
NBFGC_AW660248 immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat -1,21 -
0,549 -0,919 -0,901 -1,078 0,372 0,046 0,099 0,436
NBFGC_AW307628 fibulin 5 -1,27 0,411 - -0,536 -0,467 -1,038 0,184 0,050 0,118 0,180
• Ciclo Celular
NBFGC_BE476311 baculoviral IAP repeat-containing 6 (apollon) -1,17 0,416 0,258 0,442 0,151 0,313 0,039 0,724 0,493
NBFGC_BE845840 platelet-activating factor acetylhydrolase, isoform Ib, alpha
subunit 45kDa -1,18 - 1,323 -1,395 -1,153 -1,548 0,109 0,017 0,929 0,076 • Crescimento Celular NBFGC_BG691581 vav 1 oncogene -1,08 0,216 0,114 0,255 0,123 0,205 0,031 0,673 0,757 NBFGC_AW429437 heparanase -1,14 - 1,805 -2,150 -1,735 -1,761 0,247 0,041 0,028 0,071 • Proliferação Celular NBFGC_BF601615 THO complex 2 -1,14 - 0,631 -0,962 -0,663 -0,705 0,418 0,011 0,117 0,037
NBFGC_BF230787 RAN, member RAS oncogene family -1,17 0,030 - -0,278 0,179 -0,032 0,339 0,028 0,062 0,835
NBFGC_BF652964 tetraspan 2 -1,35
-
1,572 -2,134 -1,620 -1,921 0,216 0,014 0,629 0,384
1 Seqüência do gene na biblioteca NBFGC, a lista completa pode ser acessada em http://gowhite.ans.msu.edu/public_php/NBFGC_GeneLink.html
2 Variação entre os grupos B (animais suplementados com bST = HB+LB) e C (animais dos grupos controles para bST = HC+LC) , os valores de variação são
calculados com base nas médias dos tratamentos elevados ao exponencial 2
3 médias obtidas dos tratamentos LC = animais em dieta controle sem administração de bST; LB = animais em dieta controle e suplementados com bST; HC =
animais em dietas elevadas e sem bST; HB = animais em dieta elevada e suplementados com bST
4erro padrão das médias dos tratamentos
56
HvsL LC LB HC HB SE4 PbST Pdiet Pinter
• Adesão Celular
NBFGC_AW669921 carbohydrate sulfotransferase 1,41 -2,504 -2,672 -1,871 -2,315 0,198 0,069 0,018 0,376
NBFGC_AW484319 myeloid/lymphoid 1,23 -2,178 -2,205 -1,978 -1,807 0,219 0,436 0,020 0,292
• Ciclo Celular
NBFGC_AW345640 deoxythymidylate kinase 1,18 -1,038 -0,998 -0,895 -0,653 0,294 0,132 0,019 0,265
NBFGC_BE753819
latent transforming growth factor beta binding protein 2
(LTBP2) 1,12 -0,233 -0,078 -0,023 0,036 0,122 0,096 0,044 0,425
NBFGC_BE683116 fibroblast growth factor receptor 2 1,11 0,771 0,913 1,079 0,909 0,280 0,781 0,020 0,010
• Crescimento Celular
NBFGC_BF889524 interferon regulatory factor 1 1,36 -1,451 -1,515 -0,966 -1,107 0,220 0,532 0,036 0,812
NBFGC_BE590166 5’-3’ exoribonuclease 2 1,31 -2,128 -2,026 -1,529 -1,836 0,359 0,476 0,023 0,170
NBFGC_BG692794 colon cancer, nonpolyposis type 2 (MLH1) 1,22 -0,260 -0,166 -0,026 0,169 0,189 0,082 0,010 0,510
NBFGC_AW429437 heparanase 1,17 -1,805 -2,150 -1,735 -1,761 0,247 0,041 0,028 0,071
NBFGC_BF776829 insulin-like growth factor 2 receptor 1,17 -0,056 0,008 0,179 0,224 0,145 0,372 0,011 0,872
• Proliferação Celular
NBFGC_BE751204 misshapen/NIK-related kinkinase (MINK) 1,31 -1,883 -2,087 -1,660 -1,520 0,257 0,781 0,017 0,162
NBFGC_BE484656 tumor protein D52-like 2 1,20 1,595 1,758 2,002 1,881 0,282 0,839 0,038 0,189
NBFGC_AW654906 integrin, beta 2 (antigen CD18 (p95) 1,19 -1,162 -1,152 -0,880 -0,921 0,197 0,813 0,008 0,693
NBFGC_BF074683 acetylcholinesterase 1,13 0,096 0,002 0,265 0,182 0,244 0,245 0,043 0,944
• Apoptose / Proliferação Negativa
NBFGC_BF654346 myeloid membrane glycoprotein precursor (CD14) 1,22 -0,424 -0,306 0,004 -0,152 0,133 0,850 0,028 0,187
NBFGC_AW484298 leucine-rich repeat LGI3 1,13 -0,039 -0,054 0,137 0,115 0,320 0,688 0,012 0,937
1 Seqüência do gene na biblioteca NBFGC, a lista completa pode ser acessada em http://gowhite.ans.msu.edu/public_php/NBFGC_GeneLink.html
2 Variação entre os grupos H (animais alimentados com dieta elevada = HC+HB) e L (animais alimentados com dieta moderada = LC+LB) , os valores de variação
são calculados com base nas médias dos tratamentos elevados ao exponencial 2
3 médias obtidas dos tratamentos LC = animais em dieta controle sem administração de bST; LB = animais em dieta controle e suplementados com bST; HC =
animais em dietas elevadas e sem bST; HB = animais em dieta elevada e suplementados com bST
4erro padrão das médias dos tratamentos
57
Sequência1 Nome/Classificação Biológica GO variação2 Média dos tratamentos3 Valor P5
HvsL LC LB HC HB SE PbST Pdiet Pinter
• Adesão Celular
NBFGC_AW659967 discoidin domain receptor -1,21 -0,361 -0,457 -0,562 -0,806 0,216 0,120 0,033 0,471
NBFGC_AW357603 collagen, type IV, alpha -1,24 -1,755 -1,588 -1,953 -2,017 0,291 0,634 0,036 0,299
NBFGC_BF076192 carcinoembryonic antigen-related cell adhesion
molecule 1 (biliary glycoprotein) (CEACAM1) -1,26 -0,421 -0,550 -0,708 -0,931 0,194 0,215 0,041 0,728 • Ciclo Celular
NBFGC_AW658462 regulator of G-protein signaling 2 -1,29 0,058 0,082 -0,244 -0,353 0,268 0,710 0,022 0,566
Crescimento Celular
NBFGC_BF602183 platelet-derived growth factor beta polypeptide (simian
sarcoma viral (v-sis) oncogene homolog) (PDGFB) -1,10 3,200 3,179 3,113 2,996 0,216 0,245 0,042 0,408
NBFGC_AW660002 tropomyosin 3 -1,11 -0,053 -0,148 -0,198 -0,299 0,197 0,088 0,042 0,948
NBFGC_BF193944 sushi-repeat protein (SRPUL) -1,34 -1,191 -1,250 -1,612 -1,672 0,139 0,394 0,001 0,996
• Proliferação Celular
NBFGC_AW654771 heparin binding protein-44 [mice, mRNA, 1478 nt] -1,09 0,035 0,026 -0,074 -0,105 0,184 0,596 0,024 0,767
NBFGC_BG690060 ferritin, heavy polypeptide 1 -1,26 -0,534 -0,285 -0,803 -0,678 0,226 0,162 0,045 0,627
• Motilidade Celular
NBFGC_BE757172 autocrine motility factor -1,22 -1,489 -1,502 -1,862 -1,713 0,348 0,495 0,026 0,422
1 Seqüência do gene na biblioteca NBFGC, a lista completa pode ser acessada em http://gowhite.ans.msu.edu/public_php/NBFGC_GeneLink.html
2 Variação entre os grupos H (animais alimentados com dieta elevada = HC+HB) e L (animais alimentados com dieta moderada = LC+LB) , os valores de variação
são calculados com base nas médias dos tratamentos elevados ao exponencial 2
3 médias obtidas dos tratamentos LC = animais em dieta controle sem administração de bST; LB = animais em dieta controle e suplementados com bST; HC =
animais em dietas elevadas e sem bST; HB = animais em dieta elevada e suplementados com bST
4erro padrão das médias dos tratamentos
Os Efeitos do bST em Genes Relacionados ao Desenvolvimento Parenquimal. No presente trabalho foram identificados diversos genes proliferativos e anti- proliferativos alterados pelo bST (Tabelas 03, 04, 05 e 06), sendo que alguns deles foram anteriormente relacionados a mecanismos envolvidos no estímulo do crescimento mamário em amimais suplementados com bST, como no caso do IGFBP3 (WEBER et al., 2000; BERRY et al., 2001) no entanto, a maior parte dos genes alterados não foram relatados anteriormente como genes relacionados aos mecanismos que levam o bST a induzir o desenvolvimento parenquimal, provendo assim um melhor esclarecimento desses ciclos. RADCLIFF et al. (1997) relataram que administração de bST aumentou o peso do parênquima e conteúdo de DNA em 47 % quando comparado a animais controles, sem administração de bST. Era portanto de se esperar que a administração de bST exercesse um efeito positivo sobre os genes proliferativos no parênquima mamário.
No presente estudo a concentração de IGF-1 sérica foi aumentada pela administração de bST (reportado previamente, RADCLIFF et al., 2004), já a expressão gênica de IGF-1 no parênquima não foi alterada enquanto que o mRNA para IGFBP3 foi significantemente reduzido pela administração de bST (P<0,01). Esses resultados reforçam os resultados de trabalhos anteriores aonde a administração de bST diminuiu a quantidade de mRNA para IGFBP3 no parênquima mamário (BERRY et al., 2001, WEBER et al., 1999) e não alterou a expressão gênica de IGF-1 no parênquima (BERRY et al., 2001), sugerindo que o IGF-1 seja sintetizado em outros sítios que não o parênquima mamário e capturado para dentro do parênquima atuando assim na proliferação celular. A inibição do mRNA para IGFBP3 no parênquima possivelmente provocaria uma redução na produção local dessa proteína e uma vez que ela foi negativamente relacionada à proliferação celular (HUYNH et al., 1996) há possibilidade que essa diminuição leve a um aumento no número de células epiteliais através de um efeito indireto, devido à diminuição da quantidade de IGF-1 ligada ao IGFBP3 com conseqüente aumento da quantidade de IGF-1 disponível aos seus receptores nas células epiteliais. Além disso, há que se levar em consideração a possibilidade de um
efeito direto e independente de IGF-1 da redução de IGFBP3 no aumento do número de células uma vez que a adição dessa proteína bloqueou os efeitos mitogênicos de extratos mamário na proliferação celular (AKERS et al., 2000).
No presente trabalho, o bST alterou a expressão de 9 genes relacionados a adesão celular tendo aumentado em 100% a expressão de Į-catenina (P<0,02). O tipo epitelial de aderência de junção que garante a integridade da glândula mamária é composto do complexo E-Cadherina/Catenina. A expressão de Į-catenina foi demonstrada em todos os estágios de desenvolvimento da glândula mamária e a biogênese da função mamária depende da presença dessa molécula (NEMADE et al, 2004). A Į-catenina exerce importante função no desenvolvimento normal da glândula mamária, tendo sido estabelecida sua participação na adesão celular, polarização e estabilização do tecido durante esse processo (NAMBA et al., 2001). Além disso, NEMADE et al (2004) demonstraram a partir de análise de apoptose em glândula mamária que as células nas quais Į-catenina foi condicionalmente inativada apresentaram-se em processo de morte celular programada. Uma razão para o aumento da Į-catenina pode ser o envolvimento dessa molécula no processo de indução de migração celular pelo IGF-1 (ANDRÉ et al., 2004). Alfa-catenina pode ainda estar envolvida diretamente com o ciclo bioquímico do IGF-1 uma vez que a ausência dessa molécula alterou a resposta de queratinócitos a diversos fatores de crescimento (VASIOUKHIN et al., 2001).
O estímulo causado pela administração de bST na expressão de mRNA de Į- catenina coincidiu com aumento na expressão da molécula de adesão de células plaquetárias endoteliais (“platelet-endothelial cell-adhesion molecule – PECAM-1”) (P<0,05), uma glicoproteína pertencente a superfamília de moléculas de adesão celular de imunoglobulinas. A PECAM-1 foi expressa exclusivamente nas células endoteliais, plaquetas e células específicas do sistema imune (ILAN & MADRI, 2003). Ausência de expressão gênica para PECAM-1 em ratas transgênicas virgens levou a um dano na morfogênese das ramificações dos dutos mamários e causou diminuição na proliferação celular epitelial nos ductos mamários (ILAN et al., 2001). Evidências sugeriram que os efeitos do PECAM-1 no desenvolvimento mamário estivessem relacionados ao seu
envolvimento com moléculas do sistema “STAT” e complexo catenina (ILAN et al., 2001). Além disso, a PECAM-1 promoveu acúmulo de ȕ-catenina e estimulou a proliferação celular (BISWAS et al., 2003). O estímulo causado pela administração de bST na expressão gênica tanto de PECAM-1 como de Į-catenina, podem levar a especulação do envolvimento da somatotropina em um novo ciclo bioquímico relacionado a proliferação celular. Esse envolvimento pode ser indireto, através da interação com outros fatores de crescimento, ou mesmo direto uma vez que, sendo a PECAM-1 expressa nas células do sistema vascular, a somatotropina exógena pode estimular a expressão de PECAM-1 em células endoteliais sistêmicas. A molécula já estimulada pode então atingir órgãos-alvo, como a glândula mamária através do sistema vascular mamário estimulando a proliferação celular através de um aumento nas moléculas do complexo catenina. Apesar de ser uma suposição interessante, a mesma deve ser cuidadosamente checada e outros experimentos conduzidos no sentido de avaliar o envolvimento da somatotropina nesse ciclo.
Outra molécula interessante estimulada pela administração de bST foi a serina- protease hepsina – SPH (P<0,02). A expressão de SPH em vários tecidos sugeriu que esta protease estivesse envolvida em processos biológicos essenciais em diferentes células. A presença de proteases foi demonstrada durante a migração celular e rearranjamento de tecidos na morfogênese, nesses processos elas criaram espaços para migração celular e promoveram extensão através da matriz extracelular (SAKSELA & RIFKIN, 1988). TORRES-ROSADO et al. (1993) sugeriram que a SPH foi indispensável para o crescimento celular e manutenção da morfologia celular normal. No presente trabalho a administração de bST levou a um aumento no mRNA da SPH sugerindo um envolvimento da mesma no estímulo da proliferação celular causado pela somatotropina exógena, que coincidiu com diminuição na expressão de IGFBP3. Outras proteases como antígeno-específico de próstata (“prostate specific-antigen – PSA”), foram implicadas em ciclos bioquímicos do IGF-1, através da quebra do IGFBP3, diminuindo sua afinidade por IGF-1, o que permitiu ao IGF-1 ligar-se ao seu receptor de membrana em células epiteliais de hiperplasias benignas de próstata (COHEN et al., 1992). Mais recentemente, SUTKOWSKI et al., (1999) encontraram que os efeitos
inibitórios do IGFBP3 in vitro, em células estromáticas derivadas de hiperplasias benignas de próstata, foram atenuados pelas proteases PSA e Į-quimiotripsina e que as proteases sozinhas estimularam em 17% o crescimento dessas células.
Uma resposta proliferativa alternativa poderia resultar da ligação das proteases aos seus receptores específicos na superfície das células (VU et al., 1991). As proteases poderiam também atuar como fatores de crescimento autócrino nas células epiteliais responsivas circulantes, uma vez que a adição de proteases como PSA à cultura de células epiteliais normais e neoplásicas de próstata, estimulou o crescimento e desenvolvimento das mesmas tanto direta como indiretamente (COHEN et al., 1992). O estímulo da expressão SPH pela injeção de bST aponta para uma nova molécula envolvida no estímulo do bST no desenvolvimento do parênquima mamário.
Além das moléculas citadas anteriormente, a administração de bST estimulou a expressão de diversos genes envolvidos na proliferação celular como tumor protein D52, “hepatoma-derived growth factor”, dois diferentes tipo de colágenos envolvidos em adesão celular, genes envolvidos em diversos ciclos celulares como cyclin D1, cyclin G1 entre outros e inibiu a expressão de alguns genes relacionados à apoptose celular como interleucina 18 e receptor de interleucina 2 (Tabelas 03a e 3b, 04, 05 e 06).
Os Efeitos da Dieta em Genes Relacionados ao Desenvolvimento Parenquimal. Níveis protéicos e energéticos elevados alteraram a expressão de menos de 6%