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A marcação do cRNA com Cy3 e Cy5 para as hibridizações no chip de oligos customizados (Lembke et al. 2012) foi realizada com Agilent Low RNA Input Fluorescent

Linear Amplification kit (Agilent Technologies), seguindo-se as instruções do fabricante,

partindo de 200 ng de RNA total. Para as reações de amplificação e marcação do cRNA, foi utilizado um controle spike de mRNA sintetizado in vitro (Agilent RNA Spike-In kit). As hibridizações foram conduzidas com duas réplicas biológicas no chip de oligos customizados 44k (Agilent Technologies). Após as hibridizações, os chips foram lavados de acordo com o protocolo de hibridização desenvolvido pelo fabricante, escaneadas no GenePix 4000B

scanner (Molecular Devices) e os dados das imagens extraídos com auxílio do programa Feature Extraction 9.5.3 (Agilent Technologies) utilizando o referencial para microarranjo de

duas cores da plataforma Agilent (Kerr 2007). Os dados da intensidade derivada de Cy3 e Cy5 de uma mesma amostra foram corrigidos e normalizados utilizando-se a função Lowess (Yang et al. 2002) através de uma ferramenta do ambiente R do nosso servidor e levando-se em consideração os sinais dos controles spikes. Os genes diferencialmente expressos foram definidos através do método do HT-self (Vencio & Koide 2005), modificado de (Rocha et al. 2007) e adaptado à plataforma do microarranjo de oligonucleotídeos Agilent e ao Feature

Extraction.

3.12. PCR em tempo real

A síntese de cDNA foi realizada a partir de 1 µg de RNA total utilizando o SuperScript

fabricante. Para as validações do nível de expressão de genes identificados como tendo transcritos nas orientações senso e antissenso, a síntese de cDNA foi realizada de forma fita específica, utilizando o mesmo kit citado acima. Para síntese da fita de cDNA do transcrito senso, foi utilizado 2 µM do primer com sequência antissenso e o primer senso para o transcrito antissenso, como descrito por Lembke et al (2012). As reações de PCR em tempo real (qPCR) foram realizadas com o Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) no equipamento 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) de acordo com protocolo padrão. Todos os primers foram desenhados com auxílio do programa Primer

Express 2.0 (Applied Biosystems) e analisados quanto a eficiência de amplificação, sendo que

apenas os primers com eficiência entre 90 e 110% foram utilizados. A especificidade da reação foi verificada pela curva de dissociação dos produtos de amplificação gerada pelo equipamento. Os resultados foram analisados como descrito por Hellemans et al (2007) com auxílio do programa qBase 2.0 (Biogazelle) utilizando como fator de normalização a média geométrica de, no mínimo, dois genes endógenos mais estáveis. Os genes actina (ACT, SCCCLR1069D05.g), subunidade delta da ATP sintase mitocondrial (SCCCLR1072A03.g), subunidade 60S do ribossomo (60S, SCJFRZ2009G01.g), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH, (Iskandar et al. 2004)), tubulina (TUB, SCCCRZ1002H03.g), enzima E2 de ubiquitinação (UBE2, SCBGLR1002D06.g), poliubiquitina (PUB, SCCCST2001G02.g) e ubiquitina (UB, SCCCLR1048F12.g) foram testados para identificação de genes normalizadores endógenos com expressão homogênea entre as amostras. Para maior acurácia dos dados, em cada análise foram selecionados os genes endógenos mais apropriados, identificados pelo programa geNorm (que compõe o programa qBase), tendo, portanto, um fator de normalização diferente para cada caso específico. Para as validações de dados de microarranjo (plantas com 9 meses, coleta julho de 2011), as reações de qPCR

foram realizadas numa terceira réplica biológica. Já para as análises de expressão apenas por qPCR (plantas com 7 meses, coleta março 2012) foi utilizada três réplicas biológicas e, após a normalização no programa qBase, seguiu-se a normalização para réplicas biológicas para cada gene alvo em cada tecido, utilizando a média das amostras (mean centering) como descrito por Willems et al (2008). Devido a isso, o nível de expressão de genes diferentes não pode ser comparado.

3.13. Clusterização dos dados de expressão

Foram utilizados os valores de log2 da intensidade do sinal de microarranjo para as análises de clusterização hierárquica. Todas as análises foram geradas pelo programa MEV (Multi Experiment Viewer, versão 4.8.1). Primeiramente, foi definido o número ideal de

clusters com auxílio da ferramenta Figure of Merit com configurações default. O gráfico

gerado indica o número ideal de clusters pela identificação do ponto onde a inclinação da reta se aproxima de zero. Em seguida, os clusters foram gerados com a ferramenta k-means, com configuração default, com exceção da opção do número de clusters, definido pela

Figure of Merit. Posteriormente, os sinais de intensidade de cada gene para os quatro

genótipos foram normalizados com a opção normalize gene/row.

3.14. Redes de coexpressão de genes

Das diversas ferramentas disponíveis para esse tipo de análise, nenhuma utiliza dados de expressão de cana-de-açúcar ou permite ao usuário utilizar seu próprio conjunto de dados. Assim, foi escolhida a ferramenta Genevestigator (Hruz et al. 2008) utilizando dados de expressão de milho (Zea mays), por ser a espécie mais próxima de cana-de-açúcar

com esse tipo de ferramenta disponível. A primeira etapa para essa análise foi a identificação do homólogo de milho do SAS de interesse, SCCCCL3002A03.b (4- coumarato:CoA ligase, 4CL).à Co à aà fe a e taà Search gene VS Homologs à dispo í elà e à sucest-fun.org/wsapp, que utiliza o programa Inparanoid (Ostlund et al. 2010) para identificar homologia entre sequências, foi identificado o transcrito de milho GRMZM2G075333, o qual foi utilizado o oà is a à pa aà us a à osà ge esà coexpressos na base de dados de milho. O Genevestigator utiliza dados públicos de expressão de 562 experimentos realizados no chip Maize Genome 15K da plataforma Affymetrix e calcula a correlação de Pearson entre os valores de sinal de expressão de cada par de genes. Todos os experimentos presentes no banco de dados do Genevestigator foram curados e normalizados para permitir a realização de uma metanálise com diversos experimentos. Para a escolha da base de dados a ser utilizada, foi selecionada a opção Anatomy do

Genevestigator, que analisa todos os genes que apresentam sinal de expressão,

identificando, para cada par de genes, quais possuem um mesmo perfil de expressão em cada tecido da planta. Essa opção exclui experimentos de resposta a estresses e de plantas mutantes e transgênicas. Quanto mais semelhante for o perfil de expressão de dois genes nos diferentes tecidos, maior será a correlação entre eles, o que os credencia a estarem envolvidos num mesmo processo biológico. Assim, essa análise identificará todos os genes cuja expressão varia de forma semelhante em vários tecidos, calculando uma correlação de Pearson para o sinal de expressão de cada par de genes. Em nossa análise, após a geração da rede de genes, foram considerados apenas os genes que possuem correlação de Pearson, e à elaç oà à is a àGRMZM2G075333 e mútua entre todos os genes da lista, acima de 0,8.

3.15. Identificação da região promotora e cis-elementos regulatórios associados