Çanakkale Cephesi

Por se tratar de uma estrutura que é a fonte principal de biomassa, o completo entendimento das redes moleculares envolvidas na montagem e remodelamento da parede celular é crucial para a conversão eficiente da biomassa em biocombustíveis (Carpita & McCann 2008). Com isso, o perfil de expressão dos genes de parede celular de várias espécies, tanto comerciais quanto plantas modelo, é comumente alvo de estudo visando à identificação de genes e vias que possam ajudar a avançar no conhecimento dessa área. Mesmo com inúmeros estudos já conduzidos, estima-se que existam por volta de 1.000 genes com função ainda desconhecida que exerçam algum papel no metabolismo de parede celular (Yong et al. 2005) o que indica a necessidade de continuar e expandir tais estudos, incluindo o transcriptoma, para identificar esses genes ainda não caracterizados.

Apesar do sequenciamento completo do genoma de Arabidopsis thaliana ter ajudado a identificar vários genes envolvidos no metabolismo de parede celular, incluindo os respectivos homólogos em outras espécies como gramíneas e espécies madeireiras, a utilização de gramíneas como fonte de biomassa para biocombustíveis requer a elucidação

das funções de seus genes específicos a fim de seà o te à o t ole à daà ualidadeà eà quantidade de biomassa produzida (Carpita & McCann 2008). Assim, para gramíneas como milho e arroz que já possuem mais recursos biotecnológicos (principalmente a disponibilidade de um genoma referência), já foi possível identificar diversos membros de famílias gênicas associadas à parede celular, como genes da via de lignina, glicosiltransferases e hidrolases, expansinas, entre outras, incluindo genes específicos de gramíneas como as CslF (Penning et al. 2009; Wang et al. 2010). Recentemente, Sekhon e colaboradores (Sekhon et al. 2011) relataram uma análise global do transcriptoma de milho utilizando microarranjos de oligonucleotídeos para estudar a expressão gênica em 60 tecidos diferentes e constataram que tecidos biologicamente relacionados possuem perfis de expressão similares. A análise de genes da via de biossíntese de lignina mostrou que sua expressão varia com a idade e a relação entre os tecidos. Por exemplo, partes aéreas apresentam padrão bem distinto de raiz; entrenós mais jovens também apresentam padrão diferente de entrenós mais velhos (Sekhon et al. 2011). No mesmo ano, outro grupo reportou a análise de expressão por microarranjo em entrenós de milho em fases de elongação e não-elongação (Bosch et al. 2011), numa tentativa mais direcionada de identificar os principais genes de biossíntese de parede celular envolvidos na maturação do colmo. Os autores conseguiram identificar novos genes candidatos à biossíntese de parede celular primária e secundária, uma vez que apresentavam padrão de expressão bem distinto em tecidos com deposição desses dois tipos de parede celular (Bosch et al. 2011). Dentre esses, vários fatores de transcrição, das famílias NAC, MYB, AP2-EREB, WRKY, Platz, bLHL, entre outros, demonstraram perfil de expressão que os tornam candidatos à reguladores da biogênese de parede celular. Entretanto, dos 10 fatores NAC e 5 MYB, apenas um MYB é homologo de algum gene de Arabidopsis, AtMYB85, já caracterizado como regulador desse

processo (Bosch et al. 2011). Em estudos de RNAseq em diferentes zonas da folha de milho, foi demonstrado que expressão gênica da base da folha, região onde a elongação está mais ativa e ocorre e a transição de dreno para fonte, está enriquecida em genes de metabolismo de parede celular, podendo-se destacar vários fatores de transcrição das famílias NAC e MYB, homólogos de AtSND1, AtSND2, AtKNAT7, AtMYB85, AtMYB46, entre outros (Li et al. 2010).

Diferentemente de milho e Arabidopsis, poucos estudos voltados para a expressão de genes do metabolismo de parede celular em cana-de-açúcar foram conduzidos. Existem vários estudos de transcriptoma de cana-de-açúcar que identificaram expressão diferencial de genes do metabolismo de parede celular em, por exemplo, plantas submetidas à seca (Lembke et al. 2012) e em variedades contrastantes para teor de sacarose (Papini-Terzi et al. 2009), onde genes como expansinas e xiloglucano transglicosilase/hidrolase (XTH) foram identificados e sugerido uma possível correlação da expressão desses genes com o teor de sacarose. Por outro lado, até onde vai nosso conhecimento, existem pouquíssimos estudos cujo objetivo é estudar o perfil de expressão de genes de parede celular de cana-de-açúcar. Em um dos primeiros trabalhos (se não o primeiro) abordando a expressão de genes em diferentes tecidos em uma escala relativamente alta, Lima e colaboradores (Lima et al. 2001) utilizaram BlastX e 25 palavras-chave (celulose sintase, expansina, xilanase, entre outras) para identificar 3.283 clones do SUCEST relacionados ao metabolismo de parede celular, posteriormente agrupados em 459 genes possíveis. A partir do número de clones por gene, os autores estimaram o nível de expressão em diferentes tecidos e conseguiram identificar que as celulose sintases são mais expressas em folha e raiz e concluíram que o perfil de expressão encontrado refletiu bem as características fisiológicas esperadas para cada tecido (Lima et al. 2001). Anos depois, análises de oligoarranjos de três diferentes partes do colmo

permitiu identificar 119 genes diferencialmente expressos de diversas categorias, incluindo parede celular (Casu et al. 2007). Em uma segunda abordagem, os mesmos autores identificaram 17 sondas anotadas como membros das famílias CesA e Csl e estas podiam ser divididas em 5 clusters de acordo com sua expressão nos diferentes entrenós, mostrando que essas famílias são diferencialmente reguladas no colmo (Casu et al. 2007). Em seguida, utilizando-se critérios bem estringentes (correlação >0,95), foram buscados genes que apresentassem o mesmo perfil de um dos 5 clusters das celulose sintases e 45 genes foram identificados, os quais são todos de metabolismo de parede celular, como expansinas, CAD, glucanases, etc, mostrando que, de fato, diferentes genes do metabolismo de parede celular possuem padrão de expressão correlacionado. Entretanto, os autores não conseguiram identificar um padrão característico de expressão das CesA em tecidos sob deposição de parede primária e secundária, não sendo possível determinar CesA específicas de parede primária ou secundária (Casu et al. 2007).

2. OBJETIVOS

Espécies ancestrais de cana-de-açúcar possuem fenótipos bem distintos e podem ser fontes de características agronômicas de interesse como perfilhamento, teor de fibra e resistência a estresses de S. robustum e, principalmente, S. spontaneum e teor de sacarose de S. officinarum. A introgressão destes genótipos nos programas de melhoramento já é realizada, mas pouco se sabe sobre a biologia molecular e transcriptoma destas espécies. Visto o grande interesse no uso de cana-de-açúcar como fonte de biomassa para produção de bioenergia, o presente trabalho utilizou-se de diferentes abordagens para caracterizar alguns parâmetros agronômicos e fisiológicos de interesse e analisar o perfil de expressão gênica de espécies ancestrais de cana-de-açúcar com enfoque nos genes de metabolismo de parede celular para a identificação de genes, vias metabólicas e redes regulatórias que possam ter envolvimento nas respostas fisiológicas analisadas e que possam ser relevantes para o entendimento da biologia molecular e o melhoramento genético da cana-de-açúcar e da cana energia.

Esse trabalho tem por objetivo caracterizar alguns parâmetros fisiológicos de interesse de genótipos ancestrais e um híbrido comercial de cana-de-açúcar e também analisar o transcriptoma dessas plantas, correlacionando-os aos parâmetros fisiológicos caracterizados para identificar as vias metabólicas e os genes que possam estar relacionados às diferenças fenotípicas apresentadas, principalmente em relação à biossíntese de parede celular secundária, acúmulo de biomassa e sacarose, bem como outras características agrotecnológicas de interesse como produtividade, fotossíntese e resistência a estresses.

Fazem parte deste trabalho os seguintes objetivos específicos:

Identificação dos genes de cana-de-açúcar do catálogo SUCEST que sejam homólogos aos genes de outras espécies já caracterizados como envolvidos metabolismo de parede celular;

Caracterização de parâmetros fisiológicos e morfológicos de três espécies ancestrais (S. officinarum, S. robustum e S. spontaneum) e um híbrido comercial (RB867515) para identificar os principais fenótipos contrastantes que possam ser relevantes para produção de sacarose e biomassa;

Análise do perfil de expressão gênica desses genótipos via microarranjo de oligonucleotídeos e PCR em tempo real, com enfoque em genes de metabolismo de parede celular, correlacionando com os fenótipos de interesse; Identificação de genes com potencial para o melhoramento genético;

Identificação de sequências promotoras de genes relacionados ao metabolismo de parede celular;

Construção de uma biblioteca de cDNA full length de S. officinarum, S.

spontaneum e da variedade comercial SP803280 e análise de expressão em

3. METODOLOGIA

3.1. Construção de um catálogo de genes relacionados a parede celular em cana de