TFH membran üzerine insan serum albuminin immobilizasyonu çalışma sonuçları

Destek materyallerin yüzeylerindeki epoksi, amin ve tiyol grupları oksijen ve aminin elektron verici karakteri yüzünden protein immoblizasyonu için etkili fonksiyonel gruplardır (Maltas ve ark., 2013; Maltas ve Ertekin, 2015). İmmobilizasyon mekanizması hidrofobik etkileşimler, Van der Waals etkileşimleri ve hidrojen bağı gibi non-kovalent ya da kovalent olabilmektedir. Kovalent bağ aracılığıyla herhangi bir modifikasyon yapılmaksızın matriks üzerinde reaktif epoksi gruplarının katılımının protein immobilizasyonunda etkin olduğu daha önce yapılan çalışmalarla teyid edilmiştir (Maltas ve ark, 2012; Bayramoğlu ve ark., 2003). Epoksi grubu nötral ve bazik koşullarda proteinlerin amin gruplarıyla birleşerek kovalent bağ yapmaktadır (Bayramoğlu ve ark., 2002). Şekil 4.24'de PVA/P(HEMA-GMA) filmler üzerine protein immobilizasyonu mekanizması verilmiştir. Bu çalışmada protein bağlanması üzerine fonksiyonel grupların etkisi incelenmiştir.

Bölüm 3.6.4’de anlatılan işlem uygulandıktan sonra analizler spektroflorometre cihazı kullanılarak yapılmıştır. HSA proteinin yapısında bulunan fluoresans özelliğe sahip aminoasitlerden dolayı protein 280 nm’de uyarıldığında, 342 nm’de eksitasyonu görülmektedir. Şekil 4.25’ de HSA proteinine ait floresans şiddetinin konsantrasyona bağlı değişimini gösteren grafik görülmektedir.

Şekil 4.25. 0.001-0.02 µg mL-1 konsantrasyon aralığında HSA’in floresans spektrumu

Şekil 4.26'da protein konsantrasyonuna karşı fluoresans şiddetinin değişmesiyle HSA proteini için kalibrasyon grafiği verilmiştir. Bağlanan HSA miktarının hesaplanabilmesi için çözeltide bağlanmadan kalan HSA proteininin fluoresans şiddetini ölçmek suretiyle hesaplamalar yapılmıştır.

Farklı kompozisyonlara sahip tüm P(HEMA-GMA) kopolimer ve homopolimer filmler ile kaplı çapraz bağlı PVA tabakalar üzerine HSA'ın bağlanma miktarını belirlemek için yüzey alanı 0.5654 cm2 olacak şekilde kesilen yüzeyler üzerine 0.1 mg/mL HSA içeren 1000 µL çözelti ilave edilip 2 saat karıştırıldıktan sonra spektroflorometre ile bağlanan HSA miktarları Çizelge 4.8’ de verildiği gibi hesaplanmıştır.

Şekil 4.27. 280 ve 342 emisyon dalga boylarında (PVA/P(HEMA-GMA) TFH membran yüzeyine bağlandıktan

sonra elde edilen HSA’in floresans spektrumu

Çizelge 4.8 ve Şekil 4.27’de elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde yüzeydeki epoksi grup miktarı arttıkça yüzeye bağlanan protein miktarının arttığı gözlemlenmiştir. Bu gözlem daha önce Bayramoğlu ve ark. (2002) tarafından yapılan çalışma ile uyum içerisindedir.

Çapraz bağlı PVA tabakalar üzerinde biriktirilen kopolimer filmlerin kalınlıklarının (0.1-0.5 µm) protein taşımasına olan etkisini incelemek için yapılan çalışma sonucu elde edilen veriler farklı kopolimer film kalınlıklarına sahip yüzeylere HSA bağlanma miktarlarında (223, 215, 221 µg cm-2) önemli ölçüde bir farklılık olmadığını göstermiştir (Çizelge 4.8).

PVA/PHEMA (198 µg cm-2) ve PVA (208 µg cm-2) tabakalarına bağlanan protein miktarı arasında önemli ölçüde farklılık olmaması HEMA ve PVA'ün benzer fonksiyonel gruplara sahip olmalarına bağlanmıştır. Ancak PVA/PGMA'ın protein bağlama kapasitesinin (219 µg cm-2) her ikisinden de daha etkili olması yüzeydeki epoksi fonksiyonelliği katılımına bağlanmıştır. PVA/PGMA ve PVA/P(HEMA-GMA) tabakaların protein immobilizasyon miktarları birbirine çok yakın bulunmuştur (Çizelge 4.8). Bu sonuç aynı fonksiyonel gruplara

sahip yüzeylerin kopolimerin fonksiyonel grupları ile protein arasındaki kompleks oluşumunun stokiyometrik oranı yüzünden polimer oranının artması ile bağlanma kapasitesinin artmayacağını göstermiştir. Bu durum protein afinitesinin polimer filmi oluşturan molekül yapılarından ziyade polimer yüzeyi üzerindeki fonksiyonel kısımların değişimine dayandığının bir göstergesidir.

Çizelge 4.8'de temas açısı değerleri incelendiğinde kopolimer film kaplı PVA tabakaların temas açısı değerleri 24°-34° aralığında bulunmuş olup bu değerler PVA/PGMA (45°) ve PVA (81°) yüzeyleri için gözlemlenen temas açısı değerleri arasındadır. HSA'in immobilizasyonu sonrası tüm yüzeylerde alınan temas açısı değerlerinde ise triptofan, valin, lösin ve izolösin gibi amino asitlerin hidrofobik yan zincirleri yüzünden artış görülmektedir. TFH membran yüzeyine HSA proteininin bağlanıp bağlanmadığını görmek için, PVA/P(HEMA-GMA)-2 yüzeyinin bağlanmadan önce ve sonra olmak üzere SEM görüntüleri alınmıştır. Yüzeyine HSA bağlı TFH membran örneği önce saf su ile yıkanıp, sonra fırında kurutularak SEM analizine hazır hale getirilmiştir. Şekil 4.28'de görüldüğü üzere immobilizasyon öncesi düz ve pürüzsüz olan yüzeylerin işlem boyunca oldukça gözenekli bir yapı kazandığı görülmektedir. Bu gözenekli yapı ile kazanılan yüksek iç yüzey alanı sayesinde protein hem PVA/P(HEMA-GMA) filminin dış yüzeyine hem de yüzeye yakın gözenek boşlukları içerisine bağlanabilmektedir. Bu yüzden bu geniş yüzey alanı immobilize olan protein ile TFH membranın reaksiyonuna katkı sağlamaktadır (Bayramoğlu ve ark., 2003). Ayrıca Şekil 4.28-b'de görüldüğü üzere proteinin küresel yapısı yüzey üzerinde açıkça görülmektedir.

Şekil 4.28. PVA/P(HEMA-GMA) TFH membranın (a) HSA bağlanmadan önceki; (b) HSA bağlandıktan

PVA/P(HEMA-GMA)-2 yüzeyine HSA proteininin bağlanıp bağlanmadığını görmek için, SEM analizlerinin yanında AFM analizi de yapılmış ve Şekil 4.29'da verilmiştir. PVA/P(HEMA-GMA)-2 yüzeyine HSA immobilizasyonu sonrası membran yüzey pürüzlülüğündeki artış protein moleküllerinin membran yüzeyine bağlandığını doğrular niteliktedir. RMS pürüzlülük değeri TFH membran için 0.42 nm iken; bu değer HSA immobilize olduktan sonra (18.33 nm) önemli ölçüde artış göstermiştir.

Şekil 4.29. PVA/P(HEMA-GMA)-2 THF membran yüzeyinin (a) HSA bağlamadan önce; (b) HSA bağladıktan

sonra alınan AFM görüntüsü

Elde edilen TFH membranlar üzerine HSA'in bağlanma mekanizması FTIR-ATR spektrofotometresi ile aydınlatılmıştır. Şekil 4.30 PVA/P(HEMA-GMA)-2 filminin FTIR spektrasını göstermektedir. TFH membranda 1724.44 cm−1 civarında hem HEMA hem de GMA'ın ester konfigürasyonlarına ait karakteristik gerilme titreşim bandı gözlenirken membran yüzeyine HSA bağlanması sonrası bu pik kaybolmuş ve 1633.83 cm-1 'de Amid I'e ve 1525.89 cm-1'de Amid II'e ait yeni gerilme titreşimleri gözlenmiştir. Amid I titreşimi 1650 cm−1'deki C=O titeşiminden gelirken; amid II titreşimi NH ve CN titreşimlerinin kombinasyonundan gelmektedir. 1415.01 cm-1 1341.52 cm-1 ve 1056.88 cm-1’deki pik genişlemesi proteinin primer yapısındaki prolin ve triptofandan gelmektedir (Kong ve Yu, 2007). Sonuçlar, TFH membrandaki epoksi gruplarının HSA proteinindeki amin gruplarıyla birleşerek kovalent bağ yaptığını kanıtlamaktadır.

Şekil 4.30. PVA/P(HEMA-GMA)-2 THF membran yüzeyine (a) HSA bağlanmadan önce; (b) HSA

4.4. Yağ-su Ayırımı İçin iCVD Yöntemi ile PFDA İnce Film Kaplı Süperhidrofobik ve Süperoleofilik Membran Eleklerin Sentezi