İnsan Serum Albüminin İmmobilizasyonu için iCVD ile Poli(hidroksi etil metakrilat-co-

Çalışmaları

Bu çalışmada tert-bütil peroksid başlatıcısı varlığında çapraz bağlanmış polivinil alkol tabakalar üzerinde 2-hidroksi etil metakrilat (HEMA) ve glisidil metakrilatın (GMA) başlatıcılı kimyasal buhar birikimi ile yeni bir polivinil alkol/poli(2-hidroksietil metakrilat- co-glisidil metakrilat (PVA/P(HEMA-GMA) ince film hidrojel (TFH) membran üretilmiştir. Elde edilen TFH membran üzerine insan serum albuminin (HSA) immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir.

3.6.1 Çapraz bağlı polivinil alkol tabakaların hazırlanması

Polivinil alkol (PVA)'ün % 2.0'lik (w/w) homojen sulu çözeltisini hazırlamak için PVA distile suda 95 oC sıcaklıkta 4 saat karıştırmak suretiyle çözünmüştür. Sonra hazırlanan çözelti oda sıcaklığında soğutulmuştur. Ardından ağırlıkça %25'lik glutaraldehit (GA)'in sudaki çözeltisi (Merck) çapraz bağlama reaksiyonunu başlatmak için [−OH]/[GA] oranı 4 olacak şekilde PVA çözeltisine ilave edilmiştir. PVA/GA çözeltisine 1,0 M hidroklorik asit damla damla eklenmek suretiyle pH yaklaşık 1.0'e ayarlanmış ve çözelti (4 mL) oldukça seri bir şekilde 6 cm çapındaki petri kaplarına aktarılmıştır. Hazırlanan PVA tabakalar 6 saat bir nemli çemberde tutulup sonra distile su ile yıkanmıştır.

3.6.2 iCVD ile poli(hidroksi etil metakrilat-co-glisidil metakrilat) ince film hidrojel membranları hazırlama çalışmaları

Poli(2-hidroksi etil metakrilat-co-glisidil metakrilat) (P(HEMA-GMA) ince filmler çapraz bağlı polivinil alkol (PVA) tabakalar üzerinde başlatıcı olarak terbütil peroksid (TBPO) kullanarak iCVD yöntemi ile biriktirilmiştir. 3.8’de açıklanan deneysel prosedür uygulanarak substrat yüzeylerinde 0.5 µm kalınlığında olacak şekilde poliglisidil metakrilat (PGMA), polidietilaminoetilmetakrilat (PHEMA) ve P(HEMA-GMA) ince filmler kaplanmıştır. P(HEMA-GMA) ince film birikimi sırasıyla 27 and 280 °C'lik substrat ve filament sıcaklıklarında gerçekleştirilmiştir. Reakör basıncı 0.3 Torr basınç değerinde sabit tutulmuştur. Ayrı ayrı paslanmaz çelik kaplara konulan HEMA ve GMA monomerleri sırasıyla 67 ve 65°C'e ısıtılmıştır. Başlatıcı gaz olan TBPO oda koşullarında tutulmuş ve

reaktöre farklı bir hattan beslenmiştir. Tüm deneyler boyunca GMA ve TBPO'in akış hızları 2.0 sccm ve 1.0 sccm'de sabit tutulurken değişen kompozisyonlara sahip kopolimer filmler (F3, F4, F5 ve F6) sentezlemek için HEMA'ın akış hızı 0 ila 2.0 sccm arasında değiştirilmiştir. Biriktirmeler boyunca karakterizasyon çalışmaları ve interferometrik kalınlık tayini için çapraz bağlı PVA destek materyali yanına Si alttaş yerleştirilmiştir. Çizelge 3.4’de kaplama için uygulanan deneysel parametreler verilmiştir.

Çizelge 3.4. TFH membran hazırlamak için iCVD yöntemi ile üretilen homo ve kopolimer filmler

için uygulanan deneysel parametreler.

örnek sıcaklık (°C) akış hızı (sccm) reaktör basıncı (Torr) filament substrat HEMA GMA TBPO

F1 _{280 27} 2 ₀ 1 _0,3 F2 280 27 0 2 1 0,3 F3 280 27 0,5 2 1 0,3 F4 280 27 1 2 1 0,3 F5 280 27 1,5 2 1 0,3 F6 280 27 2 2 1 0,3 F7 240 27 2 2 1 0,3 F8 210 27 2 2 1 0,3

3.6.3 Hazırlanan TFC membranlara uygulanan şişme deneyleri

PVA tabakalar üzerinde iCVD ile biriktirilen filmlerin şişme oranını bulmak için kaplı tabakalar 24 saat distile su içerisinde bekletilmiş ve şişen tabakalar fazla su uzaklaştırıldıktan sonra tartılmıştır. Sonra tabakalar sabit bir ağırlığa ulaşıncaya kadar 60 oC sıcaklıkta vakumlu etüvde kurutulmuş ve tekrar tartılmıştır. Filmin şişme oranı aşağıdaki ifade kullanılarak hesaplanmıştır:

Şişme oranı % = (Ws − Wd)/Wd× 100

3.6.4 TFH membran üzerine insan serum albuminin immobilizasyon çalışmaları

Çapraz bağlı PVA tabakalar üzerinde iCVD ile ince filmler biriktirildikten sonra hazırlanan TFH membranlar insan serum albumin proteininin immobilizasyon deneylerinde kullanımı için 0.6 cm çapında dairesel diskler şeklinde kesilmiştir.

İnsan serum albümin (HSA, 97-99 %, Sigma Aldrich)’ nin TRİS tampon ile çözeltisi hazırlanarak kullanılmıştır. HSA proteininin immobilizasyonu katı faz ekstraksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. TFH membran yüzeylerinde proteinin bağlanma kapasitesi üzerine film kompozisyonu ve kalınlığının etkisi incelenmiştir.

TRİS tampon çözeltisi (Trizma baze, 99.9 %, Sigma Aldrich) su ile pH:7.4 olacak şekilde HCl asit ile hazırlanmıştır.

Tüplere yerleştirilen 0.5654 cm2 yüzey alanına sahip TFH membranlar önce pH:7.4 olan 20 mM’ lık TRİS tampon çözeltisi ile üç kez yıkanmış ve ardından HSA proteininden 0.1 mg alınıp 100 mL TRİS tampon (20 mM/mL, pH:7.4) içerisinde çözmek suretiyle hazırlanan çözeltiden 1000 µL miktarınca her bir tüpe ilave edilmiştir. Her bir karışım rotator-mixer ile oda sıcaklığında 2 saat karıştırılmış ve daha sonra + 4 °C’ de santrifüjlenmiştir. Yüzeyden alınan çözeltinin floresans şiddeti sırasıyla, 280 nm ve 342 nm’de eksitasyon ve emisyon dalga boylarında ölçülerek, yüzeye bağlanan protein miktarı HSA’nın konsantrasyonuna karşı fluoresans şiddetine ilişkin çizilen kalibrasyon eğrisinden hesaplanmıştır (Maltas ve ark., 2013). Bağlanmamış protein konsantrasyonu kalibrasyon eğim eşitliğinden saptanmıştır (y=29050x+36.882, R=0.9943).

3.6.5 Biriktirilen homo ve kopolimer filmlerin ve TFH membranların karakterizasyon çalışmaları

Biriktirilen filmlerin ve TFH membranların kimyasal analizi Fourier Transform

Infrared Spektroskopi (FTIR-ATR) (Bruker Vertex 70) ile gerçekleştirilmiştir. FTIR spektrumu 800 ile 4000 cm-1 arasında 4 cm-1 çözünürlüğünde alınmıştır. Tüm FTIR spektralarında düzeltme yapılmış ve kalınlık normalize edilmiştir. Ayrıca kopolimer filmlerin kimyasal yapıları XPS (Specs EA 300) ile aydınlatılmıştır. Biriktirme boyunca film kalınlıkları lazer interferometre ile takip edilmiştir. Hem interferometrenin doğruluğunu kontrol etmek hem de çapraz bağlı PVA tabakaların kalınlığını belirlemek için AES Nano 500 model bir profilometre kulanılmıştır. Kurutulmuş ince filmlerin yüzey morfolojileri

SEM (Jeol) ve AFM (NtMdt) kullanarak gösterilmiştir. Tüm floresans çalışmaları Perkin Elmer LS-55 model bir spektroflorometre kullanarak yapılmıştır. Kuru TFC membranların temas açıları ortam sıcaklığında ölçümleri statik temas açısı ölçer gonyometre (Kruss Easy Drop) ile yapılmıştır. Statik temas açısı ölçümlerinde pH değeri yaklaşık olarak 7 olan ve sıcaklığı oda koşullarında tutulan saf su kullanılmıştır. pH ölçümleri için Orion model bir pH-metre kullanılmıştır.

3.7 Yağ-su Ayırımı İçin iCVD Yöntemi ile Süperhidrofobik ve Süperoleofilik Membran