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2.2.4.1 Doseamento da claritromicina por espectrofotometria no ultravioleta (UV)

A determinação analítica de claritromicina por CLAE foi utilizada para investigar o teor de claritromicina presente nas microesferas. Entretanto, para determinar a taxa de liberação da claritromicina das microesferas foi necessário desenvolver um método espectrofotométrico no ultravioleta com o objetivo de obter uma curva

linear em concentrações mais baixas que a obtida por CLAE. Na literatura verifica- se um número limitado de informações sobre doseamento de claritromicina utilizando um método espectrofotométrico. O método utilizado nesse estudo foi baseado em algumas informações fornecidas por MAJITHIYA & MURTHY (2005).

Para obtenção da curva padrão pesou-se exatamente o equivalente a 50 mg de padrão secundário de claritromicina que foi transferido quantitativamente para um balão volumétrico de 50 mL e o volume foi completado com metanol. Obteve-se então uma solução de claritromicina contendo 1.000 µg/mL. Dessa solução foi retirada uma alíquota de 10 mL que foi transferida para um balão volumétrico de 50 mL e o volume do balão foi completado também com metanol, obtendo-se uma solução estoque de claritromicina contendo 200 µg/mL. Fazendo cada diluição em triplicata, foram transferidas alíquotas de 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 e 500 µL da solução de claritromicina a 200 µg/mL para frascos âmbar e em seguida foram acrescentados a cada frasco respectivamente 500, 475, 450, 400, 300, 200, 100 e zero µL de metanol. Finalmente, adicionou-se 1,5 mL de ácido clorídrico concentrado em cada frasco, obtendo-se por frasco um volume final igual a 2 mL. Após estas diluições foram obtidas soluções padrões de claritromicina com as seguintes concentrações teóricas: 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0 e 50,0 µg/mL. A absorbância destas soluções foi medida também em triplicata utilizando-se cubeta de quartzo em comprimento de onda de 485 nm (Shimadzu UV-160 A, Japão). Como branco usou-se uma solução de metanol e ácido clorídrico. A média das absorvâncias foi plotada no gráfico em função das seguintes concentrações: 10

g/mL, 20 g/mL, 30 g/mL, 40 g/mL e 50 µg/mL.

O fator de resposta (FR) foi determinado dividindo-se o valor encontrado nas absorbâncias pela concentração da solução preparada. O coeficiente de variação (CV%), que expressa a precisão do método, também foi determinado.

2.2.4.2 Preparação do líquido gástrico simulado

O líquido gástrico simulado utilizado nesse experimento foi produzido baseado no método descrito por JANTATRID et al. (2008) que propõem a utilização de leite

na composição do líquido gástrico simulado com o objetivo de reproduzir um padrão alimentar. De acordo com esses autores a presença de leite permite observar uma possível interação de medicamentos administrados por via oral com os alimentos, no nosso caso microesferas de claritromicina. Os testes foram feitos na presença e na ausência de claritromicina.

Solução de ácido acético 100 µg/mL: 1 mL de ácido acético glacial foi transferido para um balão de 10 mL que teve seu volume completado com água destilada.

Solução tampão de ácido acético/acetato: 1,386 g de NaCl e 0,244 g de acetato de sódio anidro foram transferidos quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL. Em seguida adicionou-se 1 mL de solução de ácido acético 100 µg/mL e completou-se o volume do balão com água destilada para 100 mL.

Líquido simulado gástrico: 40 mL da solução tampão de ácido acético/acetato acima preparada foi adicionada a 50 mL de leite pasteurizado integral contendo 3,5% de gordura. A mistura foi mantida sob agitação magnética constante e o valor do pH encontrado foi 6,19. Para ajustar o valor do pH para 5 adicionou-se 23 mL de solução de HCl 0,1 N. O volume final do líquido gástrico foi igual a 113 mL e o sistema permaneceu sob agitação magnética constante por cinco minutos.

2.2.4.3 Seletividade do método espectrofotométrico

Para avaliar se os constituintes do líquido gástrico simulado interferem no doseamento da claritromicina utilizando o método espectrofotométrico, inicialmente filtrou-se uma alíquota de líquido gástrico simulado sem claritromicina utilizando um filtro Millex com poros de 0,45 m com o objetivo de retirar as gotículas de gordura do leite. Em seguida, filtrou-se novamente o líquido obtido da primeira filtração a uma rotação de 14.000 g até obter um volume de 300 L utilizando um filtro Microcon constituído por membrana regenerada de 3.0000

Daltons com o objetivo de reter as proteínas solúveis do leite. O filtrado obtido foi congelado com nitrogênio líquido e liofilizado por 24 horas. Após adicionar ao liofilizado 100 L de HCL, a dispersão formada foi centrifugada a 5.000 rpm durante 1 minuto. Retirou-se 75 L do sobrenadante obtido da centrifugação e adicionou-se a ele 25 L de metanol. Por fim, foram feitas leituras no espectrofotômetro utilizando uma cubeta de quartzo (Hellma, Alemanha).

2.2.4.4 Interferência do líquido gástrico simulado no doseamento da claritromicina por CLAE

Um dos objetivos desse experimento foi avaliar a interferência do líquido gástrico simulado contendo leite no doseamento da claritromicina por CLAE. Outro objetivo importante foi avaliar a eficiência dos dois filtros Millex e Microcon em minimizar estas interferências. Pesou-se 10 mg de padrão secundário de claritromicina que foi transferido para um recipiente contendo 113 mL de líquido gástrico simulado. O sistema permaneceu sob agitação magnética por 15 minutos. Posteriormente, filtrou-se uma alíquota em filtro Millex com poros de 0,45 µm, e, em seguida, filtrou-se novamente o líquido obtido da primeira filtração a uma rotação de 14.000 g por 40 minutos utilizando um filtro Microcon com poros de 3.000 Daltons. O filtrado foi injetado no cromatógrafo.

2.2.4.5 Estabilidade da claritromicina na presença do líquido gástrico simulado

Um miligrama de padrão secundário de claritromicina que foi transferido para um recipiente contendo 100 mL de líquido gástrico simulado contendo leite. O sistema permaneceu sob agitação magnética por 1 hora. Em seguida, filtrou-se uma alíquota deste líquido gástrico contendo a claritromicina utilizando um filtro Millex com poros de 0,45 m e o líquido obtido dessa primeira filtração foi ainda submetido a uma rotação de 14.000 g até obter um volume de 500 L utilizando um filtro Microcon com poros de 3.000 Daltons. O filtrado obtido foi congelado com

nitrogênio líquido e liofilizado por 24 horas. Após adicionar ao liofilizado 100 L de HCL, a dispersão formada foi centrifugada a 5.000 rpm durante 1 minuto. Retirou- se 75 L do sobrenadante obtido da centrifugação e adicionou-se a ele 25 L de metanol. Por fim, foram feitas leituras no espectrofotômetro utilizando uma cubeta de quartzo (Hellma, Alemanha).

2.2.4.6 Liberação in vitro da claritromicina das microesferas

Pesou-se 1,19 mg de microesferas contendo teoricamente 0,1 mg de claritromicina que foi transferido para um recipiente contendo 10 mL de líquido gástrico simulado contendo leite. O sistema permaneceu sob agitação magnética por 2 ou 4 horas. Em seguida transferiu-se todo o conteúdo do recipiente para um tubo falcon e este foi centrifugado a 12.000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi separado do sedimento com auxílio de uma pipeta automática. Filtrou-se uma alíquota do sobrenadante utilizando um filtro Millex com poros de 0,45 m e filtrou- se novamente o líquido obtido da primeira filtração a uma rotação de 14.000 g até obter um volume de 1.400 L e 950 L para o teste de liberação de 2 e 4 horas respectivamente, utilizando um filtro Microcon com poros de 3.000 Daltons. O filtrado obtido foi congelado com nitrogênio líquido e liofilizado por 24 horas. Após adicionar ao liofilizado 125 L e 100 L de HCL para o teste de liberação de 2 e 4 horas respectivamente, a dispersão formada foi centrifugada a 5.000 rpm durante 1 minuto. Retirou-se 75 L do sobrenadante obtido da centrifugação e adicionou- se a ele 25 L de metanol. Por fim, foram feitas leituras no espectrofotômetro utilizando uma cubeta de quartzo (Hellma, Alemanha).

O sedimento que permaneceu no tubo falcon contendo as microesferas foi lavado com água e centrifugado a 20.000 rpm por 15 minutos. Essa etapa foi realizada por 3 vezes. Em seguida foi congelado com nitrogênio líquido e levado ao liofilizador por 24 horas. Ao sólido obtido adicionou-se 200 L de metanol e este foi levado ao ultra-som por 20 minutos para dissolver as microesferas. Em seguida completou-se novamente o volume da dispersão para 200 L e esta foi filtrada em membrana de celulose de 0,45 m. Para análise da claritromicina que

permaneceu nas microesferas após 2 horas retirou-se uma alíquota de 10 L para o do filtrado e adicionou-se a ela 15 L de metanol e 75 L de HCl para realizar a leitura no espectrofotômetro. Para análise da claritromicina que permaneceu nas microesferas 4 horas retirou-se uma alíquota de 25 L do filtrado e adicionou-se a ela 75 L de HCl para realizar a leitura no espectrofotômetro