Ambos os fungos apresentaram resultados semelhantes quanto à mortalidade total (Tratamentos: F = 44,82; gl = 4; p < 0,0001, Fungo: F = 0,036; gl = 1; p < 0,8505 e Tratamento vs Fungo: F = 0,0240; gl = 4; p < 0,0240) e mortalidade
confirmada pelo fungo (Tratamento: F = 99,135; gl = 4, p < 0,0001, Fungo: F = 0,701; gl = 1; p = 0,4076 e Tratamento vs Fungo: F = 0,827; gl = 4, p = 0,5161) (Figura 1).
A maior mortalidade causada pelo Tween 80 0,1% no bioensaio com M.
anisopliae pode ter ocorrido em função de diferenças na suscetibilidade em
organismos de uma mesma população (OLIVEIRA et al., 2011) e também na variação genética intrapopulacional já verificada em populações de P. americana na Colômbia (JARAMILLO-RAMIREZ et al., 2010).
Os entomopatógenos pulverizados sobre as ootecas de P. americana foram patogênicos, se diferenciaram da testemunha sem aplicação e do controle negativo (Tween 80 0,1%) e apresentaram mortalidade confirmada pelo fungo acima de 80% (2 x 108 con./mL). As concentrações fúngicas avaliadas e para ambas as espécies de fungos não foram significativamente diferentes para as mortalidades do inseto alvo. Os resultados obtidos foram similares ao estudo com a transmissão horizontal de M. anisopliae em Blattella germanica (Linnaeus, 1767), em que viabilidade de ootecas apresentou redução de 48 a 85% (QUESADA-MORAGA et al., 2004). Já Hubner-Campos et al. (2013) verificaram menor porcentagem de ootecas de P.
americana mortas pelos fungos com cerca de 31% para os isolados M. anisopliae IP
Figura 1. Porcentagens de mortalidade total, mortalidade confirmada pelo fungo e
de extrusão fúngica de ootecas de Periplaneta americana de Piracicaba – SP tratadas com suspensões de diferentes concentrações dos isolados JAB 68 de Metarhizium anisopliae e IBCB 35 de Beauveria bassiana em condições de laboratório. Médias verdadeiras ± Erro Padrão da Média dos tratamentos, seguidas de mesmas letras minúsculas e dos fungos, de mesmas letras maiúsculas, não se diferem significativamente pelo teste Tukey (p≤0,05). Análise estatística realizada pelo teste F com dados transformados em arcosseno √ 𝑥/ . Bb = Beauveria bassiana e Ma =
Metarhizium anisopliae.
Não houve relação entre o aumento das concentrações dos microorganismos e a porcentagem de extrusão (Tratamentos: F = 63,425; gl = 4; p < 0,0001, Fungo: F = 2,172; gl = 1, p = 0,1484, Tratamento vs fungo: F = 2,760; gl = 4, p = 0,0407) em ootecas de P. americana tratadas com B. bassiana, mas foi possível observar maior extrusão na menor concentração de M. anisopliae (74%) em comparação com B.
bassiana (40%) (Figura 1).
Os conídios de M. anisopliae são em formato de bastonetes e maiores do que de B. bassiana (ALVES; LECUONA, 1998), apresentando menor superfície de
Porc en tag ens de m ortal ida de e de ex trus ão
contato com o hospedeiro e como consequência, efeito negativo com o aumento das concentrações aplicadas. Esse resultado mostra que mesmo em meio sem a presença de quitina, caracterizado pela ooteca (KRAMER et al., 1991) o isolado JAB 68 de M. anisopliae apresentou maior capacidade de disseminação.
Pelas diferenças entre porcentagem de mortalidade total, mortalidade confirmada pelo fungo e extrusão é possível observar que geralmente M. anisopliae foi o agente causador primário da morte de ootecas. O mesmo não ocorreu para B.
bassiana.
Os conídios de B. bassiana são menores (2 a 3 X 2 a 2,5 µm) do que de M.
anisopliae (5 a 7µm) (ALVES, 1998), e possivelmente, promovem maior número de
perfurações no hospedeiro. Esse maior número de aberturas pode ser a causa de morte dos insetos e também facilitar a contaminação por bactérias, já existentes no corpo de baratas adultas (PAI; CHEN; PENG, 2005). As bactérias podem ter inibido drasticamente o crescimento deste fungo (KERR, 1999), inviabilizado sua extrusão das ootecas. Estudos futuros precisam ser conduzidos para esclarecer melhor os mecanismos de colonização e extrusão de B. bassiana neste alvo.
Para a suspensão de 2 x 108 con./mL houve diferença de efeito em função das espécies de fungos quanto ao número total de ninfas eclodidas (Tratamentos: F = 36,474; gl = 4; p < 0,0001, Fungo: F = 0,680; gl = 1, p = 0,4146, Tratamento vs fungo: F= 2,395; gl = 4; p = 0,0664), mas sem divergência entre as concentrações aplicadas. Esta suspensão proporcionou redução de aproximadamente 75% para M.
anisopliae e 95% para B. bassiana no número de ninfas totais eclodidas,
respectivamente, quando comparados com a testemunha (Figura 2). Este evento mostra o potencial de diminuição da prole pelos agentes microbianos utilizados. Resultado semelhante foi observado para larvas eclodidas de Choristoneura
rosaceana (Harris, 1841) (Lepidoptera: Tortricidae), com diminuição em 90% após
tratamento de ovos com suspensões de B. bassiana a 1 x 108 con./mL (COSSENTINE, 2014).
Figura 2. Número total de ninfas eclodidas por tratamento de ootecas de Periplaneta americana de Piracicaba – SP tratadas com suspensões de diferentes
concentrações de Metarhizium anisopliae JAB 68 e Beauveria bassiana IB- CB 35 em condições de laboratório. Médias verdadeiras ± Erro Padrão da Média com análise estatística realizada pelo teste F com dados transformados em √ 𝑥 + . Teste de Tukey (p ≤ 0,05). Letras minúsculas iguais não diferem entre si nos tratamentos e letras maiúsculas iguais não diferem entre fungos.
Para M. anisopliae não houve diferença no número de ninfas por ooteca viável (Tratamentos: F = 3,419; gl = 4; p = 0,0170, Fungo: F = 0,567; gl = 1; p = 0,4558, Tratamento vs fungo: F = 1,530; gl = 4; p = 0,2121) entre os tratamentos, mas a concentração de 2 x 108 con./mL de B. bassiana apresentou menor quantidade comparando os fungos e os demais tratamentos (Figura 3). Este fenômeno mostra que em algumas concentrações de B. bassiana o fungo consegue penetrar na ooteca, mas nem sempre é capaz de infectar todos os ovos. Essa infecção parcial,
possivelmente motivada pelo depósito heterogêneo da calda sobre a superfície do inseto, também foi observada no estudo da suscetibilidade de C. rosaceana a B.
bassiana (COSSENTINE, 2014).
Figura 3. Número médio de ninfas eclodidas por ootecas viáveis de Periplaneta americana de Piracicaba – SP tratadas com suspensões de diferentes
concentrações de Metarhizium anisopliae JAB 68 e Beauveria bassiana IB-CB 35 em condições de laboratório. Médias verdadeiras ± Erro Padrão da Média com análise estatística realizada pelo teste F com dados transformados em √ 𝑥 + . Teste de Tukey (p ≤ 0,05). Letras minúsculas iguais não diferem entre si nos tratamentos e letras maiúsculas iguais não diferem entre fungos.
Não houve relação entre a concentração e o tempo de extrusão dos fungos (Tratamento: F = 3,821; gl = 2, p = 0,0363, Fungo: F = 68,762; gl = 1, p < 0,0001),
Tratamento vs Fungo: F = 0,878; gl = 2; p = 0,4287), mas foi possível observar que
M. anisopliae foi mais agressivo, com diferença significativa entre suas suspensões
com as de B. bassiana, levando de 15 a 21 dias para sua extrusão, ao passo que B.
bassiana levou de 29 a 32 dias (Figura 4). A mesma diferença interespecífica na
virulência foi encontrada na infecção de três espécies de corós (DHOJ-GC et al., 2008), de carrapatos da espécie Boophilus annulatus (PIRALI-KHEIRABADI et al., 2007), da grande traça de cera (Galleria mellonella Linnaeus, 1758) e de tenébrios (Tenebrio molitor Linnaeus, 1758) (ORESTE et al., 2012).
Figura 4. Tempo médio de extrusão fúngica, em dias, em ootecas de Periplaneta americana de Piracicaba – SP tratadas com suspensões de diferentes
concentrações de Metarhizium anisopliae JAB 68 e Beauveria bassiana IB-CB 35 em condições de laboratório. Médias verdadeiras ± Erro Padrão da Média com análise estatística realizada pelo teste F com dados transformados em √ 𝑥 + . Teste de Tukey (p ≤ 0,05). Letras minúsculas iguais não diferem entre tratamentos e letras maiúsculas iguais não diferem entre fungos.
Apesar de B. bassiana ter secretado mais quitinase e reduzido o número de ninfas na concentração de 2 x 108 con./mL, a porcentagem de mortalidade não diferiu de M. anisopliae e sua capacidade de propagação foi menor à de M.
anisopliae na concentração de 2 x 107 con./mL. Assim, o tempo de extrusão e a porcentagem de ootecas extrusadas mostraram diferenças na agressividade entre fungos, servindo como parâmetro de escolha do fungo no controle de ootecas de P.
americana.
3.3. Identificação dos isolados fúngicos por sequenciamento genético da região ITS1-5.8S-ITS2
As sequencias dos isolados IBCB 35 e JAB68 se alinharam com 100% de similaridade com as sequências de B. bassiana e M. anisopliae, respectivamente. O dendrograma apresentou 3 grupamentos principais, sendo um grupo composto pelas sequências de Metarhizium spp., o segundo por Beauveria spp. e o terceiro com o grupamento externo (Figura 5).
A técnica de sequenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 é considerado o método mais preciso e trabalhoso para se catalogar diferenças a nível molecular de fungos (XU, 2006) e se mostrou uma ferramenta eficiente para a identificação de espécies de fungo do presente trabalho, que foram consideradas eficientes no controle de ootecas de P. americana.
Ao final das análises, as sequências foram depositadas no GenBank com as seguintes codificações: KF958306 Metarhizium anisopliae JAB 68 e KF958305
Figura 5. Análise bayesiana de sequências ITS de isolados Metarhizium spp. e Beauveria spp, e de espécies-tipo do banco
4. CONCLUSÕES
Há elevado potencial de uso de suspensões dos isolados JAB 68 de M.
anisopliae e IBCB 35 de B. bassiana, para controle de P. americana na fase de
ootecas. A atividade quitinotítica e a extrusão foram verificadas em ambos os isolados e demonstraram-se como bons parâmetros na avaliação da patogenicidade dos fungos para o controle das ootecas. O isolado mais agressivo foi o JAB 68 de M.
anisopliae na concentração de 2 x 107 con./mL, com maior capacidade de disseminação, menor tempo de extrusão e maior porcentagem de ootecas extrusadas. O isolado IBCB 35 de B. bassiana reduziu o número de ninfas eclodidas na concentração de 2 x 108 con./mL. JAB 68 foi identificado como Metarhizium
anisopliae e IBCB 35 como Beauveria bassiana.
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CAPÍTULO 4 - CONTROLE DE OOTECAS DE Periplaneta americana