Belediyelerin görev ve sorumlulukları

Foram selecionadas ao acaso vinte baratas fêmeas de cada localidade, correspondendo à geração F1 de Jaboticabal e Fn de Piracicaba. De cada adulto foi usada a terceira perna direita inteira para a extração de DNA, que seguiu o protocolo de Kuramae-Izioka (1997) com modificações para sua otimização.

Cada amostra foi macerada em almofariz com nitrogênio líquido e aproximadamente 0,2 g do macerado transferido para tubos “eppendorf” de 2,0 mL. Em seguida, foi adicionado 0,8 mL do tampão de extração (5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris HCL, 20% SDS e 0,2 M de sacarose), incubado a 65°C por 60 minutos. Se adicionou 0,5 mL de acetato de potássio 5 M no tubo e depois, colocado por 30 minutos no gelo.

As amostras foram centrifugadas a 11.400 x g por 10 minutos a 10ºC e o sobrenadante transferido para tubos novos, sendo acrescentados 0,7 mL de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1). As soluções foram misturadas por inversão durante três minutos e, posteriormente, centrifugadas a 11.400 x g por 10 minutos a 10ºC. Após a centrifugação, a fase superior foi transferida para tubos novos. Em seguida, foram

acrescentados 1,0 mL de etanol absoluto gelado e a solução, depois de ser misturada gentilmente, foi mantida em freezer -20ºC “over night”.

Após a precipitação do DNA em etanol, os tubos foram centrifugados a 11.400 x g por 15 minutos a 10ºC. A fase líquida foi descartada e o “pellet” lavado com 1,0 mL de etanol 70%. Após a centrifugação sob as mesmas condições anteriores, a fase líquida foi novamente descartada e o “pellet” colocado para secar em temperatura ambiente ± 25ºC por 60 minutos. O “pellet” foi então, ressuspendido em 0,03 mL de tampão TE 10:1 (Tris-HCl 10mM pH 8,0; EDTA 1mM pH 8,0) por 24 h a 4ºC.

O DNA foi quantificado e sua qualidade avaliada em espectrofotômetro NanoDrop (Uniscience). O valor desta análise ficou entre 1,7 e 2,0, que corresponde à absorbância entre os comprimentos de onda de 260 e 280nm, conferindo uma boa qualidade do DNA. A integridade do DNA foi avaliada em gel de agarose a 1%.

A amplificação por PCR-RAPD seguiu o protocolo de Williams et al. (1990), utilizando um termociclador (PTC 100 Programable Thermal Controler, MJ Research, Inc.) programado para realizar uma desnaturação inicial de 3 minutos a 92C, seguido de 47 ciclos, sendo que cada ciclo consiste de uma etapa de desnaturação (1 minuto a 92C), uma etapa de pareamento (1 minuto e 45 segundos a 36C) e de uma etapa de alongamento (2 minutos a 72C), e por fim uma extensão final a 72C por 7 minutos.

Foram testados 192 “primers” (Operon Technologies, California, USA) para se selecionar os mais informativos para as baratas. As reações tinham um volume total de 20µL contendo 0,4µL de DNTPs (10mM), 1µL do “primer”, 2µL de tampão de amplificação 10X de PCR, 2µL de MgCl2 (25mM), 0,5µL de Taq DNA Polimerase (Invitrogen) (5U/µL), 2µL amostra de DNA (30ng/µL) e 12,4µL de água ultrapura.

Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em tampão TEB 1X, utilizando géis de agarose 1% com brometo de etídio (0,5g/ml). Como padrão de tamanho molecular foi usado o marcador 100 pb “DNA Ladder”. A visualização dos fragmentos foi então fotodocumentada.

A avaliação da qualidade do DNA ficou entre os valores 1,7 e 2,0, caracterizando um DNA de boa qualidade para as quarenta amostras. No gel as bandas estavam sem arraste, indicando DNA íntegro. De todos os “primers” testados foram escolhidos 14,

que foram amplificados por PCR-RAPD (A07, A20, G6, I4, I7, I10, I13, J3, M19, N8, P13, P14, Q14 e Q17).

Os padrões de bandas de RAPD em cada amostra foram codificados em matriz binária (presença/ausência), com auxílio do software PAUP (“Phylogenetic Analysis Using Parcimony” - Versão 4.0b10) (SWOFFORD, 2002) para a obtenção da matriz de distância (NEI; LI, 1979) e a construção de um dendrograma pelo método de agrupamento “neighbor-joining” (SAITOU; NEI, 1987), com bootstrap de 1000 repetições (FELSENSTEIN, 1985). Ele foi editado pelo software TreeGraph 2.3.0 (STÖVER; MÜLLER, 2010) para a visualização das relações genéticas entre as populações de P. americana.

A matriz binária também foi utilizada para a análise AMOVA (Análise de Variância Molecular) e cálculo do índice de fixação (Fst) (EXCOFFIER; SMOUSE; QUATTRO, 1992), obtido pelo software Arlequin 3.5.1.2 (EXCOFFIER; LISCHER, 2010). Os valores de Fst foram utilizados para o cálculo do fluxo gênico, correspondendo ao número de migrantes por geração, segundo a fórmula: Nm = (1–FST)/4FST (COCKERHAM; WEIR, 1993). Caso Nm < 1, a população local tende a uma diferenciação, mas se Nm ≥ 1, a diferenciação populacional é pequena, sendo a migração nesse caso mais importante do que a deriva genética (WRIGHT, 1951).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Mortalidade de adultos de duas populações de P. americana submetidas à aplicação tópica de fungos entomopatogênicos em condições de laboratório.

Não houve interação significativa entre os tratamentos e as localidades em nenhuma das variáveis. Porém, houve diferenças quanto ao tratamento e local para mortalidade total, mortalidade ocasionada pelo fungo e porcentagem de extrusão do fungo. As populações de Jaboticabal e Piracicaba não diferiram entre si quanto ao

tempo de morte causada pelo fungo, mostrando ser uma característica inerente aos entomopatógenos, não sendo influenciada por fatores externos (Tabela 1).

Tabela 1. Resultados da análise de variância (valor de p) para as variáveis de

porcentagens de mortalidade (M), de mortalidade confirmada pelo fungo (MF) e de extrusão (EX) em fêmeas de Piracicaba/SP e Jaboticabal/SP tratadas com diferentes concentrações dos isolados JAB 68 de Metarhizium

anisopliae IBCB 35 de Beauveria bassiana.

Fontes de variação g.l. _{M (%) MF (%) EX (%)} Valores de p _{TMF (dias)} g.l. Tratamento 7 0,0048 <0,0001 <0,0001 0,7485 5

Local 1 0,0499 0,0238 0,0212 0,4719 1

Tratamento *Local 7 0,2794 0,2793 0,1466 0,2894 5

CV (%) 55,24 61,14 76,36 34,19

Não houve controle de fêmeas adultas de P. americana em nenhum dos tratamentos no município de Jaboticabal. O mesmo não ocorreu com baratas de Piracicaba, em que a suspensão de 3 x 108 con./mL do isolado JAB 68 de M. anisopliae apresentou maior mortalidade total (56%), diferindo da testemunha e do mesmo tratamento da população de Jaboticabal.

Ambos os fungos foram capazes de ocasionar a morte da praga na população de Piracicaba. A suspensão de 3 x 108 _{con./mL do isolado JAB 68 de M. anisopliae da} população de Piracicaba apresentou maior mortalidade confirmada pelo fungo (48%) do que os tratamentos com 3 x 107 _{(16%) e 3 x 10}9 _{con./mL (18%) do isolado IBCB 35 de}

B. bassiana. A mesma concentração do isolado IBCB 35 de B. bassiana garantiu maior

mortalidade de fêmeas pelo fungo em Piracicaba (28%) do que em Jaboticabal (6,7%). Hernanez-Ramirez, Sanchez-Arroyo e Alatorre-Rosas (2008) utilizaram as mesmas espécies fúngicas, mas não conseguiram um controle eficaz de adultos, atingindo apenas 10% de mortalidade. Já, Hubner-Campos et al. (2013) relatam a mortalidade de 100% de adultos de P. americana com formulação contendo 10% de óleo vegetal + Tween 80® _{0,1% e o isolado IP 46 de M. anisopliae na concentração de 5} x 105 con./mL.

Tais diferenças na mortalidade podem ser devido a vários fatores. Há estudos em que isolados de uma mesma espécie de fungo podem apresentar diferenças de virulência levando a diferentes resultados no controle da praga (DHOJ-GC et al., 2008). Além disso, pode haver diferenças no controle de baratas de diferentes localidades pelo fenômeno de diferenciação populacional em insetos com implicações em seu controle. Este evento já foi relatado previamente para a espécie Spodoptera frugiperda (Smith, 1797), cujas populações oriundas de diferentes localidades apresentam diferente suscetibilidade ao patógeno Bacillus thuringiensis (Berliner, 1915) (MONNERAT et al., 2006).

Outro ponto a ser considerado é que o exoesqueleto de insetos é bastante vulnerável à penetração por entomopatógenos quando há a formação de um novo tegumento, pois pode não estar completamente esclerotizado (ALVES; PEREIRA, 1998). O uso de adultos muito jovens de P. americana com idade entre dois e cinco dias, como utilizado por Hubner-Campos et al. (2013), pode ter facilitado a penetração pelos fungos.

A mortalidade máxima ocasionada pelos fungos foi de aproximadamente 50% em Piracicaba e 30% em Jaboticabal (Tabela 2). Os valores são menores que os verificados no controle químico de adultos da espécie (VYTHILINGAM & SUTIVIGIT, 1994). Entretanto, sua aplicabilidade em esgoto tem como premissa o manejo integrado da barata com aplicações periódicas e intercaladas ou concomitantes com substâncias químico-sintéticas.

Esses microorganismos são específicos, não apresentam resíduos tóxicos ao homem ou ao ambiente, geralmente, não selecionam indivíduos resistentes da praga e são compatíveis com inseticidas (INCI; KILIÇ; CANHİLAL, 2014), o que evidencia o seu potencial de uso em campo.

Tabela 2. Porcentagem de mortalidade total e de mortalidade confirmada pelo fungo de fêmeas de Piracicaba/SP e

Jaboticabal/SP pulverizadas com suspensões de diferentes concentrações dos isolados JAB 68 de

Metarhizium anisopliae e IBCB 35 de Beauveria bassiana em condições de laboratório.

Tratamentos Mortalidade (%) _Localidade Mortalidade confirmada fungo (%) _Localidade Piracicaba Jaboticabal Piracicaba Jaboticabal

Testemunha 4,0 ± 2,4 a A 6,7 ± 6,7 aA 0,0 ± 0,0 a A 0,0 ± 0,0 aA

Tween 80® _{0,1% 20,0 ± 7,1 ab A 16,7 ± 3,3 aA} 0,0 ± 0,0 a A 0,0 ± 0,0 aA

M. anisopliae 3 x107 con./mL 26,0 ± 5,1 b A 13,3 ± 3,3 aA 22,0 ± 5,8 abc A 13,3 ± 3,3 aA

M. anisopliae 3 x108 _{con./mL 56,0 ±11,2 b A 13,3 ± 6,7 aB} 48,0 ± 9,7 c B 13,3 ± 6,7 aA

M. anisopliae 3 x109 _{con./mL 44,0 ±11,7 ab A 33,3 ± 12,0 aA} 44,0 ± 11,7 bc A 30,0 ± 10,0 aA

B. bassiana 3 x 107 _{con./mL 18,0 ± 6,6 ab A 13,3 ± 3,3 aA} 16,0 ± 6,8 ab A 10,0 ± 5,8 aA

B. bassiana 3 x108 con./mL 30,0 ± 7,1 ab A 10,0 ± 5,8 aA 28,0 ± 5,8 abc B 6,7 ± 3,3 aA

B. bassiana 3 x109 con./mL 20,0 ± 7,1 ab A 26,7 ± 13,3 aA 18,0 ± 5,8 ab A 26,7 ± 13,3 aA Médias ± Erro Padrão da Média, seguidas de mesmas letras minúsculas na coluna e maiúsculas na linha e não se diferem significativamente pelo teste Tukey (p≤0,05).

Não houve extrusão nos tratamentos testemunha e Tween 80® _{0,1% e} eles não diferiram entre si e entre municípios. As maiores porcentagens de extrusão e com diferenças significativas quando comparadas com os tratamentos testemunha e Tween 80® _{0,1% foram observadas na população de Piracicaba nas pulverizações com} o isolado JAB 68 de M. anisopliae nas concentrações de 3 x 109 _{(40%) e 3 x 10}8 con./mL (42%) e com o isolado IBCB 35 de B. bassiana para 3 x 108 _{con./mL (24%). A} porcentagem de extrusão do isolado JAB 68 de M. anisopliae na concentração de 3 x 108 con./mL diferiu entre localidades (Tabela 3).

Poucos trabalhos abordam a porcentagem de extrusão do fungo sobre o hospedeiro. Esta variável pode fornecer informações sobre o potencial de disseminação do entomopatógeno e sua permanência no local tratado, já que cadáveres infectados podem ser novas fontes de inóculo tanto por transmissão horizontal, quanto por via oral (BABU; SHANKAR; PADMA, 2014).

O tempo que B. bassiana e M. anisopliae levaram para matar fêmeas de P.

americana variou de 3 a 12 dias (Tabela 3) e foi similar ao encontrado para o mosquito Anopheles gambiae (Giles, 1926) (MNYONE et al., 2009), que foi de 5 a 20 dias,

dependendo da concentração de conídios de fungo utilizada nos tratamentos.

Não houve diferença significativa entre fungos, mas foi possível observar que na concentração de 3 x 108 _{con./mL do isolado IBCB 35 de B. bassiana houve diferença} entre localidades (Tabela 3). Essa informação infere à uma possível diferença interpopulacional do inseto.

Dentre os fungos avaliados, o que apresentou maior eficácia de controle foi o isolado JAB 68 de M. anisopliae, sendo consideradas as variáveis de mortalidade e porcentagem de extrusão do fungo. Hubner-Campos et al. (2013) e Hernandez-Ramirez et al. (2008) também observaram que M. anisopliae é a espécie com maior potencial para o controle de P. americana, quando comparada com outros fungos.

Diante dos resultados obtidos foi considerada a concentração de 3 x 108 con./mL para a aplicação em campo de ambos os entomopatógenos.

Tabela 3. Porcentagens de extrusão e tempo de mortalidade pelo fungo em fêmeas de Piracicaba – SP e

Jaboticabal – SP pulverizadas com suspensões de diferentes concentrações dos isolados JAB 68 de

Metarhizium anisopliae e IBCB 35 de Beauveria bassiana em condições de laboratório.

Tratamentos Extrusão do fungo (%) _Localidade Tempo de morte pelo fungo (dias) _Localidade Piracicaba Jaboticabal Piracicaba Jaboticabal

Testemunha 0,00 ± 0,00 a A 0,0 ± 0,00 aA - -

Tween 80® _{0,1% 0,00 ± 0,00 a A 0,0 ± 0,00 aA - -}

M. anisopliae 3 x107 _{con./mL 18,0 ± 6,6 abc A 6,7 ± 3,3 aA 9,5 ± 1,6 a A 11,5 ± 0,3 a A}

M. anisopliae 3 x108 con./mL 42,0 ± 7,3 c B 6,7 ± 6,7 aA 6,4 ± 0,8 a A 6,8 ± 3,5 a A

M. anisopliae 3 x109 con./mL 40,0 ± 11,4 bc A 26,7 ± 13,3 aA 5,3 ± 1,4 a A 8,2 ± 1,7 a A

B. bassiana 3 x 107 _{con./mL 8,0 ± 5,8 a A 10,0 ± 5,8 aA 8,4 ± 3,3 a A 9,3 ± 5,0 a A}

B. bassiana 3 x108 _{con./mL 24,0 ± 5,1 abc A 6,7 ± 3,3 aA 12,1 ± 2,3 a B 3,0 ± 2,1 a A}

B. bassiana 3 x109 _{con./mL 14,0 ± 5,1 ab A 16,7 ± 8,8 aA 9,1 ± 2,6 a A 6,6 ± 3,3 a A} Médias ± Erro Padrão da Média, seguidas de mesmas letras minúsculas na coluna e maiúsculas na linha não se diferem significativamente pelo teste Tukey (p≤0,05).

3.2. Controle de fêmeas de duas populações de P. americana em esgotos urbanos e viabilidade de conídios antes e após nebulização a frio.

Nos experimentos realizados em Jaboticabal foi possível observar diferença significativa para as variáveis de mortalidade total (experimento 1: df = 4, p< 0,0001, F = 42,53 e experimento 2: df = 4, p = 0,0016, F = 8,70), mortalidade confirmada pelo fungo (experimento 1: df = 4, p = 0,0018, F = 8,39 e experimento 2: df = 4, p < 0,0001, F = 45,31) e porcentagem de extrusão do fungo (experimento 1: df = 4, p = 0,0274, F = 4,00 e experimento 2: df = 4, p < 0,0001, F = 31,86) (Figura 4).

O isolado IBCB 35 de B. bassiana não se diferenciou dos controles quanto à mortalidade total em ambos os experimentos de Jaboticabal, já para a mortalidade ocasionada pelo fungo se diferenciou da testemunha e Tween 80® 0,1% apenas na segunda aplicação, evidenciando menor eficiência em aplicação inicial do que o isolado JAB 68 de M. anisopliae (Figura 4).

Diferenças na suscetibilidade a diferentes isolados e espécies de fungos já foram relatadas para o ácaro Tetranychus urticae (Koch, 1836) (Acari: Tetranychidae) (BUGEME et al., 2014) e para a barata de esgoto P. americana (HUBNER-CAMPOS et al., 2013), sendo que em ambos os casos os isolados da espécie M. anisopliae apresentaram, em sua maioria, maior eficiência de controle quando comparados com os de B. bassiana.

Figura 4. Porcentagens de mortalidade total, mortalidade confirmada pelo fungo e extrusão do fungo em fêmeas de Periplaneta americana submetidas a diferentes tratamentos em esgoto dos experimentos em

Jaboticabal/SP, Brasil. Médias originais ± erro padrão. Análise estatística realizada com dados transformados em arcoseno √𝑥⁄ . Médias seguidas de mesma letra nos tratamentos não diferem entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05).

Experimento 1 Experimento 2 Porc en tag em (%) Porc en tag em (%)

Nos bioensaios realizados em Piracicaba foi possível observar diferença significativa para as variáveis de mortalidade total (experimento 1: df = 4, p<0,0001, F = 23,882 e experimento 2: df = 4, p = 0,0027, F = 7,593), mortalidade confirmada pelo fungo (experimento 1: df = 4, p<0,0001, F = 48,744 e experimento 2: df = 4, p = 0,0001, F = 14,906) e porcentagem de extrusão do fungo (experimento 1: df = 4, p<0,0001, F = 42,587 e experimento 2: df = 4, p = 0,0001, F = 17,886) (Figura 5).

Apesar do isolado JAB 68 de M. anisopliae ter se diferenciado dos controles na população de Jaboticabal em ambos os experimentos (Figura 4), pode-se inferir que os resultados verificados à campo foram similares aos de laboratório. A quantidade de baratas mortas por fungos em Jaboticabal foi inferior a da população de Piracicaba nos bioensaios de campo (Figuras 4 e 5). A maior mortalidade total de baratas observada entre os tratamentos controles em Jaboticabal (Figura 4) pode ser em função de condições adversas não encontradas em laboratório, tais como presença de predadores como escorpiões e diferentes patógenos.

As altas porcentagens de morte provocadas pela solução de Tween® _{80 (SIGMA)} nos experimentos de campo (Figuras 4 e 5) e de laboratório (Tabela 2) podem ter ocorrido pelo fato do produto apresentar ação solubilizante de proteínas (NANDAKUMAR; GOUNOT; MATTIASSON, 2000), que é o maior componente do exoesqueleto de P. americana (KRAMER et al., 1991). Em alguns casos ele pode ser considerado tóxico, tendo em vista diferenças na suscetibilidade intra e interpopulacional de organismos (OLIVEIRA et al., 2011).

Nos primeiros experimentos de ambas as localidades o controle com lambdacialotrina foi significativamente maior (100%) do que os demais tratamentos (Figuras 4 e 5). Na segunda aplicação foi possível verificar aumento de mortalidade ocasionada pelo fungo e a equivalência de controle biológico com o químico, especialmente para o isolado JAB 68 de M. anisopliae (Figuras 4 e 5). Isto mostra maior potencial de uso deste isolado no manejo da praga.

Esse aumento da mortalidade de fêmeas de P. americana em esgoto em uma reaplicação pode estar relacionado com a capacidade de fungos entomopatogênicos sobreviverem no ambiente, com possível aumento da quantidade de conídios no local,

quando em reaplicações. Este resultado indica o método como uma alternativa bem sucedida no controle de baratas em esgoto, ao contrário do observado para parasitóides (REIERSON; RUST; PAINE, 2005 e TEE; SAAD; LEE, 2011).

Pouco se sabe sobre o período de persistência de fungos entomopatogênicos em esgotos, mas resultados mostram que B. bassiana e M. anisopliae podem sobreviver por longos períodos no ambiente, como vinte e oito dias em superfícies tratadas com suas suspensões (MNYONE et al., 2009) e até seis meses em solo (COOMBES et al., 2013).

Figura 5. Porcentagens de mortalidade total, mortalidade confirmada pelo fungo e extrusão do fungo em fêmeas de Periplaneta americana submetidas a diferentes tratamentos em esgoto dos experimentos em

Piracicaba/SP, Brasil. Médias originais ± erro padrão. Análise estatística realizada com dados transformados em arcoseno √𝑥⁄ . Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05).

Experimento 1 Experimento 2 Porc en tag em (%) Porc en tag em (%)

O tempo de morte pelo fungo não foi bom indicador de diferenças entre os isolados de fungos pulverizados nas localidades de Jaboticabal (experimento 1: df = 1, p = 0,2832 F =1,70 e experimento 2: df = 1, p = 0,7699, F = 0,10) e Piracicaba (experimento 1: df = 1, p 0,9941 F =0,00 e experimento 2: df = 1, p = 0,0811, F = 6,709) (Figura 6).

Figura 6. Tempo de morte pelo fungo de fêmeas de Periplaneta americana

submetidas a diferentes tratamentos em esgoto urbano em dois experimentos nos municípios de Jaboticabal/SP e Piracicaba/SP, Brasil. Médias originais ± erro padrão. Análise estatística realizada com dados transformados em √𝑥 + . Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05).

O tempo de morte para os fungos variou de cerca de 5 a 12 dias (Figura 6), sendo muito próximo ao encontrado em laboratório (3 a 12 dias) e no estudo realizado por Mnyone et al. (2009). Esse resultado evidencia que o tempo de morte não variou entre espécies de fungo e o ambiente, mostrando ser uma característica inerente do agente patogênico.

A pulverização com o nebulizador a frio não interferiu na viabilidade dos conídios de ambos os fungos, mas houve diferenças entre tratamentos (Tabelas 4).

Te m po d e m or te (d ia s) Te m po de m orte (di as )

Tabela 4. Resultados da análise de variância (valor de p) para a variável viabilidade

dos fungos Metarhizium anisopliae JAB 68 e Beauveria bassiana IB-CB 35 antes e após aplicação com nebulizador a frio.

Fontes de variação g.l. Valores de p _Viabilidade

Tratamento 1 0,0026

Momento 1 0,9351

Tratamento*Momento 1 0,3724

Erro 44

Coeficiente de variação (%) 1,80

Antes da aplicação a suspensão contendo o isolado IBCB 35 de B. bassiana apresentou maior viabilidade do que JAB 68 de M. anisopliae, mas sem diferenças após a nebulização (Tabela 5).

Tabela 5. Porcentagem de conídios viáveis de Metarhizium anisopliae JAB 68 e Beauveria bassiana IBCB 35 antes e após a técnica de nebulização a

frio.

Tratamentos Viabilidade (%)

Antes Após

M. anisopliae + Tween 80® _{0,1% 97,00 aA 97,50 aA}

B. bassiana + Tween 80® 0,1% 99,08 aB 98,67 aA

Médias seguidas de mesmas letras minúsculas na linha e maiúsculas na coluna não se diferem significativamente pelo teste Tukey (p≤0,05).

A porcentagem de conídios viáveis após aplicação por nebulização de ambos os fungos foi superior a 97%. O resultado encontrado é satisfatório, pois a quantidade de conídios viáveis ideal para uso de entomopatógenos como mico inseticida deve ser de no mínimo de 94% (LOPES et al., 2013). O equipamento de aplicação mostrou ser adequado para a aplicação de caldas fúngicas para o controle de fêmeas de P. americana em esgoto.

3.3. Análise genética de populações de P. americana

Foram geradas 128 bandas, das quais 113 (88%) foram polimórficas. O valor encontrado foi maior do que em outro estudo da mesma espécie, na Colômbia (68%) (JARAMILLO-RAMIREZ et al., 2010) e para populações de Helicoverpa armigera (Hübner, 1805) (45%) (YENAGI et al., 2012).

As populações se separaram em dois grupos correspondentes às suas localidades, sendo que todos os ramos do dendrograma apresentaram bootstrap com 100% de confiabilidade (Figura 7). A média da diversidade genética interpopulacional foi 0,335 e variou de 0,265 a 0,286 para Jaboticabal e Piracicaba, respectivamente. Foi possível observar mais subdivisões no município de Jaboticabal do que em Piracicaba (Figura 7).

Segundo a AMOVA, a porcentagem de variação interpopulacional foi menor do que dentro das populações. Ela correspondeu a 17,69% entre cidades, cujo Fst foi equivalente a 0,177 (p<0,0001) e 82,31% dentro das populações. O Fst para Jaboticabal foi equivalente a 0,108 e 0,074 para Piracicaba (p<0,0001). Esses dados mostram alto nível de segregação interpopulacional, baixa e moderada diferenciação para Piracicaba e Jaboticabal, respectivamente, segundo Wright (1978). Essas diferenças intrapopulacionais e interpopulacionais podem ser o motivo das diferentes respostas acerca da mortalidade de P. americana ocasionada pelos fungos entomopatogênicos no presente trabalho.

Essas diferenças inter e intrapopulacionais podem estar correlacionadas com a tolerância da praga, ou ainda a genes de resistência ao agente microbiano. Evento semelhante já foi observado em populações de S. frugiperda de diferentes localidades com diferenças em sua suscetibilidade ao patógeno B. thuringiensis (MONNERAT et al., 2006).

Apesar de ser uma espécie de ampla distribuição geográfica, P. americana apresenta baixa mobilidade, tendo em vista a separação populacional por localidade, conforme já mostrado por Jaramillo-Ramirez et al. (2010). Os valores de Fst obtidos no presente estudo foram maiores do que para as populações de P. americana da Colômbia, tanto entre cidades (0,13) quanto dentre as localidades (0,87) (JARAMILLO-RAMIREZ et al., 2010).

O fluxo gênico (Nm) foi maior em Piracicaba (3,15), seguido de Jaboticabal (2,05) e entre localidades (1,16). Isto evidencia maior número de indivíduos migrantes por geração no município de Piracicaba, que corresponde à população de laboratório. A migração de P. americana nos municípios de Jaboticabal e Piracicaba, bem como entre eles foram maiores do que as observadas para cidades da Colômbia (Nm variando de 1,6 a 2,6) (JARAMILLO-RAMIREZ et al., 2010).

Figura 7. Agrupamento “neighbor-joining” de indivíduos das populações de

4. CONCLUSAO

O isolado JAB 68 de M. anisopliae é mais eficiente do que IBCB 35 de

Beauveria bassiana no controle de fêmeas de P. americana em laboratório e em

esgotos urbanos, com potencial de uso em campo. Os conídios desses fungos não perdem viabilidade após aplicação por nebulização a frio. As populações de Jaboticabal e Piracicaba de P. americana são diferentes geneticamente e apresentam diferenças quanto à suscetibilidade aos isolados das espécies de fungos utilizados.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALVES, S. B.; PEREIRA, R. M. Distúrbios fisiológicos provocados por entomopatógenos. In: ALVES, S. B. Controle microbiano de insetos. Piracicaba:

FEALQ. 1998. 2ed. cap. 2, p. 39-54.

BABU, M. N.; SHANKAR, U. V. R.; PADMAJA, V. Insecticidal activity of the entomopathogenic fungus and the strategy of horizontal transmission for control of cockroaches. International Journal of Plant, Animal and Environmental Sciences. London, v. 4, n. 1, p. 159-166, 2014.

BUCZKOWSKI, C. Urban Pest Management: the need for a correct mixture of knowledge and practice. In: DHANG, P. Urban Insect Pests: sustainable

management strategies. Wallingford: C.A.B. International; 2014. 1ed., cap.13, p. 195- 204.

BUGEME, D. M.; KNAPP, M.; BOGA, H. I.; EKESI, S.; MANIANIA, N. K. Susceptibility of developmental stages of Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae) to infection by Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae (Hypocreales: