KULLANILARAK ELISA GELİŞTİRİLMESİ EXPRESSION OF NONSTRUCTURAL S PROTEIN (NSs) OF CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER (CCHF) VI- RUS IN PROKARYOTIC SYSTEM AND THE ROLE OF NSs IN CCHF VIRUS REPLICATION Günsu AYDIN Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, Temmuz 2019 Danışman: Prof. Dr. Aykut ÖZDARENDELİ Erciyes University, Graduate School of Health Sciences, Department of Microbiology M.Sc. Thesis, July 2019 Supervisor: Prof. Dr. Aykut ÖZDARENDELİ ÖZ Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı (KKKAH), Çin’nin batısından Güney Asya’ya; Orta Doğu'dan Güneydoğu Avrupa'ya ve Afrika’ya kadar geniş bir alanda yayılım gösteren, çoğunlukla insanlarda görülen kene kaynaklı viral bir enfeksiyondur. KKKAH virüs genomu, sırasıyla nükleokapsit proteinini, Gn ve Gc glikoproteinlerini ve RNA-bağımlı RNA polimerazını kodlayan küçük (S), orta (M) ve büyük (L) üç negatif-polariteli RNA segmenti içerir. Ek olarak, Bunyavirales takımının bazı üyeleri M segmentinde (NSm olarak adlandırılan) veya S segmen- tinde (NSs olarak adlandırılan) yapısal olmayan prote- inleri kodlar. KKKAH virüsü NSs’i, S segmentinin pozitif polariteli kısmından kodlanır. Hemen hemen tüm KKKAH virüsü suşlarında NSs’e ait bir açık okuma çer- çevesi bulunur ve bu durum, NSs'lerin korunmuş bir biyolojik fonksiyona sahip olabileceğini göstermektedir. Bu çalışmanın amacı, KKKAH virüsü ile enfekte olmuş hücrelerde viral yapısal olmayan S proteininin varlığını ve proteinin replikasyon üzerine etkilerini araştırmak- tır. Bu amaçla, NSs geni çoğaltıldı ve pCOLD TF-NSs olarak adlandırılan pCOLD TF plazmidine klonlandı. Rekombinant protein, E. coli C43 (DE3) hücrelerinde eksprese edilip püri%iye edildi. Enfeksiyon sırasında NSs'in ekspresyon seviyelerini incelemek için hücreler, KKKAH virüsü ile enfekte edildi ve rekombinant NSs proteinine karşı oluşmuş hiperimmun serumlar kullanı- larak IFA testi yapıldı. IFA sonuçları, NSs ekspresyonu- nun enfekte olmuş hücrelerde, erken dönemde, enfeksi- yondan 6 saat sonra belirlendiğini gösterdi. NSs’in varlı- ğı, KKKAH pozitif insan serumları ile problanarak im- münoblotlama ile doğrulandı. Ayrıca hedef hücrelerin proteazom inhibitörü olan MG132 ile muamele edilmesi NSs proteininin ekspresyonunu arttırdığını gösterdi. Bu şekilde, NSs’in proteazom tarafından degredasyonu, KKKAH virüs enfeksiyonuna karşı erken bir hücre içi savunmayı temsil etmektedir. Küçük interferans RNA (siRNA), RNA interferans (RNAi) yolağında bir rol oyna- makta ve spesi%ik viral genlerin ekspresyonunu azalt- maktadır. Bu çalışmada NSs’e karşı spesi%ik siRNA'ların KKKAH virüs üretimini güçlü şekilde inhibe ettiğini belirlenmiştir. Bu veriler, siRNA'nın uygulanmasının, KKKAH’nın antiviral tedavisi için ümit verici olabileceği- ni göstermiştir. Son olarak, indirekt ELISA geliştirmek için rekombinant NSs antijeninin kullanımı araştırıldı; ancak serum numuneleri paneli kullanarak KKKAH en- feksiyonunun tespiti sağlanamadı.
ABSTRACT
Crimean–Congo hemorrhagic fever (CCHF) is the most widespread tick-borne viral infection of humans, occur- ring across a vast area from western China through southern Asia and the Middle East to southeastern Eu- rope and throughout most of Africa. The CCHFV genome contains three negative-sense RNA segments, small (S), medium (M), and large (L), encoding the nucleocapsid protein, Gn and Gc glycoproteins, and the RNA- dependent RNA polymerase, respectively. In addition, several Bunyavirales members encode nonstructural proteins, either on the M (termed NSm) or S segment (termed NSs) of the genome. The NSs of CCHFV is enco- ded by the positive-sense of the S segment genome. The ORF of NSs is conserved in almost all strains of CCHFV, indicating that NSs might have a conserved biological function. The aim of this study is to investigate the pre- sence of NSs in CCHFV-infected cells and to investigate its effects on replication. For this purpose, the gene en- coding NSs was ampli%ied and cloned into pCOLD TF plasmid, called pCOLD TF-NSs. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 C43(DE3) and was puri- %ied. To examine the expression of NSs during infection, cells were infected with CCHFV and were subjected to immuno%luorescence assay (IFA) with the hyperimmu- ne sera against the recombinant NSs protein. IFA results indicated that the expression of NSs was determined as early as 6 hours post infection. The presence of NSs which was probed with CCHF positive human sera was also con%irmed by immunoblotting. We also showed that treatment of target cells with the proteasome inhi- bitor MG132 increased the expression of NSs protein. Thus, degradation of NSs by the proteasome represents an early intracellular defense against CCHF virus infec- tion. Short interfering RNA (siRNA) plays a roles in the RNA interference (RNAi) pathway and decreases the expression of speci%ic viral genes. Here we determined that speci%ic siRNAs against the NSs potently inhibited CCHF virus production. This data showed that the appli- cation of siRNA might be promising for antiviral treat- ment of CCHF. Lastly, we examined the utility of recom- binant NSs antigen for developing indirect ELISA but we were not able to achieve the detection of CCHF infection using a panel of serum samples. Anahtar kelimeler: KKKAH virüsü, Yapısal olmayan S protei- ni (NSs), küçük interferans RNA (siRNA) Keywords: CCHFV, Non structural S protein (NSs), small inter- fering RNA
Sağlık Bilimleri Dergisi (Journal of Health Sciences) 2019 ; 28 (2) GEBELERDE EGZERSİZİN FİZİK PROFİL VE BAZI FİZYOLOJİK PARAMETRELER ÜZERİNE ETKİSİ THE IMPACT OF EXERCISE IN PREGNANT WOMEN ON PHYSICAL PROFILE AND CERTAIN PHYSIOLOGICAL PARAMETERS Sevinç MUTLU Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Fizyoloji Anabilim Dalı, Egzersiz Fizyolojisi Yüksek Lisans Tezi, Temmuz 2019 Danışman: Prof. Dr. Bekir ÇOKSEVİM Erciyes University, Graduate School of Health Sciences Department of Physiology, Exercise Physiology MSc. Thesis, July 2019
Supervisor: Prof. Dr. Bekir ÇOKSEVİM ÖZ
Bu çalışmada, egzersiz uygulamalarının gebe ve gebe olmayan gönüllülerde %izik pro%il ve bazı %izyolojik para- metreler üzerine etkisinin araştırılması amaçlandı. Kayseri I/li Aile Hekimliği birimine kayıtlı 18-35 yaş aralığında gebe ve gebe olmayan toplam 64 gönüllü ile bu çalışma gerçekleştirildi. Gruplar kontrol (K=12), kontrol egzersiz (KE=12), kontrol gebe (KG=20) ve gebe egzersiz (GE=20) olarak ayrıldı. Gruplara ilk değerlen- dirme, bilgilendirme, anket süreci sonunda ön test veri- leri için %iziksel, %izyolojik ve metabolik ölçümler yapıldı. Egzersiz gruplarına 2 gün/hafta ve 30 dk/gün bir ay prenatal egzersiz (Borg 12) uygulandı. Egzersizin başın- da ve sonunda kardiyak ölçümler (kan basıncı, kalp atımı, SPO2, vücut sıcaklığı ve fetal kalp atımı) alındı. Program bitiminde ön test için alınan ölçümler son test için tekrarlandı ve gönüllülerin doğum süreçleri takip edildi. Veriler ANOVA, Kruskal- Wallis, Mann-Whitney U, Dunn-Bonferroni, Wilcoxon testleri uygulanarak kar- şılaştırıldı ve p<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
K/KE’ye göre KG/GE’nin %izik pro%il ölçümleri, yatar durumda ve uykuda geçirilen sürelerde artan yönde anlamlı bulundu. KE’ye göre GE’nin kan basıncı, kan oksijen doygunluğu, vücut sıcaklığı, %iziksel aktivite düzeyi azalan yönde anlamlı bulunurken kalp atım sayı- sı artan yönde anlamlı bulundu. KG’ye göre egzersiz sonrası GE’de fetal nabız sayısında artış görüldü. KG’ye göre GE’nin doğum sonuçları arasında anlamlı fark bu- lunmazken, GE’de normal doğum yapan gebe sayısı fazla olduğu tespit edildi.
Sonuç olarak; gebelerde vücut kompozisyonunun fetal büyüme-gelişmeye bağlı oluştuğu, beslenme ve günlük aktivite düzeyi, kardiyovasküler ve metabolik fonksi- yonları etkilediği ve prenatal egzersiz uygulamalarının, normal doğumu teşvik ettiği değerlendirildi.
ABSTRACT
This study investigated how exercise in%luenced physi- cal and physiological characteristics of pregnant and non-pregnant women.
There were 64 participants aged between 18–35 regis- tered in the Family Practice Unit of Kayseri. The groups were divided into control (C = 12), control exercise (CE = 12), control pregnant (CP = 20), and pregnant exer- cise (PE = 20). Physical, physiological, and metabolic measurements were performed in the groups for pre- test data following the initial assessment, informing and questionnaire. Exercise groups practiced prenatal exercise (Borg 12) for 1 month 2 days/week, 30 min/ day. Cardiac measurements (blood pressure, heart rate, SPO2, body temperature, fetal heart rate) were made before and after exercise. Pretest measurements were repeated following the program for posttest and deliv- ery processes were monitored. ANOVA, Kruskal-Wallis, Mann-Whitney U, Dunn-Bonferroni, and Wilcoxon were used for data comparison. Statistical signi%icance was taken as p< 0.05. Physical pro%ile measurements of CP/ PE were more signi%icant in lying position and during sleep than C/CE. Blood pressure, blood oxygen satura- tion, body temperature, and physical activity levels were decreasingly signi%icant and heart rate was in- creasingly signi%icant in PE compared to CE. Fetal heart rate increased in PE following exercise compared to CP. Delivery results of CP and PE did not have any signi%i- cant difference; however, there were more women who had normal delivery in PE. According to the results, body composition in pregnant women was formed based on fetal development and improvement, it affected nutrition, daily activity level, cardiovascular, and metabolic functions, and prenatal exercise promoted normal delivery.
Anahtar kelimeler: Prenatal egzersiz, Fizyolojik pro%il, Meta-
bolik holter
Keywords: Prenatal exercise, Physiological pro%ile, Metabolic
OTİZMDE TELOMER BÖLGELERİ NE KADAR ETKİLİDİR?