Kamusal Alanın En Önemli Özellikleri: Aleniyet, Kolektivite, Rasyonellik

Um dos pontos cruciais em um estudo envolvendo a técnica de microarranjos de DNA é a qualidade e quantidade do RNA disponível para a análise. Um dos principais responsáveis pela má qualidade de preparações de RNA é a contaminação com a enzima RNase, seja externa ou do próprio organismo. Desse modo, tanto os utensílios utilizados para a extração quanto os reagentes utilizados devem ser isentos dessa enzima. Assim, os protocolos de extração trazem, na sua grande maioria, compostos que inibem a ação enzimática. Um desses produtos, o reagente Trizol (Invitrogen), é um dos mais largamente utilizados para a extração de RNA total, tanto de plantas, como de animais e de microrganismos.

No início do presente trabalho, as extrações de RNA foram realizadas utilizando o reagente Trizol, seguindo as instruções do fabricante. Na Figura 10.1 são apresentadas três amostras de RNA extraídas a partir de Xac multiplicada em meio de cultura NA líquido e quatro amostras obtidas a partir de Xac multiplicada no mesmo meio de cultura sólido. Observa-se que o RNA obtido à partir de células cultivadas em meio de cultura sólido possui uma maior contaminação com DNA (banda de maior tamanho no gel), enquanto que em meio de cultura líquido há uma banda de maior intensidade, indicada pelos símbolos “????”. Além disso, em ambas as amostras verifica-se que as duas bandas referentes aos RNAs ribossômicoss 23S e 16S apresentam a mesma mobilidade.

No entanto, a reprodutibilidade das extrações, bem como extração de RNA de Xac cultivadas em folhas de laranjeira deixava a desejar. A Figura 10.2 mostra amostras de RNA total extraídas a partir de células bacterianas multiplicadas em folhas de laranjeiras Pêra, com um, dois e três dias da inoculação, e em meio de cultura. Verificou-se, experimentalmente, que com um e dois dias da inoculação foi muito difícil obter RNA, nestas condições, utilizando Trizol. Com dois, três e cinco dias (não mostrado) foi possível obter RNA da bacteria multiplicada in planta, mas, com dois

Figura 10.1: Perfil eletroforético de 1 µg de RNA total, extraído com Trizol, de células de Xac multiplicadas em meio de cultura NA líquido (painel da direita) e NA sólido (painel da esquerda). A amostra presente em cada poço representa extrações independentes.

Figura 10.2: Perfil eletroforético de 1 µg de RNA total, extraído com Trizol, de células de Xac multiplicadas em meio de cultura NA (MS) e de células de Xac extraídas de folhas de laranjeira 1 (1d), 2 (2d) e 3 (3d) dias após a inoculação. A posição dos RNAs ribossomais 23S e 16S é indicada.

dias a qualidade foi uma das piores. Observa-se a presença de DNA, bem como de uma banda desconhecida (?), além de três bandas de RNAr, que devem corresponder aos RNAs ribossomais 23S, 16S e 5S. Nas amostras de folhas nota-se um arraste de RNA mais intenso que nas provenientes de meio de cultura, caracterizando uma possível degradação.

A presença de DNA genômico deve ser totalmente eliminada da solução de RNA, uma vez que o mesmo pode ser marcado com fluoróforo e resultar em falsos positivos. Este procedimento implica em manipular a solução de RNA novamente, o que implica em mais perdas, tanto de qualidade quanto de quantidade (Figura 10.3). Logo, para se obter uma quantidade razoável de RNA suficiente para uma análise, há que se partir de grandes quantidades iniciais de RNA, uma vez que as perdas são significativas (dados não mostrados).

Apesar de ter sido possível utilizar RNA total de Xac extraído com Trizol para análise de “Northern Reverso” (Ver Primeira Parte desta Tese), desde que realizada logo após a extração, esse mesmo RNA não foi adequado para análise de microarranjos de DNA, principalmente aqueles

10.1 Extração de RNA total de Xanthomonas axonopodis pv. citri 86

Figura 10.3: Perfil eletroforético de 5 µL de RNA total de Xac, extraído com Trizol, imediatamente após ter sido purificado para eliminar o DNA contaminante, conforme seção 4.9.2.

extraídos de plantas. Após um longo período tentando padronizar o protocolo de extração de RNA total com Trizol de modo a obter material adequado à técnica de microarranjos de DNA, optou- se por testar outros dois conjuntos de reagentes existentes no mercado e específicos para extração de RNA total: ChargeSwitch Total RNA Cell Kits, produzido pela Invitrogen e Illustra RNAspin produzido pela Amersham Biosciences.

O conjunto de reagentes ChargeSwitch Total RNA Cell Kits não foi satisfatório (resultados não apresentados). Por outro lado, o conjunto de reagentes produzido pela Amersham Biosciences, Illustra RNAspin, possibilitou a extração de RNA de excelente qualidade (Figura 10.4). Nota-se que o uso desses reagentes diminuíram a presença de bandas de RNA de baixo peso molecular, ou produto de degradação, da preparação. Além das bandas de baixo peso molecular, as amostras extraídas com Trizol apresentam impurezas que ficam retidas no local de aplicação da amostra no gel. Além disso, pode ser verificado na Figura 10.4 que as amostras previamente extraídas com Trizol e armazenadas, degradaram consideravelmente. Uma outra vantagem do conjunto de reagentes RNAspin é o tratamento com DNase I já durante o processo de extração, fato que facilita o trabalho, minimiza os custos e diminui o número de vezes em que se necessita manipular as amostras, diminuindo, com isso, as chances de degradação ou perda do RNA. Dessa maneira, RNA de Xac multiplicada em meio de cultura XAM1, em meio de cultura NA e em plantas foi, então, obtido por este método e utilizado para hibridização das lâminas de microarranjos.

Outra desvantagem do Trizol era a necessidade de uma grande quantidade de folhas de laranjei- ras inoculadas para poder obter uma quantidade mínima de RNA de Xac. Esse fato demandava um período longo infiltrando folhas, de 4 a 6 horas, o que inviabilizava o estudo de Xac multiplicada em folhas de laranjeira por períodos menores que 72 h. Considerando que a quantidade de células de Xac nas folhas com 1 ou 2 dias de crescimento é muito pouca, a quantidade de folhas a ser infil-

Figura 10.4: RNA total de Xac extraído com o conjunto de reagentes RNAspin (Amersham Biosciences) e com o regente Trizol (Invitrogen). As amostras extraídas com Trizol estão indicados por um “T” e as com RNAspinestão indicadas por um “R”. O retângulo pontilhado destaca extrações recentes. As demais amostras retratam o estágio das mesmas após um período de armazenamento. A seta tracejada indica a presença de RNA de baixo peso molecular ou degradação. As setas pontilhadas indicam a presença de sujeiras retidas no gel no ponto de aplicação das amostras. dai = dias após a inoculação.

trada tornou esse experimento inviável com o protocolo de extração à base de Trizol. Esse problema também foi resolvido com o conjunto de reagentes RNAspin, uma vez que, com esses reagentes, é possível a extração de RNA a partir de uma pequena quantidade de células. Desse modo, além de 3 e 120 h, RNA de Xac multiplicada em folhas de laranjeira por 24 h também foi possível de ser obtido.