1.3. KAMUSAL ALAN YAKLAŞIMLARI
1.3.1. Immanuel Kant’ta Kamusallık: Aleniyet ve Akıl
Procurou-se construir um microarranjo de DNA que pudesse representar o maior número pos- sível das ORFs anotadas para o genoma de Xac (20) e que apresentasse um baixo custo. Logo, resolveu-se utilizar os clones oriundos do projeto genoma da própria Xac para tal, pois assim poder- se-ia utilizar os oligonucleotídeos universais (SP-6 e T7 ou M13R e M13F) para amplificação por PCR das ORFs presentes nos clones, visto ser este um dos custos mais elevados no processo de
10.2 Construção do microarranjo de DNA 88
construção de um microarranjo de DNA a partir de PCR, para a produção das sondas a serem fixa- das nas lâminas. No entanto, antes da produção de tais sondas, necessário foi encontrar, confirmar e preparar os clones para as amplificações.
O projeto genoma de Xac gerou duas coleções de bibliotecas “shotgun” independentes, com insertos entre 500 e 4.000 pb, obtidas a partir de uma mesma preparação inicial de DNA, contendo, no total, 46.462 clones. Desse modo, por meio de análise in silico foram selecionados 4.421 clones representativos de 3.084 ORFs. Um clone foi considerado representativo de uma dada ORF quando a maior parte do seu inserto era composta por um gene de interesse, mesmo que no restante da seqüência existissem outras seqüências. Esse procedimento não permitiu identificar clones que representassem 1.229 ORFs.
Os insertos presentes nos clones foram classificados em quatro tipos (Figura 10.5), quais sejam:
• A – o inserto contém a ORF completa, podendo ou não ser flanqueada por outras seqüências gênicas;
• B – o inserto é a própria ORF de interesse ou parte desta. Não há contaminação com outras seqüências;
• C – parte da ORF de interesse está ligada diretamente ao vetor pelo seu lado esquerdo. O restante da seqüência do inserto pode ser regiões intergênicas ou parte de outra ORF;
• D – parte da ORF de interesse está ligada diretamente ao vetor pelo seu lado direito. O restante da seqüência do inserto pode ser regiões intergênicas ou parte de outra ORF.
Inicialmente, os 4.421 clones estavam divididos entre 2.055 (∼46,5%) do tipo A, 463 (∼10,5%) do tipo B, 827 do tipo C (∼19,0%) e 1.124 do tipo D (∼25,5%). Cabe salientar que o tamanho médio das regiões intergênicas de Xac é de 200 pb, o que diminui a probabilidade de ocorrência de hibridização cruzada.
Após definição dos clones a serem utilizados no projeto, todas as placas que continham pelo menos um clone de interesse foram replicadas e os mesmos foram rearranjados em 47 placas, re- presentando 72% de todos os possíveis genes que compreendiam o genoma de Xac.
Durante as análises iniciais foi verificado que 5% dos clones não se multiplicavam em meio de cultura, impossibilitando o seu aproveitamento. Dentre aqueles cujo plasmídeo foi possível extrair,
Figura 10.5: Esquema ilustrando os quatro tipos de insertos encontrados nas bibliotecas do projeto genoma de Xac. As setas representam o local onde os oligonucleotídeos iniciadores irão parear durante o processo de amplificação desses insertos. A – o inserto contém a ORF completa; B – o inserto é a própria ORF; C e D – parte da ORF de interesse está ligada diretamente ao vetor por um de seus lados. Nos insertos dos tipos A, C e D existe a presença de outras seqüências de DNA que podem ou não ser parte de outras ORFs. Dois pequenos segmentos de reta paralelos dispostos na diagonal indicam ruptura da seqüência de nucleotídeos da ORF de interesse ou do vetor.
10% apresentaram um tamanho de inserto diferente do tamanho esperado e em 15% dos casos não houve amplificação.
Uma vez que muitos insertos apresentaram tamanhos de fragmentos amplificados diferente do esperado, resolveu-se resseqüenciar todos os clones e comparar os resultados com o genoma de Xac, a fim de confirmar a seqüência de nucleotídeos de cada um dos clones em uso.
O resseqüenciamento dos clones mostrou que 28% apresentavam endereçamento errado, en- quanto que cerca de 12% estavam contaminados ou a bactéria contendo o plasmídeo havia morrido durante o processo de estocagem. A contaminação foi evidenciada pelo péssimo resultado obtido pelo seqüenciamento, o qual apresentava picos duplos.
Os clones que apresentaram endereçamento correto foram novamente rearranjados em 28 pla- cas, as quais contêm 2.653 clones capaz de cobrir o mesmo número de ORFs de Xac. A validação desse último rearranjo, por meio do resseqüenciamento de uma coluna de cada placa, confirmou todos os endereçamentos.
Outras perdas ocorreram durante a extração de DNA plasmidial das amostras (Figura 10.6) contidas nas 28 placas, durante as reações de PCR (Figura 10.7), e durante o processo de purifi- cação desses produtos da PCR (Figura 10.8), fazendo com que o número de clones úteis baixasse para 2.639 seqüências de DNA. Uma análise destes clones revelou que, de todas as 104 subcate-
10.2 Construção do microarranjo de DNA 90
gorias anotadas em Xac, apenas 17 delas possuem menos do que 50% das ORFs que as compõem representada no microarranjo de DNA de Xac.
A este conjunto de seqüências foi somado mais 34 ORFs de interesse, obtidas por meio da amplificação de DNA genômico de Xac utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos para tais ORFs. Esse conjunto de 2.673 seqüências de DNA, após serem purificadas, foi rearranjado em placas de 384 poços, perfazendo um conjunto de sete placas.
Figura 10.6: Perfil eletroforético de 3 µL de DNA plasmidial isolado de clones contendo DNA de Xac. O gel foi corado com brometo de etídio (10 mg/mL) e a primeira coluna de cada um dos pentes do gel refere-se ao padrão de tamanho molecular 1 Kb DNA Ladder (Gibco BRL).
Desse modo, o microarranjo de DNA de Xac amostra 2.673 ORFs, possui 384 controles positi- vos e 312 controles negativos. Uma vez que existem algumas ORFs de Xac duplicadas, resultando em mais 87 pontos, o microarranjo de DNA de Xac ficou assim constituído: 2.673 ORFs, 87 ORFs repetidas, 312 controles negativos (DMSO) e 384 controles positivos (Lucidea Universal ScoreCard, Amersham Biosciences), totalizando 3.456 pontos em cada um dos arranjos. Logo, o microarranjo é formado por 6.912 pontos.
10.2.1 Validação do microarranjo de DNA
A fim de verificar se as lâminas produzidas com os microarranjos de DNA estavam com boa qualidade foi realizada uma marcação utilizando DNA genômico de Xac como alvo para as sondas do microarranjo (hibridização DNA–DNA). Convém ressaltar que as seqüências conhecidas são as seqüências de DNA que estão fixadas nas lâminas. Neste caso, essas seqüências são as sondas.
Figura 10.7: Perfil eletroforético de 3 µL de DNA amplificado por PCR a partir de DNA plasmidial. O gel foi corado com brometo de etídio (10 mg/mL) e a primeira coluna de cada um dos pentes do gel refere-se ao padrão de tamanho molecular 1 Kb DNA Ladder (Gibco BRL).
Estas sondas irão então identificar alvos desconhecidos que serão hibridizados, sejam eles DNA ou RNA (179, 189).
A análise das imagens obtidas (Figura 10.9) permitiu verificar que, dos 2.673 pontos que repre- sentam ORFs de Xac, 2.365 pontos, (85,7% do total) apresentaram sinal de hibridização maior que a emissão de fundo. Esse resultado permite concluir que as lâminas apresentam boa qualidade e que o processo de hibridização, assim como os reagentes e equipamentos empregados no mesmo, esta- vam funcionando perfeitamente. No entanto, verifica-se que a marcação com o fluoróforo Cy5™ ficou com qualidade inferior à marcação realizada com o fluoróforo Cy3™.