İnsan Kaynakları Yönetimi Kavramı

Os animais depositados nos filtros de membrana de acetato-celulose foram acondicionados em frascos de Teflon com tampa, previamente deixados de molho em HNO3 6M por 7 dias, onde foram adicionados 200µL de HNO3 ultra-puro (J.T.Baker) e encaminhados à estufa a 90°C por 48 horas, para digestão das amostras e posterior leitura em polarógrafo “EG&G Instruments”, modelo 303A SMDE através da técnica DPASV (polarografia anódica de pulso diferencial).

Para as determinações de cobre no polarógrafo, o pH das amostras foi ajustado para 2,0 e utilizado tampão inorgânico KCl/HCl (0,09/0,01M), que também foi empregado como eletrólito de suporte, fornecendo uma força iônica de 0,2M. Todas as determinações foram feitas através do método de “adição de padrão”. Dessa maneira, consegue-se minimizar problemas de variação entre amostras e os erros experimentais são menores são menores que os do procedimento clássico, do uso de curvas de calibração. O potencial inicial foi de –0,7V e o final de –0,09V. Altura do pulso de 50mV. Os valores, obtidos em intensidade de corrente (nA), foram transformados para concentração molar através da curva de calibração das adições.

A partir das leituras de metal total presente nos animais, foi calculada a quantidade de metal acumulado por unidade de peso seco de C. cornuta (ηgCu µgPS-1).

C

Efeito da ingestão de exopolissacarídeos de Anabaena spiroides KLEBAHN sobre a bionomia de Ceriodaphnia cornuta SARS.

Rodrigo Brasil Choueri1,2; Maria da Graça Gama Melão2; Ana Teresa Lombardi3; Armando Augusto Henrique Vieira4

1

Mestrando pelo Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Recursos Naturais da Universidade Federal de São Carlos, São Carlos-SP, Brasil.

2

Laboratório de Plâncton, Departamento de Hidrobiologia, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos-SP, Brasil.

3

Centro de Estudos do Mar, Universidade Federal do Paraná, Pontal do Paraná-PR, Brasil.

4

Departamento de Botânica, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos-SP, Brasil.

Correspondência: Maria da Graça Gama Melão, Lab. de Plâncton, Dep. de Hidrobiologia, Universidade Federal de São Carlos – Rodovia Washington Luís, km 235, CEP 13565-905 São Carlos-SP, Brasil. E-mail: [email protected]

Título abreviado: Ingestão de exopolissacarídeo de Anabaena spiroides por

Ceriodaphnia cornuta

Palavras-chave: Exopolissacarídeos algais; Ceriodaphnia cornuta; Bionomia;

Resumo

1. Grande parte das espécies de microalgas excreta materiais orgânicos no ambiente. Entretanto, pouco se sabe sobre a utilização desses exudatos algais como fonte alimentar para organismos zooplanctônicos e seu impacto nas cadeias tróficas de ambientes aquáticos.

2. Neste estudo investigou-se a utilização de exopolissacarídeo de Anabaena spiroides KLEBAHN (Cyanophyceae) como alimento por Ceriodaphnia cornuta SARS (Cladocera) e sua capacidade de sustentar o crescimento e a reprodução desses organismos.

3. Para tanto, foram analisados parâmetros bionômicos (idade e comprimento da primípara, comprimento máximo, número total de ovos e neonatas, porcentagem de eclosão, tempo de desenvolvimento embrionário e intervalo de produção de ovos) de indivíduos mantidos sob temperatura de 25°C ± 1 e fotoperíodo de 12/12 horas luz/escuro, desde o nascimento até a idade de 15 dias. O exopolissacarídeo foi fornecido à concentração de 15mg L-1 (3,73mgC L-1) e o meio experimental foi trocado diariamente. Como base para comparação, foram observados parâmetros bionômicos de animais tratados com a clorofícea Scenedesmus

bijugus e animais alimentados com seston do Reservatório de Barra Bonita, sob as mesmas

condições dos animais tratados com exopolissacarídeo.

4. Os organismos zooplanctônicos consumiram o exopolissacarídeo de A. spiroides nas condições experimentais e apresentaram expressivo sucesso reprodutivo e crescimento

somático acentuado, o que revela que esse composto é potencialmente capaz de suprir as necessidades nutricionais mínimas para sustentar uma população de C. cornuta.

Introdução

Grande parte das espécies de microalgas excreta materiais orgânicos no ambiente, mas o motivo pelo qual o fazem ainda é muito discutido (Fogg, 1983; Bjørnsen, 1988; Wood & Van Valen, 1990). Entre as funções benéficas desses materiais para o próprio fitoplâncton e para toda a biota aquática, pode-se citar a diminuição da concentração de íons metálicos livres no ambiente (Gorbi et al., 2001; Lombardi & Vieira, 1998a; 1998b; 1999; 2000; Lombardi, Vieira & Sartori, 2002), uma vez que o exudato algal é capaz de quelar esses íons, tornando-os biologicamente indisponíveis e, portanto, minimizando sua toxicidade (Di Giulio et al., 2003). Outro importante papel dos excretados algais seria resultado de uma possível coevolução entre fitoplâncton, bactérias e organismos bacterívoros: em situações de alta intensidade de luz e escassez nutricional, ter-se-ia um aumento na excreção das células fitoplanctônicas, principalmente de carboidratos, o que criaria um meio adequado para o crescimento de bactérias que, por sua vez, serviriam de alimento para organismos bacterívoros remineralizando a matéria orgânica dissolvida e enriquecendo o ambiente (Wood & Van Valen, 1990). O que é ponto comum entre pesquisadores é a capacidade de organismos fitoplanctônicos liberarem no ambiente diversos compostos de baixa massa molecular (Hellebust, 1974), assim como compostos de alta massa molecular, em sua maioria, polissacarídeos (Paulsen & Vieira, 1994). Apesar de haver muitos estudos sobre a função ecológica destes compostos, pouco se sabe sobre a utilização de exudatos algais como fonte alimentar para organismos zooplanctônicos e seu impacto nas cadeias tróficas de ambientes aquáticos, especialmente quando se trata de

ambientes límnicos. Prieto et al. (2001), investigando o consumo de TEP (Transparent

Exopolymer Particles – agregados gelatinosos orgânicos, formados por moléculas de

polissacarídeos) por uma mistura de espécies de copépodos litorâneos marinhos, verificaram que esses agregados não eram utilizados como fonte alimentar pelos animais estudados. Ao contrário, Ling & Alldredge (2003) registraram consumo de TEP pelo copépodo marinho Calanus pacificus. Malej & Harris (1993) verificaram que a presença de exopolímeros de alto peso molecular diminuía o consumo de diatomáceas por copépodos, o que pode sugerir seu uso como fonte complementar de nutrição desses microcrustáceos (Passow & Alldredge, 1999). Em um dos poucos registros para cladóceros de água doce, Stutzman (1995) verificou que colônias de clorofíceas com revestimento gelatinoso, uma das formas de disponibilização dos exopolissacarídeos algais, podem sustentar uma população de Daphnia magna. Assim, visto que são escassas as informações sobre o consumo de exopolissacarídeos algais por parte de organismos zooplanctônicos dulcícolas, o presente trabalho visa contribuir para a compreensão do papel ecológico desses compostos orgânicos nas cadeias tróficas dos ambientes aquáticos.

Neste estudo, investigou-se a utilização de exopolissacarídeo da cianofícea

Anabaena spiroides KLEBAHN como alimento pelo cladócero Ceriodaphnia cornuta

SARS e sua capacidade de sustentar o crescimento e a reprodução destes organismos. Ambas as espécies são comumente encontradas no Reservatório de Barra Bonita - SP, área de estudo do presente trabalho, onde são freqüentes florações de A. spiroides. Para se atingir o objetivo enunciado, parâmetros bionômicos de indivíduos de C. cornuta alimentados com exopolissacarídeo de A. spiroides foram obtidos em condições laboratoriais controladas.

Materiais e métodos

Dados bionômicos de Ceriodaphnia cornuta, tais como tempo de desenvolvimento embrionário, idade e comprimento da primípara, crescimento, fecundidade, porcentagem de eclosão e intervalo na produção de ovos, foram obtidos de 12 animais tratados com exopolissacarídeo de Anabaena spiroides, durante os primeiros 15 dias de vida. O crescimento populacional (r) nesse período foi calculado, a partir de dados de sobrevivência e fecundidade, de acordo com a fórmula (Wetzel, 1983):

r = (Loge Nt – Loge N0).t-1

O experimento foi realizado em laboratório sob uma temperatura de 25±1°C, com fotoperíodo de 12/12 horas luz/escuro (incubadora FANEM 347 CDG).

Os organismos foram coletados no Reservatório de Barra Bonita, São Paulo, Brasil (22° 32’34,5” S, 48° 29’26,4” O), trazidos ao laboratório, onde foram triados, identificados, aclimatados e mantidos em culturas-estoque até o início do experimento.

Neonatas com até 24 horas de vida foram individualizadas em tubos de ensaio contendo 50mL de meio experimental (água mais o alimento fornecido). As observações foram feitas a cada 12 horas com o auxílio de estereomicroscópio Leica MZ6, munido de ocular micrometrada.

Como base para comparação, foram observados parâmetros bionômicos de 12 animais tratados com a clorofícea Scenedesmus bijugus – alimento largamente utilizado em cultivos de cladóceros em laboratório – e de 10 animais tratados com seston do Reservatório de Barra Bonita – condição alimentar semi-natural – sob as mesmas condições dos animais tratados com exopolissacarídeo.

Exopolissacarídeo de Anabaena spiroides

Neste tratamento experimental, os animais foram alimentados com solução alimentar composta de polissacarídeos excretados por A. spiroides, à concentração de 15mg L-1 (aproximadamente 3,73mgC L-1). Para a extração dos exopolissacarídeos, as algas foram cultivadas em meio ASM1 (Gorham et al, 1964), ao qual adicionou-se 500mg L-1 de tampão TRIS, e mantidas em sala aclimatada a 22°C ± 1, com fotoperíodo de 12/12 horas luz/escuro e aeração constante até o início da fase estacionária de crescimento. As culturas foram, então, filtradas em filtros de fibra de vidro (Sartorius GMF 3 – 1,2µm de abertura de malha) para a retirada das células. O filtrado foi concentrado em rotaevaporador a 40°C (Quimis, modelo 344B2) e, posteriormente, dialisado em membranas com poros de 12 a 14KD durante 24 horas em água corrente e 48 horas em água destilada para retirada dos sais e material de baixa massa molecular. Os polissacarídeos resultantes desse procedimento foram, por fim, liofilizados (liofilizador Heto DW3 - 2000) e congelados até o momento do uso.

Para a preparação do meio experimental, os polissacarídeos tiveram sua massa quantificada e foram dissolvidos em água do Reservatório de Barra Bonita filtrada em filtros de microfibra de vidro (Sartorius GMF 3 – 1,2µm de porosidade), previamente autoclavada a 120°C por 30 minutos e com pH acertado para aproximadamente 6,8. A solução foi deixada 12 a 15 horas em agitador magnético (Corning PC 420) para a completa dissolução do exopolissacarídeo. A concentração de carbono orgânico total na água do Reservatório de Barra Bonita, na época em que foi coletada para este experimento, era de 8,29mgC L-1 (António, comunicação pessoal). A solução alimentar foi trocada diariamente durante os experimentos.

Seston

O seston, tratamento experimental que representa condições alimentares próximas àquelas do ambiente natural, foi obtido a partir da filtragem de água do Reservatório de Barra Bonita em rede de 68µm de abertura de malha. Durante o experimento, foram feitas coletas no ambiente a cada 4 dias e a água foi mantida em laboratório em aquários (20L) com aeração constante, sob temperatura de 22°C ± 1 e fotoperíodo de 12/12 horas luz/escuro. Foram quantificados o carbono total, carbono orgânico total e carbono inorgânico da água de Barra Bonita no dia da coleta e após os 4 dias em que foram mantidas no laboratório, a fim de se verificar se, nesse período, houve mudança quantitativa no seston fornecido como alimento aos animais durante os experimentos. A água dos cultivos foi trocada com uma freqüência maior (a cada 12 horas) em relação aos outros tratamentos alimentares (a cada 24 horas), de forma a aproximar as condições experimentais ao que se encontra no ambiente natural.

Suspensão de células de Scenedesmus bijugus

As algas foram cultivadas em meio WC (Guillard & Lorenzen, 1972) em sala aclimatada a 22°C ± 1, com fotoperíodo de 12/12 horas luz/escuro. As algas fornecidas como alimento aos animais estavam em fase de crescimento exponencial. Para a preparação do meio experimental, a cultura algal era centrifugada a 1500rpm por 20 minutos (centrífuga FANEM Excelsa II modelo 206 MP). O sobrenadante era descartado e o precipitado ressuspendido em água reconstituída (U.S. EPA, 1991). Esse procedimento foi realizado para evitar eventuais efeitos tóxicos do meio de cultura algal sobre os animais. A

suspensão concentrada de S. bijugus era diluída a 105céls mL-1 (0,80mgC L-1) – concentração de células amplamente utilizada em cultivos de cladóceros em laboratório – em água do Reservatório de Barra Bonita (8,29mgC L-1 – António, comunicação pessoal) previamente filtrada em filtros de microfibra de vidro com porosidade de 1,2µm (Sartorius GMF 3), autoclavada a 120°C por 30 minutos e com pH acertado para aproximadamente 6,8. O meio experimental foi trocado diariamente durante os experimentos. A cada 12 horas, o alimento foi ressuspendido delicadamente com auxílio de uma pipeta de Pasteur.

Resultados

A concentração de carbono orgânico total da água do Reservatório de Barra Bonita praticamente não variou durante o experimento em que se utilizou o seston como alimento, em média, 4,77±0,28mgC L-1. A variação da concentração de carbono entre a água recém- coletada e após a manutenção no laboratório não foi significativa, não tendo havido, portanto, alterações quantitativas importantes nas condições alimentares durante o experimento.

As médias, desvio padrão e coeficientes de variação (%) dos parâmetros analisados da história de vida de C. cornuta alimentadas com exopolissacarídeo de A. spiroides,

Scenedesmus bijugus e seston do reservatório de Barra Bonita são apresentados na Tabela I.

A figura 1 apresenta o comprimento em função da idade dos animais durante o experimento. A partir desta figura observa-se que os animais apresentaram maior taxa de crescimento nas fases iniciais da vida, e, na medida em os organismos vão se tornando mais velhos, a taxa de crescimento corporal diminui.

As figuras 2 e 3 apresentam a média do número de ovos produzidos acumulado por indivíduo e a média do número de neonatas produzidas acumulado por indivíduo, em função da idade, para animais alimentados com os três tipos de alimento.

Fica claro nestas figuras o sucesso na produção de ovos e neonatas para os animais tratados com exopolissacarídeo. Os resultados demonstram que os animais se alimentaram do exopolissacarídeo, apresentando crescimento somático e capacidade de produção de descendentes viáveis em valores superior aos encontrados para os outros dois tratamentos alimentares. Esses aspectos revelam a capacidade deste tipo de alimento de sustentar uma população de C. cornuta.

Discussão

A qualidade do alimento disponível figura entre os mais importantes fatores ambientais que controlam o crescimento e a reprodução de espécies zooplanctônicas (Vijverberg, 1989), e, portanto, a viabilidade de populações destes organismos. Cladóceros possuem a habilidade de filtrar alimento de diversos tamanhos, de bactérias a grandes algas, o que os coloca em contato com um largo espectro de recursos de qualidade variável. Sendo a capacidade de seleção do alimento limitada, a quantidade e a qualidade deste alimento parece ser um importante fator de influência em parâmetros bionômicos de populações de cladóceros (Abrantes & Gonçalves, 2003). Gulati & DeMott (1997) resumem em quatro fatores não exclusivos os mecanismos pelos quais o alimento afeta seus consumidores: I) tamanho e forma das partículas, seletividade ao alimento, inibição da alimentação e taxas de ingestão; II) defesas morfológicas contra a digestão; III) inadequação nutricional (P, N e ácidos graxos); IV) presença de toxinas.

As médias do número total de ovos e neonatas produzidos por indivíduo e a fecundidade média observadas nos animais tratados com exopolissacarídeo de A. spiroides são superiores quando comparadas aos dados desses parâmetros registrados para C. cornuta alimentadas com seston do Reservatório de Barra Bonita (aproximadamente 30 ovos e neonatas por fêmea) a clorofícea Scenedesmus bijugus à concentração de 105células mL-1 (aproximadamente 25 ovos e neonatas por fêmea). Em comparação com a literatura existente, as taxas reprodutivas apresentadas por C. cornuta alimentada com exopolissacarídeo de A. spiroides sugerem que o exudato é um alimento de boa qualidade.

C. cornuta alimentada com seston enriquecido com diversas concentrações da clorofícea Ankistrodesmus falcatus e de populações naturais da cianofícea Mycrocistis aeruginosa

(Ferrão-filho & Azevedo, 2003) e com seston de um ambiente oligotrófico enriquecido com algas cultivadas em laboratório a 20 e 25°C (Melão, 1999) apresentaram fecundidades médias significativamente menores (variando de 2 a 4 ovos ou neonatas.fêmea-1) em relação aos números observados em animais tratados com exopolissacarídeo neste trabalho (em média, 6,31± 0,49 ovos por postura). Nandini & Sarma, 2000, fornecendo diferentes concentrações de Chlorella vulgaris a C. cornuta também registrou fecundidades inferiores às registradas neste estudo. Hardy & Caraballo (1995), cultivando essa espécie in situ e em laboratório a 29°C e fornecendo alimento natural do Lago Calado (Amazonas – Brasil), também registraram dados de fecundidade inferiores (em laboratório – aproximadamente 2 ovos.fêmea-1; in situ – aproximadamente 2,9 ovos.fêmea-1) aos registrados para os animais alimentados com o exopolissacarídeo no presente trabalho. O crescimento populacional (r), calculado para C. cornuta alimentada com exopolissacarídeo de A. spiroides (r = 0,263), foi maior em relação aos valores de “r” encontrados para os outros dois tratamentos deste trabalho (r = 0,228 para o tratamento com seston e r = 0,217 para o tratamento com S.

bijugus). Ferrão-Filho & Azevedo (2003) e Ferrão-Filho, Azevedo & DeMott (2003)

alimentando indivíduos dessa espécie com a cianofícea Microcystis aeruginosa não-tóxica e a clorofícea Ankistrodesmus falcatus também registraram taxas de crescimento populacional menores em relação às taxas registradas em animais alimentados com exopolissacarídeo no presente trabalho. De modo geral, a quantidade e qualidade dos alimentos variam positivamente com as taxas reprodutivas dos organismos zooplanctônicos (Gilyarov, 1982; Orcutt & Porter, 1984; Infante & Litt, 1985; Arnold, 1971; Stutzman, 1995; Boersma & Vijverberg, 1996; Rose, Warne & Lim, 2000; Abrantes & Gonçalves, 2003).

A idade de crustáceos na primípara e, conseqüentemente, o desenvolvimento pós- embrionário, são influenciados pela quantidade de alimento (Hrbackova-Esslova, 1963; Korinek, 1970; Weglenska, 1971 apud Hardy & Duncan, 1994; Grygierek, 1971 apud Bottrell, 1975) e muitos autores têm mostrado que, em altas concentrações de alimento, cladóceros levam um menor tempo para atingir a maturidade (Hardy & Duncan, 1994; Lynch, 1989; Orcutt & Porter, 1984; Rose et al., 2000). Aqui se utiliza o termo “maturidade” em referência ao início da produção de ovos pelo animal, muito embora dafinídeos possam estar fisiologicamente maduros e não depositarem ovos, em casos , por exemplo, de limitação de alimento (Stibor & Lampert, 1993). Os valores de idade da primípara demonstram que os animais tratados com o exopolissacarídeo, neste estudo, atingiram a maturidade mais cedo comparando-se com os valores obtidos dos animais alimentados com a suspensão de S. bijugus, mas não em relação aos animais tratados com seston do Reservatório de Barra Bonita. Isso indica que o exopolissacarídeo foi um alimento de alta qualidade, possibilitando que animais saudáveis logo investissem energia na reprodução, muito embora a diversidade alimentar do seston (algas, bactérias, detritos,

compostos orgânicos dissolvidos, inclusive exopolissacarídeos algais) possa ter proporcionado um desempenho ainda maior desses animais sob esse aspecto. Em comparação com a literatura, a idade da primípara dos animais alimentados com exopolissacarídeo no presente estudo foi menor em relação ao encontrado por Ferrão-Filho & Azevedo (2003) (em torno de 4 dias), mas demonstram pouca variação em relação aos dados de Melão (1999) (3,83 dias). Hardy & Caraballo (1995) registraram valores menores de tempo de desenvolvimento pós-embrionário (2,5 dias), mas deve-se levar em consideração que o autor cultivou os animais a 29°C e que, com o aumento na temperatura, ocorre uma diminuição no tempo necessário para cladóceros planctônicos atingirem a maturidade (Hardy & Duncan, 1994; Orcutt & Porter, 1984; Bottrell, 1975).

Os resultados relacionados ao crescimento somático de C. cornuta também sugerem que exopolissacarídeo de A. spiroides seja um alimento de boa qualidade. Em trabalhos com dafinídeos foi verificado que indivíduos sob limitação qualitativa e quantitativa de alimento apresentam comprimento ou massa somática reduzida em relação a indivíduos tratados com alimentos de maior qualidade ou com maior quantidade de alimento disponível (Abrantes & Gonçalves, 2003; Lynch, 1989; Taylor, 1985). Isso acontece possivelmente devido ao processo de rejeição dos alimentos filtrados pelo zooplâncton. Esse processo requer gasto de energia para movimentar o pós-abdômem e expulsar a partícula de alimento, (Gliwicz & Siedlar, 1980), levando a uma brusca diminuição nas taxas de filtração e a um consumo inadequado do alimento (Gilyarov, 1982). No presente trabalho, os organismos alimentados com exopolissacarídeo de A. spiroides apresentaram comprimentos lineares, na primípara e após 15 dias, superiores (0,472mm e 0,631mm) comparando-se com os animais tratados com seston (0,422mm e 0,504mm) e S. bijugus (0,421mm e 0,559mm). C. cornuta cultivada por Hardy & Caraballo (1995) também

apresentaram comprimento na primípara e comprimento máximo inferiores (0,428mm e 0,598mm) ao dos animais tratados com exopolissacarídeo no presente trabalho. O comprimento da primípara também foi maior nos animais deste estudo comparado ao valor médio encontrado por Michael (0,43mm) apud Bottrell (1975). Muitos estudos com várias espécies de Daphnia apontam que o comprimento da primípara é diminuído com limitação de alimento (Lynch, 1989; Fechen, 1970 apud Gilyarov 1982; Abrantes & Gonçalves, 2003).

É esperado que cladóceros com deficiência nutricional apresentem crescimento lento e baixas taxas reprodutivas comparados a cladóceros bem alimentados. (Beerstecher, 1952). Devido ao fato de exopolissacarídeos algais constituírem-se basicamente de carbono, não era esperado que os animais do presente estudo demonstrassem tal proficuidade reprodutiva e de crescimento somático, devido principalmente à escassez de nitrogênio na composição do alimento fornecido (1,83% do peso seco de exopolissacarídeo de A.spiroides). No entanto, o meio de cultura era composto por água do Reservatório de Barra Bonita filtrada e autoclavada. Esse tratamento elimina organismos vivos, mas ainda mantém certa quantidade de nutrientes dissolvidos (carbono e nitrogênio, por exemplo) que disponibilizar-se-iam através do crescimento de bactérias, uma vez que as condições do experimento não eram axênicas.

Os resultados deste estudo demonstram que Ceriodaphnia cornuta alimentada com exopolissacarídeo de Anabaena spiroides apresenta um expressivo sucesso reprodutivo e crescimento somático acentuado, o que revela que este alimento supre as necessidades nutricionais mínimas para sustentar uma população desta espécie. Assim, no ambiente natural, esses compostos provavelmente desempenham um importante papel ecológico,

constituindo uma potencial fonte complementar de energia para as populações de