3.1. Etik Onay ve Proje Desteği
Kırıkkale Üniversitesi Girişimsel Olmayan Araştırmalar Etik Kurulu Komisyonunun değerlendirmesi sonucu bu çalışma, 29.04.2020 tarihinde gerçekleştirilen 2020/05 sayılı toplantı ile etik kurul onayı almıştır. Ayrıca çalışmamız Kırıkkale Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 2020/054 proje numarası ile desteklenmiştir.
3.2. Olgu Seçimi
Bu çalışmaya Kırıkkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’nda 2010-2020 yılları arasında simple/radikal mastektomi ya da eksizyonel biyopsi materyalleri değerlendirilerek “invaziv duktal karsinom” tanısı almış, patoloji laboratuar arşivinden parafin blok preparatlarına ulaşılabilen toplam 81 adet olgu yanı sıra kontrol grubu olarak kullanılmak üzere mamoplasti materyaline ait normal meme parankimi içeren 13 adet olgu dahil edilmiştir.
Tru-cut iğne biyopsi materyalleri, erkek hastalar ve patoloji laboratuar arşivimizde lam ve/veya parafin blok preparatlarına ulaşılamayan vakalar çalışmaya dahil edilmemiştir. Yalnızca duktal histolojik subtipe sahip invaziv karsinom olguları seçilmiştir.
Söz konusu kriterlere sahip vakaların patoloji raporları hastane bilgi yönetim sistemi üzerinden incelenmiştir. Olguların aşağıda sıralanan klinikopatolojik bilgileri ile veri tablosu oluşturulmuştur.
Tablo 2.10. Değerlendirilen klinikopatolojik parametrelerin listesi
Hastanın tanı anındaki yaşı
Gerçekleştirilen cerrahi prosedür (Mastektomi/eksizyonel biyopsi)
Tümör yerleşimi (Sağ/sol)
Tümörün en büyük çapı
Patolojik tümör evresi (pT)
Patolojik lenf nodu evresi (pN)
31
TNM sistemine göre sınıflandırılmış tümör evresi
Tümör grade’ i (M-NBR sınıflamasına göre)
Mitoz skoru (M-NBR sınıflamasına göre)
Lenf nodu tutulumu
İmmunohistokimyasal olarak değerlendirilmiş ER ve PR boyanma durumu
İmmunohistokimyasal olarak değerlendirilmiş HER2 skoru
Ki-67 proliferasyon indeksi
Cerrahi sınırda tümör varlığı
Lenfovasküler invazyon varlığı
Uzak metastaz varlığı
Arşiv taraması tamamlanan olguların patoloji laboratuarı arşivinden lam preparatları çıkarılmıştır. Bu lamlar Leica marka DM LS2 serisi dual başlı ışık mikroskobu ile yeniden incelenerek tümörü en iyi temsil ettiği düşünülen lamlar ile birlikte DKİS lezyon bulunan ve patoloji arşiv preparatlarına ulaşılabilen 21 adet lam seçilmiştir. Bu seçim esnasında invaziv karsinom içeren kesitlerin normal meme parankimi ve özellikle tümör stroması içermesine, kanama ve nekroz alanları içermemesine özen gösterilmiştir. Daha sonra seçilen lamların parafin blokları patoloji laboratuar arşivinden Ki-67, Cav 1, Anx 2 ile immunhistokimyasal boyama uygulamak amacıyla çıkarılmıştır.
3.3. İmmunhistokimyasal Boyama
Ki-67 proliferasyon indeksi değerlendirmesi için kullanıma hazır, Dako (Santa Clara, California, USA) marka, fareden elde edilen, monoklonal anti-Ki-67 MIB-1 klonu kullanılmıştır.
Cav 1 değerlendirmesi için Merck (Darmstadt, Germany) marka, fareden elde edilmiş, monoklonal anti-Caveolin (CAV 1 klonu) antikoru, 1/40 oranında dilüe edildikten sonra kullanılmıştır.
Anx 2 değerlendirmesi için Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, USA) marka, sc28385 katalog numaralı, fareden elde edilen, monoklonal anti-Annexin 2 (C-10) antikoru, 1/500 oranında dilüe edildikten sonra kullanılmıştır.
32
İmmünhistokimyasal çalışma için sırasıyla aşağıdaki basamaklar gerçekleştirilmiştir.
İmmünhistokimyasal çalışma için seçilen, in-situ ve invaziv duktal karsinom bulunduran olguların bloklarından polizinli ve pozitif şarjlı lamlara 4 mikron kalınlığında kesitler alınmıştır.
Doku kesitleri alınmış bu lamlar 65 ºC sıcaklıkta etüvde 1 saat bekletildi.
Hazırlanan lamlar Ventana Benchmark XT cihazına yerleştirilmiştir.
Antijen retrival için CC1/CC2 buffer (EDTA/Citrate) içinde 30 dakika cihazda bekletilmiştir.
Primer antikor elle uygulanmıştır.
Primer antikor inkübasyonu için antikor cihaz içerisinde 42 °C sıcaklıkta 60 dakika bekletilmiştir.
Renk vererek görüntülemeyi sağlamak için “Ultraview universal 3,3'-diaminobenzidin (DAB)-detection kit” kullanılmıştır.
Ventana marka hematoksilen ile 8 dakikada zıt boyama tamamlanmıştır.
Karşıt boyama sonrası 4 dakika boyunca Bluing Reagent (mavileştirme solüsyonu) ile mavileştirme (bluing) işlemi gerçekleştirilmiştir.
Cihaz içerisinden çıkartılan lamlar çeşme suyunda yıkanıp 1 dakika absolü alkolde bekletilmiştir.
Etüvde kurutulan lamlar 2 dakika ksilende bekletilmiştir.
Lamlar entellan kullanılarak lamel ile kapatılmıştır.
3.4. İmmunhistokimyasal Değerlendirme
Ki-67
Hazırlanan kesitlerde öncelikle 4x objektif kullanılarak homojen boyanma izlenen olgularda randomize 3 alan, heterojen boyanma izlenen olgularda ise boyanmanın en yoğun olduğu (hot-spot) 3 alan belirlenerek bu alanlardaki invaziv tümöral hücrelerde nükleer pozitivite 40x objektif kullanılarak değerlendirilmiştir. Belirlenen her bir alan için pozitif kabul edilen tümör hücrelerinin o alandaki tüm tümöral hücrelere oranı yüzde değer olarak (%) verildikten sonra bu 3 hot-spot alanın Ki-67 indekslerinin ortalaması alınmıştır. Bu şekilde vakaların Ki-67 skorları kategorize
33
edilmiştir. Pozitif iç kontrol olarak normal duktus epitelyal hücreleri, endotelyal hücreler ve lenfositler kullanılmıştır.
Caveolin 1
Hem normal meme parankimi içeren örneklerdeki hem de invaziv tümör dokusu içeren kesitlerin normal meme parankimi içeren alanlarındaki adipositler, myoepitelyal ve endotelyal hücrelerdeki boyanma pozitif kontrol olarak değerlendirilmiştir. Normal meme parankimi stroması, DKİS lezyonlarının stroması yanı sıra normal duktal epitel, in-situ karsinom ve invaziv epitelyal hücrelerde boyanma izlenmemiştir. İnvaziv karsinom içeren kesitlerde stromal boyanma, sırasıyla 4x ve 10x objektifler kullanılarak değerlendirilmiştir. İncelenen kesitlerde stromal boyanma izlenmeyen olgular skor 0 olarak değerlendirilirken, stromal komponentte %30 ve altında boyanma skor 1, %30’ un üzerindeki boyanma ise skor 2 olarak gruplandırılmıştır [6]. İstatistiksel analiz için skor 0 Cav 1 ekspresyon kaybı olan grup olarak değerlendirilirken, skor 1 ve 2 olan grup Cav 1 ekspresyonu korunmuş grup olarak değerlendirilmiştir.
Annexin 2
Hem normal meme parankimi içeren kontrol vakaları hem de invaziv tümör dokusu içeren vakalarda endotel hücrelerindeki boyanma pozitif kontrol olarak değerlendirilmiştir. Tümör içermeyen meme parankiminde normal ve hiperplastik duktus epitelinde Anx 2 ile boyanma izlenmemiştir. 21 adet DKİS ile 81 adet invaziv karsinom içeren kesitlerde, tümöral hücrelerdeki sitoplazmik boyanma sırasıyla 4x ve 10x objektifler kullanılarak değerlendirilmiştir. Anx 2 ile saptanan sitoplazmik immünpozitivite yoğunluk ve yaygınlık olmak üzere 2 grupta incelenmiştir.
Boyanma yoğunluğu “zayıf (1)- orta (2) ve güçlü (3)” olarak gruplandırılırken, boyanma yaygınlığı yüzde değer verilerek, “%1-10:(1), %11-50:(2), %51-100:(3)”
şeklinde değerlendirilmiştir. Boyanma yoğunluğu ve yaygınlık skorları çarpılarak 1’
den 9’ a (1,2,3,4,6,9) kadar sayısal veriler elde edilmiştir. Sayısal verisi 1-2 olan vakalar “skor 1”, 3-4 olan vakalar “skor 2”, 6-9 olan vakalar ise “skor 3” olarak gruplandırılmıştır. İstatistiksel analiz için skor 1 ve 2 olan olgular düşük Anx 2 ekspresyonu, skor 3 olan olgular ise yüksek Anx 2 ekspresyonu olarak değerlendirilmiştir [51].
34
3.5. ER, PR ve HER2 ekspresyonlarının kategorizasyonu
ER ve PR ekspresyonlarının değerlendirilmesinde ASCO/CAP kılavuzu 2020 yılı güncellemesi baz alınmıştır. Buna göre tümör hücrelerinde %1’ in üzerinde nükleer pozitivite izlenen olgular ER pozitif kabul edilmiştir. ER ekspresyonu %1-30 olarak raporlanmış vakalar 1 (+) pozitif, %31-60 olan vakalar 2 (++) pozitif, %61-100 olan vakalar ise 3 (+++) pozitif olarak değerlendirilerek 3 grup oluşturulmuştur. Aynı cut-off değerler PR ekspresyonlarının değerlendirilmesinde de kullanılmıştır. İstatistiksel analizler için ER ekspresyonu (-),1 (+) pozitif, 2 (++) pozitif olgular düşük ER ekspresyonu olarak, 3 (+++) pozitif olgular ise yüksek ER ekspresyonu olarak değerlendirilmiştir. PR ekspresyonu (-) ve 1 (+) pozitif olgular düşük PR ekspresyonu olarak, 2 (++) pozitif ve 3 (+++) pozitif olgular ise yüksek PR ekspresyonu olarak değerlendirilmiştir. HER2 skor 0,1 ve 2 olan olgular HER2 negatif olarak, HER2 skor 3 olan olgular ise HER2 pozitif olarak gruplandırılmıştır.
3.6. İstatistiksel Değerlendirme
Çalışmamızın veri analizinde SPSS Statistics (Version 25.0. Armonk, NY: IBM Corp., 2017) paket programı kullanılmıştır.
Tanımlayıcı istatistiklerde kesikli (kategorik) veriler için sayı ve yüzde değerleri, sürekli (sayısal) veriler için ise minimum ve maksimum değerler, ortalama değer, medyan değer ve standart sapma kullanılmıştır. Normal dağılımın değerlendirilmesinde Kolmogorov-Smirnov testi uygulanmıştır. Korelasyon analizinde non-parametrik veriler için Spearman korelasyon testi, parametrik veriler için ise Pearson korelasyon testi kullanılmıştır. Gruplar arası karşılaştırmalarda Ki-kare testi uygulanmıştır, Ki-Ki-kare test koşulları sağlanamadığı durumlarda ise anlamlılık değerlendirmesi için Fisher-Exact test p değeri kullanılmıştır. İki grup karşılaştırmalarında normal dağılıma uymayan sürekli veri analizinde Mann-Whitney U testi, normal dağılıma uyan verilerde ise Bağımsız Örneklem T testi (Student’s T test) uygulanmıştır. Üç grup karşılaştırmalarında normal dağılıma uymayan sürekli veri analizinde Kruskal Wallis testi, normal dağılıma uymayan sürekli veri analizinde ise One-Way-Anova testi uygulanmıştır. Cav 1 ekspresyonuna etki eden değişkenleri analiz etmek amacıyla binary lojistik regresyon testi yapılmıştır.
İstatistiksel olarak anlamlılık düzeyi p<0,05 olarak kabul edilmiştir.
35