Com o objetivo de encontrar ligantes físico da proteína Pub1, foi utilizado o sistema de duplo-híbrido para rastrear uma biblioteca de cDNA clonada em fusão com o domínio de ativação de Gal4, utilizando como isca a proteína Pub1 em fusão com a proteína ligante de DNA lexA, conforme o esquema geral apresentado na Figura 3.
Inicialmente, a sequência codificadora do gene PUB1 foi amplificada por PCR utilizando o par de oligonucleotídeos SVO171/146 e clonado no vetor pBTM116 (TRP1, 2P), que leva à produção da proteína Pub1 em fusão com a proteína lexA (isca). A linhagem SVL86 foi transformada com a construção pBTM-PUB1 (pSV424) obtida e selecionada em meio SC-Trp. A produção da proteína de fusão lexA-Pub1 foi confirmada por western blot do extrato total de cinco clones transformantes utilizando anticorpo anti-Pub1. Na Figura 6A é possível observar a presença de uma banda de aproximadamente 85kDa, correspondente à proteína de fusão lexA-Pub1, sendo produzida pelos cinco clones analisados. Destes, os clones #4 e #5 apresentam, além da proteína de fusão, uma banda menor que provavelmente corresponde a um produto de degradação. O clone #3 apresenta uma produção muito baixa da proteína de fusão.
Antes de dar início ao rastreamento, foi verificado se proteína isca lexA-Pub1 não é capaz de gerar artefatos por levar, sozinha, à ativação da transcrição dos genes repórteres HIS3 e lacZ. Para isso, os cinco clones anteriormente analisados, já contendo o plasmídeo pBTM-PUB1 (pSV424), foram transformados com o vetor pACT (LEU2, 2
P
) vazio e selecionados em meio SC -Leu -Trp. Para testar a ativação do gene repórter HIS3, foi avaliada a capacidade da linhagem de crescer em meio SC -Leu -Trp -His e para testar a ativação do repórter lacZ, foi avaliada a atividade da enzima E-galactosidase. Essas linhagens foram comparadas a dois controles positivos, SVL86 contendo pBTM-NIP7 e pACT-NOP8 (SVL 129, interação forte, ++) e SVL86 contendo pBTM-NIP7 e pACT-RRP43 (SVL130 interação fraca, +) e ao controle negativo (-) SVL86 contendo pSV148 (pBTM116) e pSV149 (pACT) vazios. Na Figura 6B, é possível observar que não ocorre a ativação do gene repórter HIS3, uma vez que não há crescimento em meio SC -Leu -Trp -His dosclones #1 a #5, que crescem apenas em meio SC -Leu -Trp. Não ocorre também a ativação do gene repórter lacZ, como mostrado na Figura 6C, uma vez que os clones #1 a #5 não desenvolveram coloração azul no ensaio de E-galactosidase.
A partir desses resultados, os clones #1, #2, #4 e #5 foram reunidos em uma só amostra e o “pool” de células obtido foi transformado com a biblioteca de cDNA de S. cerevisiae clonada em pACT e plaqueada em meio SC-Leu -Trp -His. Alíquotas de 2PL e 4PL da transformação foram plaqueados em meio SC-Leu -Trp para determinação do número de transformantes. Após 3 transformações, foram rastreados aproximadamente 1,6x105 tranformantes. Dentre os transformantes rastreados, foi obtido um total de 535 clones capazes de crescer em meio deficiente em histidina, capacidade adquirida pela ativação do gene repórter HIS3. Desse total, apenas 16 clones apresentaram ativação do segundo gene repórter, lacZ, através do ensaio de E-galactosidase. Os plasmídeos recuperados dos 16 clones obtidos foram utilizados para transformar a linhagem de bactéria HB101, que permite a seleção apenas do vetor pACT, devido à marca auxotrófica para crescimento em meio M9 deficiente em leucina. Os plasmídeos foram então recuperados da bactéria e utilizados para transformar a linhagem SVL86 já contendo a construção pBTM- PUB1. As células transformantes foram testadas novamente quanto a ativação dos genes repórteres (“plasmid linkage”) a fim de confirmar se os fenótipos de crescimento em meio deficiente em histidina e de produção de E-galactosidase estão ligados somente à presença do plasmídeo recuperado. Dentre os 16 plasmídeos recuperados, apenas células contendo 7 deles confirmaram os fenótipos observados anteriormente. Esses plasmídeos foram submetidos ao sequenciamento de DNA utilizando o par de oligonucleotídeos SVO135/199, que se hibridizam no vetor pACT nas regiões flanqueadoras onde foi clonada a biblioteca de cDNA. A Figura 7 mostra os clones finais obtidos após o ensaio de “plasmid linkage”. A Figura 7A mostra o crescimento dos clones em meio SC-Leu -Trp, após diluição seriada. A Figura 7B mostra o crescimento dos clones em meio SC-Leu -Trp -His, para análise da expressão do gene repórter HIS3. Finalmente, a Figura 7C mostra o ensaio de E- galactosidade para análise do gene repórter lacZ utilizando células da primeira diluição.
O sequenciamento das extremidades 5' e 3’ dos 7 clones confirmados levou à identificação de 4 genes diferentes: AIR1, HHT1, GAR1 e NAB2. O gene AIR1,
encontrado no rastreamento de duplo-híbrido como o ligante mais fraco de Pub1 codifica para a proteína Air1 de 42kDa, uma proteína do complexo TRAMP, requerida na poliadenilação e degradação de uma variedade de RNAs (60). Esta proteína também interage com a arginina metiltransferase Hmt1, regulando sua atividade na metilação de Npl3 e, consequentemente, modulando a função dessa proteína no processamento e exportação de RNA mensageiros (61). O gene HHT1, encontrado em três clones no rastreamento de duplo-híbrido, codifica para a histona H3, requerida na formação estrutural da cromatina e envolvida no silenciamento gênico mediado por heterocromatina (62). O gene GAR1, encontrado em dois dos clones obtidos no rastreamento, codifica para a proteína Gar1, de 21kDa, que é componente do complexo de snoRNP pseudouridilase, envolvido na modificação e clivagem de rRNA (63). Finalmente, o gene NAB2, encontrado em apenas um dos clones obtidos, apresenta-se como o ligante mais forte de Pub1 revelado no rastreamento. Esse gene codifica para a proteína Nab2 (Nuclear polyadenylated RNA-binding protein), uma proteína de 58kDa que se liga a RNA poliadenilado (64). Essa proteína é requerida no controle do tamanho da cauda poli(A) de mRNA e é essencial para no transporte nucleocitoplasmático dessa molécula (65).
#5 ++ +
-
#1 #2 #3 #4 SC -Leu -Trp #5 ++ +-
#1 #2 #3 #4 SC -Leu -Trp -His #4 #2 #3 #5 ++ #1 +-
E - Galactosidase #1 #2 #3 #4 #5 Pub1 LexA-Pub1 60 kDa 80C
B
Figura 6. Análise da produção e teste de auto-ativação da proteína isca lexA-Pub1. (A) Análise da produção da proteína isca lexA-Pub1. Western blot de cinco clones da
linhagem SVL86 contendo a construção pSV424 (lexA-PUB1) utilizando soro anti-Pub1. As setas apresentam a proteina de fusão lexA-Pub1 e Pub1 endógena. (B) Análise de auto-
ativação do gene repórter HIS3. Crescimento dos cinco clones anteriormente analisados em meio SC -Leu -Trp e SC -Leu -Trp -His. (C) Análise de auto-ativação do gene repórter lacZ.
Ensaio de E-galactosidase dos cinco clones em análise. (++), controle positivo forte. (+), controle posivo fraco. (-), controle negativo.
AIR1 NAB2 HHT1 HHT1 HHT1 GAR1 GAR1 +
-
SC -Leu -Trp -His SC -Leu -Trp X-galFigura 7. Ativação dos genes repórteres pelos clones obtidos no rastreamento por duplo-híbrido de ligantes de Pub1. Crescimento dos clones em meios SC -Leu -Trp (A)e
SC -Leu -Trp -His (B), após diluição seriada. (C) Análise da ativação do gene repórter lacZ
através do ensaio de E-galactosidase. À direita dos painéis estão os genes identificados por sequenciamento. A linhagem utilizada como controle positivo (+) contém plasmídeos para produção de proteínas que conhecidamente interagem entre si (SVL129) e a linhagem para controle negativo (-) contém o plasmídeo pSV424 (pBTM-PUB1) e o vetor pSV149 (pACT) vazio.