A fim de determinar a região de Nab2 responsável pela sua interação com Pub1, foi utilizado o sistema de duplo-híbrido. As construções que permitem a expressão de deleções de domínios de Nab2 em fusão com lexA (pSV567, pSV568, pSV569, pSV570, pSV571 e pSV597, descritos em Materiais e Métodos) foram gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Anita Corbett, da Emory University School of Medicine. Os domínios de Nab2 estão esquematizados na Figura 11A. O sistema que utiliza tais construções é, no entanto, diferente do sistema de rastreamento utilizado anteriormente. Esse sistema inicialmente descrito por Gyuris e cols. (48), utiliza os vetores pEG202, que produz constitutivamente a proteína de interesse fusionada a lexA, e pJG4-5, que produz a proteína de interesse fusionada ao domínio ativador de transcrição B42 sob indução de expressão por galactose. A linhagem utilizada (SVL316) contém o gene lacZ em vetor plasmídial URA3 como repórter e, nesse sistema, o ensaio de E-galactosidase é realizado diretamente no meio de cultura sólido.
Dessa forma, a sequência codificadora de PUB1 foi amplificada por PCR utilizando o par de oligonucleotídeos SVO146/183 e clonada no vetor pSV440 (pJG4- 5), gerando o plasmídeo pSV545. A construção obtida foi utilizada para transformar a linhagem SVL316 e a linhagem obtida então transformada também com as diversas contruções contendo os domínios de Nab2. A expressão da proteína de fusão B42- Pub1 e a expressão dos domínios de Nab2 em meio contendo 2% de galactose foi confirmada por western blot (resultados não apresentados). Após confirmação da expressão, foi analisada a ativação do gene repórter lacZ. Como pode ser observado na Figura 11B, somente a linhagem contendo a deleção da porção C-terminal de Nab2 ('CCCH) não é capaz de desenvolver coloração azul, mostrando que a região C-terminal de Nab2 é necessário para a interação com Pub1. Na mesma figura, é possível verificar também que o domínio CCCH de Nab2 é suficiente para a interação, uma vez que a construção expressando somente esse domínio é capaz de reestabelecer a interação com Pub1.
O domínio CCCH de Nab2 contém sete domínios de dedos de zinco, arranjados em um grupo com 4 e outro com 3 domínios próximos. Como o domínio CCCH de Nab2 corresponde à aproximadamente metade da proteína, foi proposta a dissecção dessa região em 3 partes: 'C4, 'C3 ou 'CT, conforme mostrado no
esquema da Figura 11A. Para a obtenção do plasmídeo que expressa a proteína 'C3, o plasmídeo contendo a sequência codificadora de Nab2 com a deleção do domínio C3 (pAC1113) foi utilizada como molde para PCR, utilizando o par de oligonucleotídeos SVO351/352, e o fragmento obtido foi clonado no vetor pEG202, gerando a construção pSV645. Da mesma forma, a sequência codificadora de Nab2 deletada dos últimos 46 aminoácidos ('CT) foi amplificada a partir da construção pAC1112, utilizando o par de oligonucleotídeos SVO351/352 e clonada no vetor pEG202, gerando o plasmídeo pSV646. A sequência correspondente ao gene NAB2 sem o domínio C4 foi obtida por "overlapping PCR" utilizando os pares de oligonucleotídeos SVO351/345, SVO346/352. O produto final da PCR foi clonado no vetor pEG202, gerando a construção pSV741. As contruções obtidas foram utilizadas para transformar a linhagem SVL316 já contendo o plasmídeo pJG-PUB1 (pSV545) e a ativação do gene repórter lacZ foi testada através do ensaio de E-galactosidase. Como pode ser observado na Figura 11C, o gene repórter lacZ é ativado somente com as deleções 'CT e CCCH, enquanto que as deleções 'C4 e 'C3 não são capazes de interagir com Pub1. Dessa forma, é possível concluir que a presença de ambos domínios C3 e C4 da proteína Nab2 são essenciais para a interação com Pub1.
Com a finalidade de verificar se o domínio CCCH de Nab2 é capaz de interagir diretamente com Pub1, foi realizada a produção e purificação do domínio em bactéria para o ensaio de interação in vitro. As sequências codificadoras dos domínios 'CCCH e CCCH de Nab2 foram removidas dos vetores pSV571 e pSV597 e subclonadas no vetor de expressão pGEX4T, gerando os plasmídeos pSV607 (pGEX-
'
CCCH) e pSV609 (pGEX-CCCH). As proteínas de fusão GST-'CCCH e GST- CCCH foram produzidas e purificadas a partir do lisado de bactérias expressando os plasmídeos gerados (resultados não apresentados). A Figura 10 mostra o resultado do ensaio de interação in vitro realizado com as proteínas purificadas. Nesse painel, é possivel observar que Pub1 é capaz de se ligar somente à GST-CCCH (canaleta 6), enquanto o mesmo não acontece com a proteína GST-'CCCH (canaleta 8). Assim, é possível verificar que essa interação se da de forma direta, confirmando o dado anteriormente obtido por duplo-híbrido de que o domínio CCCH de Nab2 é necessário e suficiente para a interação da proteína com Pub1.PAP
anti-Pub1
NL L NL L NL L NL L - + - +
Figura 8. Confirmação da interação entre Pub1 e Nab2 por co-purificação. A resina de
IgG-Sepharose foi incubada com extratos protéicos das linhagens produzindo a proteína de fusão com TAP e, após lavagens, as amostras foram submetidas a clivagem com TEV- protease e posteriormente a SDS-PAGE e western blot usando anticorpos anti-Pub1 ou PAP (Sigma). As canaletas NL contêm amostras das frações não ligada às resinas e as canaletas L contêm amostras das frações ligadas às resinas.
kDa 50 90 60 100 80 0h 1h 2h 3h IPTG (0,4mM) 1 2 3 4 5 GST-Nab2 1 2 3 4 5 6 7 8 FT Lavagem GST-Nab2 kDa 50 90 60 100 80
B
Figura 9. Análise da produção e purificação de GST-Nab2. (A). Análise da indução da
expressão em E. coli. SDS-PAGE das alíquotas da cultura bacteriana antes (canaleta 2) e após indução com 0,4mM IPTG (canaletas 3 a 5). (B) Análise das etapas de purificação.
SDS-PAGE de amostras não ligada à coluna (FT, canaleta 2 e 3), amostras obtidas durante a lavagem da coluna (Lavagem, canaletas 4 a 6) e amostras coletadas durante a etapa de eluição (canaletas 7 e 8). Nos painéis A e B, as setas indicam a proteína GST-Nab2 e as canaletas 1 contêm o padrão de massa molecular 10kDa (Invitrogen).
anti-GST
anti-Pub1
NL L NL L NL L NL L
Figura 10. Confirmação da interação direta entre Pub1 e Nab2 por ensaio de interação
in vitro. A resina de glutationa-Sepharose foi incubada com GST ou com as proteínas em fusão com GST e então com His-Pub1. Após lavagens, as amostras foram submetidas a SDS-PAGE e ensaio de western blot utilizando anticorpo anti-Pub1 ou anti-GST (Sigma). As canaletas NL contêm amostras das frações não ligada às resinas e as canaletas L contêm amostras das frações ligadas às resinas.
B
'CCCH
'QQQP
'RGG
CCCH
Nab2-1
Nab2
C-
C-
Nab2
'C3
'CT
'C4
CCCH
'CCCH
C
Nab2 - C N - N QQQP RGG C4 C3 CT Nab2-1 'C3 'CT 'QQQP 'RGG 'CCCH 'C4 CCCHFigura 11. Mapeamento por duplo-híbrido da interação entre Pub1 e Nab2. (A)
Esquema da estrutura primária de Nab2 e das deleções utilizadas. (B) e (C) Análise por
duplo-híbrido da interação entre Pub1 e os domínios de Nab2. A linhagem SVL316 expressando proteína de fusão B42-Pub1 (pSV545) foi transformada com vetor pSV446 (pEG202) vazio, como controle negativo, ou plasmídeos expressando deleções dos domínios de Nab2 e então crescida em SC -Ura -His –Trp / X-Gal.