Eğitimde Kullanılan Öğretim Stratejileri

Fundamentados no fato de que poucas lipases apresentam valores de pH ótimo na faixa alcalina, WATANABE et al. (1977) realizaram extensivos programas de isolamento e seleção de microrganismos produtores de lipases. Para tanto usaram amostras de solo e de água bem como de coleção de culturas a fim de obterem microrganismos capazes de produzirem lipases alcalinas que atuassem em faixa de pH de 9 a 10. Os autores empregaram como enriquecimento para o isolamento óleo de oliva (2,0%; p/v), fontes nitrogenadas inorgânicas e uréia adicionados ao meio de cultura e, para testes de produção de lipase meios de cultura com farinha de soja (2,0%; p/v) e amido (2,0%; p/v), com pH inicial de 8,0 e 8,5. De 722 amostras os autores isolaram 1606 cepas microbianas. Apenas quatro cepas, todas elas de bactérias, produziram lipase alcalina em quantidade significativa, não tendo sido detectada nenhuma de fungo filamentoso ou de levedura produtora.

SZTAJER & MALISZEWSKA (1988) isolaram 160 cepas produtoras de lipase a partir de 60 amostras de solos contaminados com resíduos industriais provenientes do beneficiamento de óleos vegetais e de indústrias de laticínios e de alimentos em deterioração. Para isolamento e seleção primária, usaram um meio no pH 7,5, contendo (em %; p/v): peptona (0,5); extrato de levedura (0,3); tributirina (1,0); ágar (2,0); pH (7,5). Para isolamento de fungos, adicionou-se estreptomicina

ao meio de cultura e o pH foi acidificado. Na seleção secundária em cultivo submerso com frascos agitados empregaram (%; p/v): farinha de soja (2,0); peptona (1,0); amido solúvel (1,0); K2HPO4 (0,2); MgSO4.7H2O (0,1); CaCO3 (0,5). Das 16 cepas reconhecidas como altoprodutoras apenas 5 eram de fungos filamentosos (4 cepas de Penicillium spp) e as cepas que mais produziram a lipase eram de bactérias.

HOU & JOHNSTON (1992) testaram 1229 culturas (508 bactérias, 479 leveduras, 230 actinomicetos e 12 fungos filamentosos) da “Agricultural Research Service Culture Collection” (Peoria, IL, EUA), do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos. A seleção foi realizada apenas em placa de Petri com emprego de meios de cultura para bactérias e fungos de composição básica diferente, mas contendo óleo de soja (3,0%; p/v) e solução a 0,1% de rodamina B (0,2%; v/v). Cerca de 25% das cepas mostraram-se produtoras de lipase tendo sido classificadas em três categorias (boa, moderada ou fraca produtora), de acordo com o tamanho do halo lipolítico fluorescente. Os fungos apresentaram o maior percentual de cepas na categoria de boas produtoras.

RAPP & BACKHAUS (1992) avaliaram 700 linhagens microbianas da coleção de culturas da GBF (“Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbh”) quanto à produção de lipase extracelular. A seleção primária foi realizada em placa de Petri contendo ágar batata e dextrose, adicionado de trioleína e Tween 80 (na proporção de 3,75 mL:1,25 mL) após emulsificação. Poços no ágar (7,0 mm de diâmetro e 5,0 mm de profundidade) foram preenchidos com suspensão de cada cultura microbiana. Após incubação os diâmetros das zonas claras de lipólise em torno dos poços foram medidos. As cepas com halos mais nítidos e maiores foram selecionados para o cultivo submerso. Os autores também empregaram tributirina (1,0%; v/v) em substituição à mistura trioleína e Twee80 no teste em placa, para avaliarem a capacidade de produção de esterases. Na seleção secundária as cepas foram cultivadas em frascos agitados com meio de cultura de composição seguinte (g/L): MgSO4.7H2O (0,5); KH2PO4 (1,0); NaNO3 (3,0); extrato de levedura (1,0); peptona (30,0); glicose (10,0) e óleo de oliva (10,0). A atividade lipolítica foi determinada em ensaio enzimático com trioleína como substrato em meio tamponado no pH 6,2 tendo sido usado, também, o p-nitrofenolpalmitato no pH 5,6. Da seleção primária, foram selecionadas 70 cepas (34 fungos filamentosos, 15 leveduras e 21 bactérias) para serem testadas em cultivo submerso. Os caldos fermentados que apresentaram maior atividade frente a trioleína foram obtidos de

cultivos de: Rhizopus spp, entre os fungos filamentosos; Rhodotorula rubra e

Saccharomycopsis capsularis, entre as leveduras; e Pseudomonas cepacia, entre as

bactérias. Os fungos Rhizopus circinans, R. microsporus e Candida rugosa apresentaram a maior produção de esterases. Neste trabalho, os autores concluíram que o p-nitrofenolpalmitato não é bom substrato para as lipases.

IONITA et al. (1997), testaram a capacidade lipolítica das cepas de fungos da coleção de culturas do “Chemical Pharmaceutical Research Institute” (Bucareste), empregando ágar nutriente suplementado com cloreto de cálcio e Tween 80. Pela determinação dos halos de opacidade, devido à formação de sabões de cálcio, desenvolvidos em torno das colônias lipolíticas, selecionaram como melhores produtores, as cepas de Candida lipolytica e Aspergillus oryzae.

CARDENAS et al. (2001a) têm desenvolvido trabalhos de isolamento e seleção de microorganismos lipolíticos. Duas mil cepas isoladas de amostras do solo foram submetidas a procedimentos de seleção primária (em placa de Petri) em ágar nutriente suplementado com 10% (v/v) de emulsão de óleo de oliva, preparada em solução de goma arábica ou com tributirina. As colônias que apresentaram zonas claras em volta delas eram repicadas e as culturas resultantes eram novamente selecionadas (seleção secundária) em cultivo submerso. Quatrocentas e cinqüenta colônias produziram halo claro em sua volta no meio com tributirina e somente 92 apresentaram halo nas placas com óleo de oliva, indicando predominância de lipases atuantes sobre triglicerídeos de cadeia curta. Das culturas inicialmente selecionadas apenas 14 mostraram-se boas produtoras, sendo 9 fungos filamentosos, uma levedura, uma bactéria e três actinomicetos.

Em outro trabalho do mesmo grupo, (CARDENAS et al., 2001 b), de 960 microorganismos isolados (860 fungos filamentosos e 100 leveduras), 440 produziram halo claro no meio em placa contendo tributirina e destes, apenas 92 apresentaram hidrólise nos meios em placa contendo óleo de oliva. Todas as linhagens formadoras de lipase foram testadas quanto à produção em meio líquido de cultura contendo óleo de oliva como indutor (cultivo submerso). Dez cepas foram selecionadas como boas produtoras: os bolores Achremonium murorum, Monascus

mucoroides, Monascus sp, Arthroderma ciferrii, Fusarium poae, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Penicillium chrysogenum, Ovadendron sulphureo - ochraceum

e uma levedura - Rhodotorula araucariae.

VARGAS et al. (2004), da Universidade de Lund (Suécia), examinaram a produção de enzima lipolítica de 150 cepas isoladas de um lago salgado do Kênia.

As amostras do lago foram inoculadas em meio mineral basal enriquecido com óleo de oliva (3,0%; v/v), em pH 7,0 e 10,0; e incubação a 37 oC e 55 oC, em frascos sob agitação. Após cinco dias de incubação os cultivos foram semeados em meio de cultura em placa de Petri contendo rodamina B. As colônias que apresentaram halo fluorescente após revelação com luz U.V. (350 nm) foram mantidas em culturas puras e a produção de lipase foi avaliada em fermentação submersa em frascos agitados que continham óleo de oliva e extrato de levedura, adicionados ao meio mineral basal. A atividade lipolítica foi determinada nos caldos fermentados empregando-se p-nitrofenolpalmitato como substrato. Quinze isolados selecionados como bons produtores pertenciam aos “clusters” Pseudomonas (maioria),