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Vários ensaios enzimáticos têm sido desenvolvidos para a mensuração da atividade lipolítica em preparações brutas ou purificadas. A maioria deles está fundamentada no princípio da formação de produtos da reação em detrimento do consumo do substrato.

Como visto anteriormente, as lipases são solúveis em água, mas catalisam reações hidrolíticas de triglicerídeos insolúveis, e atuam na interface óleo-água. Por isso, a atividade lipolítica tem sido determinada em sistemas de emulsão. Entretanto, à medida que a reação se desenvolve, a composição da interface óleo-água varia, em decorrência da formação de produtos da hidrólise e degradação do substrato. Com isso, o tamanho das gotículas de óleo e a área da interface sofrem mudanças contínuas. Assim, a ação da lipase varia, não apenas com a concentração do substrato, mas, também, com o tamanho da área da interface óleo-água. Por isso um sistema controlado para ensaio enzimático da lipase exige que haja uma interface ampla e estável de gotículas lipídicas. Somente em emulsões de óleo em água, perfeitamente dispersas, homogêneas e estabilizadas, tais condições são alcançadas. Em geral a atividade lipolítica é determinada pela dosagem do produto formado - ácido graxo - liberado ao longo do tempo de incubação da reação enzimática, sob condições controladas (natureza e quantidade da emulsão; volume de reação; tampão; pH e temperatura). Os ácidos graxos liberados podem ser quantificados por métodos titulométricos, colorimétricos, turbidimétricos ou fluorimétricos (WATANABE et al., 1977; JENSEN, 1983; DELABORDE DE MONPEZAT et al., 1990; SMELTZER et al., 1992; HENDRICKSON, 1994; HOPPE & THEIMER, 1995; THOMSON et al., 1999).

Os métodos titulométricos fundamentam-se na titulação alcalina dos íons de hidrogênio liberados na dissociação dos ácidos graxos, resultantes da ação das lipases sobre as moléculas do triglicerídeo (WATANABE et al., 1977; AKHTAR et al., 1980; LINFIELD et al., 1985). Como a ionização completa dos ácidos graxos livres ocorre em pH 9.0 (HOPPE & THEIMER, 1995) a titulação não pode ser concluída em pH abaixo deste valor. Por isso, indicador ácido-base como fenolftaleína (viragem em torno de pH 8.0) não é recomendável. De preferência o indicador ideal

deve ter ponto de viragem ligeiramente acima de pH 9.0, sendo mais apropriado a timolftaleína (AKTHAR et al., 1980) para indicar o ponto final da titulação. Por outro lado, a titulação pode ser executada sem adição de indicador num sistema em que o pH é mantido num valor fixo, controlado por um potenciômetro em um titulador automático (DESNUELLE et al., 1955; GARGOURI et al., 1986; LINFIELD et al., 1985; HOPPE & THEIMER, 1995). Desse modo é realizada a titulação dos íons hidrogênio, à medida que transcorre a ação hidrolítica da enzima, o que permite um acompanhamento contínuo da atividade lipásica sobre o substrato natural. Na mistura de reação o triglicerídeo é adicionado sob a forma de emulsão e seu preparo requer a adição de agentes emulsificantes ou estabilizantes de emulsão. Em geral usa-se a goma arábica como agente estabilizante sem a necessidade de adição de agentes tensoativos (HOPPE & THEIMER, 1995). Por outro lado, as emulsões de óleo de oliva, preparadas com solução de álcool polivinílico, conservam-se completamente homogêneas durante o ensaio e podem ser usadas na determinação da atividade lipásica (WATANABE et al., 1977).

A necessidade de aumentar a velocidade e sensibilidade de ensaios para detectar ácidos graxos livres levou ao desenvolvimento de métodos colorimétricos (LOWRY & TINSLEY, 1976). Estes métodos baseiam-se na complexação dos ácidos graxos livres em solvente orgânico com um metal bivalente (usualmente cobre) seguida por análise espectrofotométrica do metal na fase orgânica. LOWRY & TINSLEY (1976) usaram benzeno como o solvente para os sabões de cobre porque amostras podiam ser aspiradas diretamente dentro da célula (“flow cell”) de um espectrofotômetro, aumentando a velocidade de análise. Para aumentar a estabilidade e sensibilidade do cromóforo formado na presença de complexos de ácidos graxos livres cúpricos numa mistura de solventes (clorofórmio: heptano: metano), HRON & MENAHAN (1981) empregaram difenil carbazida contendo difenil carbazona como reagente de desenvolvimento de cor. Outras modificações do método de LOWRY & TINSLEY (1976) têm sido divulgadas, como a quantificação dos ácidos graxos após sua conversão a sais de cobre, pela comparação de valores de absorbância (λ= 715 nm) com aqueles obtidos numa curva para ácido óleico (PATEL et al., 1996) ou após extração dos sais cúpricos dos ácidos graxos livres com clorofórmio e medidas de absorbância a 435 nm (GAO & BREVIL, 1995; LIPPI

et al., 1972; BRUNK & SWANSON, 1981 E HRON & MENAHAN, 1981).

HAFKENSCHEID et al. (1983) comparou os métodos titulométricos e os métodos com desenvolvimento de sabões de cobre na determinação da atividade

lipásica no fluído duodenal usando uma emulsão de óleo de oliva. O autor verificou que houve boa correlação entre os dois tipos de métodos (R2 =0,96), mas, entretanto, foram detectadas duas vezes mais lipases quando medidas com o método de sabão de cobre. Métodos clássicos de análise por cromatografia podem ser aplicados para a determinação da atividade lipolítica. Assim, têm sido registrados métodos que se baseiam na quantificação de produtos hidrolíticos da reação com lipase (ácidos graxos livres, mono e diacilgliceróis) por cromatografia gasosa (CG) ou cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (VEERARAGAVAN et al., 1990).

Lipases alcallinas são produzidas por uma variedade de microorganismos, particularmente leveduras e bolores. SAVITA & RATLEDGE (1992) usaram um sistema de autotitulação para manter o pH de 8,8 durante a hidrólise de uma emulsão por lipases de Aspergillus flavipes assim como BRHUSHAN et al. (1994) determinaram a atividade lipolítica, em pH 8,0, pelo método titulométrico, em preparações obtidas de Candida spp.