Diğer Diplomatik Misyon Çalışanlarının Ailelerine Verilen Bağışıklıklar

Para realizar as análises isotópicas, foi necessário que as matérias- primas, as bebidas produzidas em laboratório e as bebidas comerciais de maçã fossem preparadas para as leituras no Espectrômetro de Massa. No caso dos sucos polposos e néctares de maçã, pode-se analisar a própria bebida e mais três frações: polpa lavada com água, polpa lavada com acetona e o açúcar purificado extraído da bebida. Já nas bebidas clarificadas (suco clarificado e refrigerante de maçã), por não conter polpa em sua composição, a análise isotópica somente é feita nas bebidas clarificadas e no açúcar purificado extraído das bebidas clarificadas.

5.2.3.1. Análise isotópica do suco concentrado clarificado e do suco concentrado polposo de maçã - δδδδa

Para a análise isotópica do suco concentrado clarificado e do suco concentrado polposo de maçã, 0,35ȝL de cada suco foi acondicionado em cápsulas de estanho contendo CHROMOSORB W, empacotadas e colocadas no Analisador Elementar (EA 1108 – CHN – Fisons Elemental Analyzer) para serem queimadas (flash combustão) a 1020ºC liberando CO2. Este gás é comparado com o CO2 padrão para a determinação do į‰13C no

5.2.3.2. Análise isotópica do açúcar purificado extraído do suco concentrado clarificado e do suco concentrado polposo de maçã - δδδδa

Na análise isotópica de carbono-13 dos açúcares contidos nos sucos concentrados clarificados e nos sucos concentrados polposos de maçã, foi utilizada a metodologia de extração e purificação proposta por Koziet et al. (1993). Nesta metodologia, 100ml do suco de maçã foi centrifugado a 4500rpm (1610g) durante 5 minutos para a separação dos sólidos insolúveis. Em seguida, ao líquido sobrenadante, foi adicionado 4g de hidróxido de cálcio (Pa), e aquecido a 90ºC, sendo novamente centrifugado, nas mesmas condições, para retirar os ácidos orgânicos. Adicionou-se ácido sulfúrico a 2N ao líquido sobrenadante até corrigir o pH para 5 e, em seguida, o líquido foi novamente aquecido até atingir a temperatura de 90°C. Após o resfriamento à temperatura ambiente, a amostra foi mantida a 4ºC por 12h, para remoção do excesso de cálcio. Neste período ocorreu a formação de CaSO4 o qual foi desprezado. O sobrenadante (solução açucarada) foi preparado para ser

injetado no Analisador Elementar conforme descrito no item 5.2.3.1.

5.2.3.3. Análise isotópica da polpa lavada com água e da polpa lavada com acetona extraída dos sucos concentrados polposos de maçã - δδδδa

Uma alíquota de 100mL suco concentrado polposo foi centrifugada a 4500rpm (1610g) durante 5 minutos para separação dos sólidos insolúveis. A polpa (sólido insolúvel), depositada no fundo do tubo da centrífuga, recebeu 20mL de água destilada e agitada durante 1 minuto para a suspensão dos sólidos insolúveis. Em seguida, o volume do tubo foi completado para 50mL com água destilada e, novamente, centrifugado a 4500rpm (1610g) durante 5 minutos. Repetiu-se este procedimento por mais quatro vezes (°Brix = zero). Ao final deste procedimento, obteve-se a fração de polpa lavada com água.

Na metodologia proposta por Rossmann et al. (1997), os sólidos insolúveis (polpa) passam por tratamento com acetona para eliminar os carotenóides, uma vez que estes podem interferir no enriquecimento isotópico relativo.

Para a obtenção da polpa lavada com acetona, seguiu o mesmo procedimento da polpa lavada com água. Após as cinco lavagens com água, foram adicionados 30mL de acetona pura. A amostra foi agitada em agitador magnético durante 1

minuto, completada com 20mL de água e novamente centrifugada nas condições já citadas. Repetiu-se mais uma vez este procedimento e, em seguida, foram feitas mais duas lavagens com água destilada. Ao final deste procedimento, obteve-se a fração de polpa lavada com acetona.

As amostras das frações da polpa lavada com água e da polpa lavada com acetona foram transferidas para tubos ependorffs, liofilizadas e preparadas para serem colocadas no Analisador Elementar conforme citado no item 5.2.3.1.

5.2.3.4. Análise isotópica do açúcar de cana - δδδδb

As amostras líquidas do açúcar de cana foram diluídas com água destilada até a concentração de 10ºBrix. Após este procedimento, foram transferidas para tubos ependorffs, e colocadas no Analisador Elementar conforme citado no item 5.2.3.1.

Para as amostras granuladas de açúcar, estas foram moídas em moinho criogênico de nitrogênio líquido (Spex CertiPrep 6750 Freezer/Mill) durante três minutos a temperatura de -196ºC para obter um material com textura fina (”65μm) e homogênea. Cada amostra (0,03mg) foi colocada em cápsulas de estanho para serem colocadas no Analisador Elementar conforme descrito no item 5.2.3.1.

5.2.3.5. Análise isotópica das bebidas clarificadas fabricadas em laboratório e das bebidas clarificadas comerciais de maçã - δδδδp

Para as bebidas clarificadas fabricadas em laboratório e para as bebidas clarificadas comerciais de maçã, as metodologias utilizadas na preparação das análises isotópicas estão descritas nos itens 5.2.3.1 e 5.2.3.2.

5.2.3.6. Análise isotópica das bebidas polposas fabricadas em laboratório e das bebidas polposas comerciais de maçã - δδδδp

Para as bebidas polposas fabricadas em laboratório e para as bebidas polposas comerciais de maçã, as metodologias utilizadas nas preparações das análises isotópicas estão descritas nos itens 5.2.3.1, 5.2.3.2 e 5.2.3.3.

5.2.3.7. Análise isotópica dos aditivos utilizados em sucos, néctares e refrigerantes comerciais de maçã

As amostras líquidas e as amostras granuladas dos aditivos utilizados na fabricação de sucos, néctares e refrigerantes comerciais de maçã seguem a metodologia descrita no item 5.2.3.4.

5.2.4. Definição dos melhores parâmetros de įa, įb e įp para quantificar a participação de fonte C3 em suco clarificado e refrigerante de maçã fabricados em

laboratório

Na fabricação em laboratório do suco clarificado e refrigerante de maçã foram utilizados, como matérias-primas, suco concentrado clarificado (įa), suco concentrado clarificado para refrigerante (įa) e açúcar de cana (įb). Dos sucos concentrados clarificados ainda foi extraída a fração do açúcar purificado (įa).

Do suco clarificado e do refrigerante de maçã fabricados em laboratório (įp), também foi possível analisar isotopicamente a fração do açúcar purificado extraído dessas bebidas (įp). Agrupando os sucos concentrados clarificados e sua fração em įa, açúcar de cana em įb e as bebidas fabricadas em laboratório e suas frações em įp, na equação da diluição isotópica simples (įa * C3 + įb * C4 = įp) (Equação 4), foi possível

Tabela 6. Combinações realizadas entre o enriquecimento isotópico relativo dos sucos concentrados clarificados (įa), açúcar purificado extraído dos sucos concentrados clarificados (įa), açúcar de cana (įb), suco clarificado e refrigerante de maçã fabricado em laboratório (įp) e a fração do açúcar purificado extraído dessas bebidas (įp).

įa (į13C) įb (į13C) įp (į13C)

Suco Concentrado Clarificado Açúcar de Cana Bebida Fabricada em Laboratório Suco Concentrado Clarificado Açúcar de Cana _{Bebida Fabricada em Laboratório} Açúcar Purificado Extraído da Açúcar Purificado Extraído do

Suco Concentrado Clarificado Açúcar de Cana Bebida Fabricada em Laboratório Açúcar Purificado Extraído do

Suco Concentrado Clarificado Açúcar de Cana

Açúcar Purificado Extraído da Bebida Fabricada em Laboratório

Mensurando o enriquecimento isotópico relativo do suco concentrado clarificado, do açúcar purificado extraído do suco concentrado clarificado, do açúcar de cana, das bebidas de maçã fabricadas em laboratório e do açúcar purificado extraído das bebidas fabricadas em laboratório, é possível calcular, para cada combinação (Tabela 6), a quantidade de fonte C3 nas amostras de suco clarificado e nas amostras de refrigerante de maçã fabricado

em laboratório (valor prático). Estes resultados foram comparados com a quantidade de fonte C3 calculada pelo balanço de massa de sólidos solúveis (°Brix) (valor teórico). A combinação

com os resultados práticos mais próximos dos resultados teóricos foi definida para quantificar a concentração de carbono originário de fonte C3 nos produtos comerciais.

5.2.5. Definição dos melhores parâmetros de įa, įb e įp para quantificar a