Amerika Birleşik Devletleri

4.8.1. Perfusão transcardíaca da solução fixadora

Com o animal devidamente anestesiado, foi feita uma incisão na cavidade torácica. Uma agulha de insulina, fixada na ponta de um fragmento de mangueira de um equipo foi introduzida no coração esquerdo. Uma pequena incisão foi feita no coração direito (para drenagem do sangue e excesso de solução fixadora). Em seguida fez-se perfusão de aproximadamente 10 mL de solução fisiológica 0,9% em massa de NaCl, com auxílio de uma seringa de mesmo volume que foi instalada na outra ponta do fragmento da mangueira. Este procedimento tem como objetivo a

remoção do máximo de sangue do corpo do animal. Posteriormente foi realizada perfusão de aproximadamente 10 mL de solução fixadora de Palay (contendo 1% de formaldeído e 1% de glutaraldeído em tampão de fosfato 0,12 M e pH 7,2) (ANDRADE; MADEIRA; PAULA-BARBOSA, 1995). Após a perfusão, o hipocampo foi imediatamente retirado, estabilizado manualmente ao longo do eixo septotemporal (diminuir a curvatura anatômica do órgão), e acondicionado em recipiente contendo a mesma solução fixadora (CHEN et al., 2008).

4.8.2. Microtomia, coloração e preparo das lâminas

As metades de cada amostra de hipocampo (ou seja, os hemi-hipocampos) foram selecionados para o preparo dos cortes aleatoriamente, sem distinção entre direito e esquerdo. Subsequentemente as amostras foram embebidas em solução de ágar a 10% e sequencialmente e completamente cortadas em secções de 100 µm de espessura, seguido por uma secção de 1 mm de espessura, alternadamente. Foi utilizado para este procedimento um aparelho de microtomia especializado, o vibrótomo (modelo VT 1000 S; Leica, Wetzlar, Alemanha). Os cortes foram realizados ortogonalmente ao eixo longitudinal do hipocampo e uma fração (1/10) dessas secções emparelhadas (finas e grossas) foram aleatoriamente selecionadas. O intervalo médio (K) entre os pares de secção foi de 400 µm. As secções finas foram recolhidas em lâminas de vidro, coradas com uma solução alcóolica 1% de azul de toluidina, desidratadas em concentrações progressivas de etanol, montadas com lamínula e DPX (Fluka, Buchs, Suíça), e utilizadas não só para padronizar a posição exata da camada CA1 no hipocampo, ou seja, como secções de mapeamento (HOSSEINI-SHARIFABAD; NYENGAARD, 2007), mas também para a estimativa do volume do hipocampo fixado e da camada CA1, utilizando o princípio de Cavalieri.

As secções de maior espessura foram utilizadas para produzir cortes verticais, uniformes, e aleatórias conforme descrito por (BADDELEY; GUNDERSEN; CRUZ- ORIVE, 1986). As secções foram posicionadas em uma placa transparente (de Silgard) no centro de um círculo com 36 (360º) divisões equidistantes ao longo do

perímetro. Em seguida um número aleatório entre 0 e 36 foi gerado utilizando uma tabela de números aleatórios para amostragem (HOSSEINI-SHARIFABAD; NYENGAARD, 2007). Subsequentemente, uma guia de corte transparente contendo linhas foi colocada sobre a secção espessa no mesmo ângulo selecionado. Finalmente, com uma lâmina de barbear, barras foram cortadas, sendo orientadas pelas linhas da guia de corte. As barras foram giradas 90° em torno do eixo vertical das secções. As barras a partir de cada secção foram, então, reembebidas em solução de ágar a 10% e exaustivamente cortadas a 50 µm de espessura utilizando o vibrótomo. As secções em barras foram recolhidas em lâminas de vidro, coradas com uma solução alcóolica 1% de azul de toluidina, desidratadas em concentrações progressivas de etanol, montadas com lamínula e DPX (Fluka, Buchs, Suíça), e utilizadas para estimar simultaneamente número e o volume dos neurônios de CA1, CA3 e do GD. As imagens foram obtidas utilizando microscópio Leica DMR acoplado com uma câmera digital PLA622 (Pixellink, Ottawa, Ontario, Canadá) e com auxílio do software New Cast Visiopharm, Hoersholm, Denmark (versão 2.16.1.0) (Figura 15). A área do quadro de contagem utilizado foi de 5000 µm2 _{(GUNDERSEN, 1978).}

Antes de iniciar o processo de contagem, uma calibração foi realizada para determinar a distribuição de neurônios ao longo da espessura do corte e estabelecer a altura do disector (sonda estereológica para a contagem de objetos em uma secção de tecido grosso), que era de 20 µm. As espessuras das secções foram medidas em cada segundo campo de visão, utilizando o ponto central no quadro de contagem imparcial. O núcleo do neurônio foi definido como a unidade de contagem.

Neste estudo, toda a estrutura do hipocampo, incluindo camada de células granulares do giro dentado e a camada de células piramidais de CA1, e CA3 (Figura 16), foram definidas em todos os níveis do corte de acordo com as coordenadas estereotáxicas publicadas anteriormente (PAXINOS; FRANKLIN, 2004). A área CA1 do hipocampo foi escolhida para posterior análise estereológica porque constitui uma das áreas corticais mais simples e mais examinadas, porque o progresso recente tem sido feito nesta área para explicar a diversidade neuronal, e devido a alta complexidade dos circuitos neuronais GABAérgico e principalmente glutamatérgico que suportam o processamento comportamental (KLAUSBERGER; SOMOGYI, 2008).

Figura 15. Microscópio Leica DMR acoplado com uma câmera digital PLA622 (Pixellink, Ottawa, Ontario, Canadá) e software New Cast Visiopharm, Hoersholm, Denmark (versão 2.16.1.0) utilizados para captação e processamento das imagens estereológicas.

Figura 16. Detalhe de uma secção coronal de hipocampo mostrando toda a estrutura do órgão em camadas.

As pontas de seta indicam os limites camada CA1. Devido às pequenas dimensões da camada CA2, esta foi incluída na camada piramidal CA3, nomeada CA3/CA2. (Corado com azul de toluidina. Barra de escala: 100 µm) (LADD et al., 2010).

4.8.3. Volumes das camadas do hipocampo

O volume das camadas do hipocampo (V) foi estimado utilizando o princípio de Cavalieri nas secções finas (100 µm de espessura). Assim, V = ΣP · ap · BA · K,

onde P é o número de pontos de teste que afetam o tecido (utilizou-se, em média, 100 pontos); ap é a área associada a cada ponto de teste; BA é o avanço significativo do bloco (ou espessura média das secções = 100µm); e K é a distância entre as secções da amostra. A variância de erro do estimado de Cavalieri (CE) foi determinada de acordo com Nyengaard (1999).

4.8.4. Neurônios totais

Esta estimativa (N) foi calculada em cada hemi-hipocampo multiplicando a densidade numérica de neurônios pelo o volume da camada. Portanto, temos:

V Nv

N   . O número total bilateral foi obtido através da multiplicação do volume do hemi-hipocampo por 2 (CHEN et al., 2008). A variância de erro do número total de neurônios foi estimada como mostrado por Gundersen et al. (1999) e Nyengaard (1999).