2. ÖLÜM ve HAZ
2.2. Ölüm ve Oluş
2.1. Amostragem
Neste estudo, as amostras de urina e saliva de indivíduos sem neoplasia (grupo de controlo) foram doadas por voluntários saudáveis e as amostras de indivíduos com neoplasia da mama e do pulmão (grupo oncológico) foram colhidas na Unidade de Hemato-Oncologia do Centro Hospitalar do Funchal (CHF), aquando da consulta dos diferentes pacientes. O número total de amostras de urina colhidas foi de 30 para o cancro da mama e de 16 para o cancro do pulmão. Quanto às amostras salivares, foram colhidas um total de 36 amostras para o cancro da mama e 13 para o cancro do pulmão. Para o grupo de controlo foram recolhidas 16 urinas e 16 salivas. Na Tabela 1 está resumida a amostragem usada neste estudo.
Tabela 1- Resumo do número de amostras colhidas e estudadas por género, faixa etária, hábitos
tabágicos e por neoplasia.
Tipo de Amostra Grupo M Sexo F Idades Fumador
Urina Cancro da mama 0 30 35-81 2 Cancro do pulmão 8 8 40-80 12 Controlo 7 9 18-63 0 Saliva Cancro da mama 0 36 39-73 4 Cancro do pulmão 6 7 40-78 10 Controlo 7 9 18-63 0
As amostras de urina foram colhidas num frasco coletor de urinas e as amostras de saliva em vials de vidro de 8 mL. Após a colheita, as amostras foram armazenadas à temperatura de -80°C até serem analisadas.
Todos os indivíduos que participaram neste estudo foram selecionados de forma aleatória e voluntária, depois de devidamente informados sobre a investigação. Adicionalmente, este estudo foi submetido à aprovação da Comissão de ética do CHF (Anexos no formato digital, pág.102)
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2.2. Metodologia Analítica
O estabelecimento do padrão metabolómico volátil da urina e da saliva de pacientes com cancro da mama e do pulmão e ainda de indivíduos saudáveis foi realizada recorrendo à técnica HS-SPME seguida de GC-MS. Às matrizes de dados obtidas foram aplicadas ferramentas estatísticas com o intuito de identificar potenciais biomarcadores através da comparação dos perfis voláteis de pacientes oncológicos e do grupo de controlo.
2.2.1. Otimização dos parâmetros HS-SPME
De modo a selecionar as melhores condições para a extração dos metabolitos voláteis presentes nas amostras salivares, foram testadas cinco fibras, nomeadamente a CAR/PDMS, PDMS, PDMS/DVB, DVB/CAR/PDMS e PA (todas fabricadas pela Supelco, Bellefonte, U.S.A). Para além disto foram testados os tempos (30, 45 e 60 min) e temperaturas de extração (28, 38 e 48±1°C), pH, agitação, força iónica (0%, 5%, 10%, 15% e 20% de cloreto de sódio) e volume das amostras (1 mL, 2 mL e 4 mL). As condições ótimas foram determinadas pela totalidade das áreas dos picos obtidos em cada parâmetro e pelo número de metabolitos extraídos.
É importante referir que a fibra utilizada nas extrações foi prévia e diariamente condicionada no injetor do GC durante 6 min a 250°C com a finalidade de remover possíveis interferentes presentes na fibra.
Após a extração, procedeu-se à identificação e quantificação, por GC-MS, dos metabolitos voláteis da urina e da saliva.
2.2.2. Preparação da amostra e Extração HS-SPME
Na análise das amostras de saliva dos grupos controlo e oncológico foram utilizadas alíquotas de 1 mL em vials de 4 mL, aos quais foram adicionados 0,125 mL de ácido clorídrico (5 M) para ajustar o pH, e por último 10% de cloreto de sódio (m/v) com o objetivo de promover o salting-out dos metabolitos.
Quanto às amostras de urina do grupo controlo e oncológico, alíquotas de 4 mL foram transferidas para um vial de 8 mL e adicionados 0,5 mL de ácido clorídrico (5 M) e 0,8 g de cloreto de sódio, tal como desenvolvido por Silva et al [54].
De seguida, tanto para as amostras de saliva como para as amostras de urina, o vial foi selado com uma tampa constituída por um septo de politetrafluoretileno (PTFE) /silicone.
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Para as amostras salivares a fibra foi exposta ao headspace durante 45 minutos a 37±1ºC. Em relação às amostras de urina, a fibra foi colocada em contacto com o headspace durante 60 minutos a 50±1ºC (Silva et al [54]). Todas as extrações foram efetuadas com uma velocidade de agitação constante de 800 rpm com o objetivo de facilitar a difusão dos analitos para o
headspace. Ao terminar a extração, a fibra foi recolhida e retirada do vial e finalmente
colocada no injetor do cromatógrafo gasoso durante 6 min. Desta forma, os metabolitos voláteis retidos na fibra foram desorvidos e transportados para a coluna cromatográfica.
2.2.3. Condições para análise por GC-MS
A realização das análises cromatográficas foi efetuada num sistema GC-qMSD composto por um cromatógrafo gasoso Agilent Technologies 6890 acoplado a um MS Agilent 5973 N e equipado com uma coluna capilar de sílica fundida BP20 (SGE, Dortmund, Alemanha) com um filme de espessura 60 m × 0,25 mm de espessura do filme × 0,25 µm de diâmetro interno. O seguinte protocolo cromatográfico foi empregue na separação dos analitos antes da análise por MS: a temperatura inicial da coluna foi de 45°C, mantendo-se constante durante 5 min, posteriormente foi programada para aumentar 2°C min-1 até aos 150°C, permanecendo nessa temperatura durante 10 min. De seguida aumentou-se 15°C min- 1 até aos 220°C, mantendo-se deste modo até ao final. O tempo total de corrida foi assim de 87 min. O fluxo da coluna foi mantido constante a 1 mL min-1 usando Hélio (Helium N60, Air Liquide) como gás de arraste. As injeções foram operadas utilizando o modo splitless e a temperatura do injetor encontrava-se a 250°C. Para o MS Agilent 5973 N, as temperaturas para a linha de transferência, para o quadrupolo e para a fonte de iões foram 270, 150 e 230°C, respetivamente. As aquisições foram realizadas no modo full scan com ionização por impacto eletrónico, sendo que a energia de ionização utilizada foi de 70 eV e a série de aquisição de massas entre 30 – 300 m/z.
A identificação dos metabolitos foi conseguida através da interpretação manual do espectro e através da comparação dos espectros obtidos com os da biblioteca NIST05, com um grau de similaridade igual ou superior a 75%.
2.3. Análise Multivariada
A técnica de análise estatística multivariada, mais precisamente a PLS-DA foi utilizada para verificar a distribuição das variáveis dos grupos oncológicos e controlo e detetar metabolitos voláteis que possam indicar diferenças ou similaridades entre as amostras estudadas. As amostras foram normalizadas por quartil. Esta é uma técnica que torna duas
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distribuições idênticas de um ponto de vista estatístico. Após a normalização, os dados foram homogeneizados entre zero e um. Todos cálculos foram efetuados usando o software Unscrambler X 10.2, 2013.
A robustez dos dados obtidos foi realizada por MCCV com 500 iterações. O conjunto de calibração continha 60% dos dados e o conjunto de validação 40%. Com os resultados obtidos verificou-se o poder preditivo, a taxa de classificação, a sensibilidade e especificidade. A sensibilidade e a especificidade foram descritas a partir da matriz de confusão dando origem a um mapa ROC que, por sua vez, permitiu avaliar a significância dos resultados. A sensibilidade foi calculada através da razão entre os verdadeiros positivos (amostras de indivíduos diagnosticados com cancro) e o número total de amostras modeladas que corresponde à soma dos verdadeiros positivos e falsos negativos. Por outro lado, a especificidade foi determinada a partir da relação entre os verdadeiros negativos (amostras do grupo controlo) e o número total de amostras de indivíduos saudáveis, isto é, a soma dos verdadeiros negativos e dos falsos positivos.
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