1. ÖLÜM ve TEZAHÜRLERĐ
1.4. Ölüm ve Korku
A saliva humana é um fluido biológico altamente variável e individualizado. Trata-se de uma mistura de secreções provenientes das glândulas salivares, do fluido crevicular gengival (exsudato inflamatório que pode ser colhido na margem gengival ou no interior do sulco gengival), de bactérias, células epiteliais e de restos alimentares [76, 77]. A saliva regula a microbiologia oral, afetando o tecido oral macio, assim como o esmalte dentário, e está envolvida na ingestão de alimentos e no processo de pré-digestão [77].A composição da saliva varia com o ritmo circadiano, em resposta a fatores fisiológicos e patológicos, como estímulos de paladares e aromas, varia com influências metabólicas associadas à idade, com o ciclo menstrual, exercício físico e estado psicoemocional. Outros fatores que afetam a composição da saliva incluem o uso de fármacos e/ou substâncias narcóticas e ainda o estado de hidratação do indivíduo [78]. Os VOMs exógenos também aparecem no perfil químico da saliva [79].
A presença de um composto na saliva é determinada pela sua funcionalidade química e caraterísticas estruturais. As moléculas neutras passam do sangue para a saliva com uma maior eficiência do que as moléculas hidrofílicas e ionizadas [80]. A saliva possui um nível elevado de água e um conteúdo proteico relativamente baixo, o que significa que não é comum nesta matriz a presença de compostos ligados fortemente a proteínas [81-83].Apesar disso, na saliva estão presentes proteínas antibacterianas, antivirais, e antifúngicas, como a lisozima, lactoferrina, peroxidases, anidrase carbónica, cistatinas (inibidores de proteases da cisteína), a imunoglobulina A [84] e glicoproteínas do tipo mucina, que são responsáveis pelo aspeto viscoso da saliva. A saliva é constituída ainda por compostos macromoleculares e por pequenas substâncias orgânicas, que incluem hormonas, aminoácidos, péptidos e óxido nítrico e VOMs. Finalmente é de referir que mais de 300 espécies bacterianas já foram
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descritas na cavidade oral, dando estas um contributo significativo para a composição química da saliva através da secreção dos seus produtos metabólicos [84].
Diversos VOMs de origem ambiental podem surgir igualmente na saliva, transportados através do trato digestivo, dos pulmões, ou absorvidos pela pele, até à corrente sanguínea, sendo posteriormente filtrados para a saliva [84]. A composição volátil da saliva poderá ser um excelente indicador da exposição química ambiental e ocupacional [84].
A variabilidade individual observada no perfil volátil da saliva é devida a diversas variáveis, incluindo os hábitos pessoais, a dieta, o ambiente e fatores genéticos. Uma vez que existem diversas vias de entrada dos VOMs para a saliva, a explicação da sua origem e da sua via de entrada é uma tarefa difícil e complexa [84].
A saliva é um fluido importante para a deteção de condições patológicas do corpo humano, pois os seus componentes atuam como um “espelho da saúde do organismo” [85]. Além disso, a saliva é um bom indicador dos níveis de várias substâncias presentes no plasma/soro. Nos últimos anos, o interesse científico pela análise da saliva tem aumentado não só para os vários compostos presentes na saliva (drogas, poluentes e hormonas), mas também para a sua relação com doenças bacterianas, virais e sistémicas (revisto em [85]). Portanto, este tipo de análise pode ser utilizada como um método não invasivo para a monitorização de concentrações plasmáticas de fármacos e outras substâncias, para a avaliação da gravidade de certas doenças, para o diagnóstico precoce e prognóstico e acompanhamento do estado pós-terapia [48, 85, 86].
Assistidas por vários avanços tecnológicos, a metabolómica, a bioinformática, a genómica e a proteómica, são hoje campos de investigação muito ativos e a saliva tornou-se uma matriz mais atrativa. No entanto para que os diagnósticos baseados na saliva sejam úteis, devem ser cumpridos dois requisitos: descoberta de biomarcadores na composição da saliva e avaliação da sua sensibilidade e especificidade [48]. Um método efetivo de screening salivar deve ter uma sensibilidade e uma especificidade adequadas, ter custos acessíveis, ser não invasivo, possuir rendimento elevado, ser robusto e rápido e poder ser utilizado por pessoal não qualificado [48, 85, 87]. Preferencialmente, esta metodologia deverá cumprir os critérios ASSURED definidos pela OMS. Embora estes critérios tenham sido originalmente desenvolvidos para as doenças sexualmente transmissíveis, o seu carácter abrangente torna-os possíveis e desejáveis de serem aplicados em métodos de ensaio de outras patologias, particularmente aquelas com maior incidência e taxas de mortalidade nos países com menores recursos económicos [88].
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Alguns estudos têm mostrado que existe uma abundância de biomarcadores salivares acessíveis e que permitem distinguir várias doenças. O primeiro biomarcador encontrado na saliva para o cancro da mama foi o HER2/neu [89]. Num estudo efetuado por Zhang et al [86] foram identificados na saliva quatro RNA mensageiros (KRAS, MBD3L2, ACRV1 e
CDKL3) que permitiram distinguir pacientes com cancro do pâncreas de indivíduos saudáveis
e para além disto, estes apresentaram sensibilidade e especificidade elevadas.
Estes resultados aumentaram as perspetivas referentes ao papel importante do diagnóstico salivar na deteção de cancros e de doenças sistémicas [86, 90]. Alguns investigadores defendem mesmo que a glândula salivar não deveria ser vista apenas como um sensor de alterações na composição do plasma, mas ser considerada como um amplificador do sinal relativo a células tumorais [87].A análise da saliva pode assim ser um método eficaz para o diagnóstico e prognóstico do cancro, bem como para a monitorização da resposta terapêutica do paciente após o tratamento. Logo, torna-se muito importante desenvolver ferramentas de diagnóstico salivar, especialmente na identificação de grupos de risco elevado, nomeadamente, pacientes com lesões pré-malignas e pacientes com história prévia de cancro [85].
A amostragem e análise da saliva tem sido usada igualmente para outros fins bastante interessantes, nomeadamente para medir o marcador de ansiedade 3-metoxi-4- hidroxiphenilglicol [91], diagnosticar a gota a partir de níveis elevados de ácido úrico [92], fornecer um diagnóstico preliminar e rápido da doença renal através da determinação de ácido úrico e ácido p-amino hipúrico [93], caracterizar perfis farmococinéticos de dehidroepiandrosterona e cortisol após a administração de corticosteroides [94], indicar o uso de canábis, medindo Δ9-tetrahidrocanabinol [95] e estudar os fatores dietéticos, como ácidos gordos [96] e cafeína [97] . A caracterização da saliva também pode ser utilizada no caso de doenças sistémicas, tais como a fibrose cística, esclerose múltipla, diabetes mellitus, esclerose alcoólica do fígado, SIDA e disfunção renal (revisto em [98]), ou ainda na monitorização da exposição ao tolueno e a outros VOMs perigosos [79].
Em estudos farmacocinéticos [99, 100] e forenses têm sido igualmente reportados na saliva metabolitos de substâncias ilícitas como por exemplo o tetraidrocanabinol, canábis, benzodiazepínicos e antidepressivos tricíclicos [101]. Em suma, a saliva representa um fluido corporal sistémico potencialmente adequado para a monitorização de compostos orgânicos em estudos fisiológicos, metabólicos, farmacocinéticos, forenses e toxicológicos [84].
A natureza não invasiva e a simplicidade na recolha, armazenamento e transporte da amostra, tornam a saliva uma alternativa promissora ao sangue e à urina na determinação de
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perfis bioquímicos e na procura de marcadores biológicos [81]. Para além disto, o seu processamento não acarreta custos elevados e está sempre disponível, possibilitando uma amostragem repetida para a monitorização ao longo do tempo. [48, 85, 87].
Apesar de todas as vantagens da utilização da saliva como ferramenta de diagnóstico, não podem ser ignorados alguns problemas. Muitos biomarcadores salivares propostos foram descobertos de forma independente e usando um número muito pequeno de amostras, pelo que ainda estão longe de cumprir os critérios analíticos necessários à sua validação enquanto biomarcadores [48]. Existem igualmente algumas limitações relacionadas com a amostragem de volumes suficientes de saliva, nomeadamente por parte de crianças e indivíduos com determinados estados fisiológicos que podem reduzir a produção de saliva. Do mesmo modo, os métodos de colheita podem influenciar a composição da amostra e induzir interferências nos métodos analíticos. O fluxo de saliva estimulado por exemplo, através de pastilha elástica, versus o fluxo não estimulado, ou o uso de certos aparelhos como o algodão ou cotonetes colocados na boca podem influenciar a composição final da saliva [84].
Após a recolha das amostras, é importante ter em conta os procedimentos de manuseamento e armazenamento da saliva, uma vez que as bactérias metabolizam compostos presentes nas amostras e alteram a integridade das mesmas [81]. Muitos componentes salivares possuem um tempo de meia-vida biológico curto e degradam-se rapidamente após a colheita da amostra. Adicionalmente, quanto mais voláteis os componentes forem, mais facilmente são perdidos ou adsorvidos/absorvidos na superfície dos materiais utilizados durante a colheita e o armazenamento. Os procedimentos de armazenamento de amostras salivares começam com o congelamento, através do qual as amostras são estabilizadas e inibida a degradação provocada pelas bactérias. É recomendado que as amostras salivares sejam imediatamente aliquotadas após a colheita e armazenadas a 4°C, a -20°C ou a -80°C, dependendo do tempo de armazenamento proposto. Existem outras formas de estabilizar as amostras, como a inibição da atividade enzimática ou bacteriana por adição de inibidores ou agentes desnaturantes. Porém, estes procedimentos são demorados, aumentam o número de passos do método analítico e, ao mesmo tempo, conduzem a uma maior perda de compostos salivares voláteis. Tal pode originar um material amostrado que não representa fidedignamente a composição salivar original [81].
Muitos destes desafios foram ultrapassados através da utilização da SPME, uma vez que esta técnica é simples, rápida e flexível. Apesar da SPME apresentar vantagens sobre as técnicas de amostragem de saliva já estabelecidas para os VOMs, ainda existem desafios
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relacionados com a padronização da colheita, estabilização e armazenamento deste fluido [81].