HİSTOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Doç. Dr. Şerife TÜTÜNCÜ

HİSTOLOJİK TANI

YÖNTEMLERİ

Doç. Dr. Şerife TÜTÜNCÜ

Amaç



Sahada ve laboratuvarlarda çalışacak

veteriner hekimlere tanı amacı ile kullanılan

histolojik muayene teknikleri ve özel

inceleme metotlarının verilmesini sağlamak.

 Histoloji bitkisel ve hayvansal dokuların mikro

anatomisini inceleyen Biyolojik ve Tibbi bilimlerin temel taşı olan bir bilim dalıdır.

 Dokuları oluşturan unsurlar olan hücre ve hücreler arası maddenin boyutlarının çok küçük olması bu bilim dalını mikroskop ve mikroskopta incelemeyi sağlayan metodlardaki gelişmelere bağımlı hale getirmiştir.

 Işık mikroskopların gelişimi ve büyütme güçlerinin artışı, ilgili bilim dalları moleküler biyoloji, kimya, biyokimya, fizyoloji, immunoloji ve patolojideki

gelişmeler hücre ve hücrenin oluşturduğu doku ve organlar hakkında bilgilere ulaşılmasını sağlamıştır.

 Ayrıca yapısal özelliklerin fonksiyonel özellikler ile birlikte incelenmesi yapı fonksiyon ilişkilerini

inceleyen histofizyolojinin doğmasını sağlamıştır.

 Histofizyoloji ile birlikte anormal ve hastalıklı

yapıların ayırt edilebilmesi için normal ve sağlıklı bir dokunun özelliklerinin bilinmesinin önemi daha çok ortaya çıkmıştır.

 Bütün bunlar beraberinde histolojide kullanılan basit ve klasik inceleme metodlarının gelişimini yeni ve ileri tekniklerin ortaya çıkışını sağlamıştır.

 Histoloji bilimi ile uğraşan araştırmacılar rutin olarak ışık mikroskopi tekniğini kullanır.

 Daha detaylı bilgilere ise daha yüksek büyütme gücüne sahip Transmission Elektron Mikroskop ( TEM ) ve

Scanning Elektron Mikroskop ( SEM ) ile ulaşılabilmiştir.

 Moleküler düzeydeki ayrıntılara ise Histokimya, İmmunohistokimya, Otoradyografi gibi birtakım yöntemlerle ulaşılabilmiştir.

 Histolojinin daha anlaşılabilir olması için; mikroskop altında görülen iki boyutlu görüntü ile üç boyutlu yapı arasında ilişki kurulmasını sağlamak ve dokuların

mikroskop altında incelenmesini sağlayan teknikler ve mikroskoplar hakkında bilgi sahibi olmak önemlidir.

Mikroskoplar

 Mikroskop çıplak gözle görülemeyen oluşumları tanımlamak ve değerlendirmek amacıyla ışın ve optik ilkelerine dayanarak yapılmış büyütme ve görme cihazıdır.

 İlk basit mikroskop 17. yüzyılda Anthony Von Leeuwenhoek ( 1632-1723 ) tarafından yapılmış ve ilk defa protozoon,

bakteri, böcek ve bitkileri incelemiştir.

 Aynı yıllarda Robert Hook(1665) geliştirdiği mikroskobuyla şişe mantarını incelemiş ince kesitlerde gördüğü küçük kutucuklara cellula – hücre adını vermiştir.

 Daha sonraki yıllarda birkaç mercek kombine edilerek daha yüksek büyütme gücüne sahip mikroskoplar geliştirilmiş ve gözle görülen ışığın dalga boyu izin verdiği ölçüde büyüten mikroskoplar geliştirilmiştir

 Teknolojik gelişmeler ile birlikte farklı ışınların ve değişik merceklerin geliştirilmesiyle de günümüzde kullanılan mikroskoplar ortaya çıkmıştır.

 Mikroskopta elde edilen görüntü gözle incelenebilir, ekrana iletilebilir ya da fotoğraflanabilir.

 Mikroskoplar kullanılan ışık kaynakları ve optik sistemlerine göre gruplandırılır.

 Elektron mikroskopta elektronlardan yararlanılır, diğerlerinde suni ışık kaynakları kullanılır.

 Suni ışık, Tungsten madeninden yapılmış filamentten, karbon elektrodlardan, yüksek basınçlı civa buharlı

ampullerden yararlanılarak elde edilir.

Kullanılan ışık kaynağına göre mikroskoplar

 Gözle görülebilen ışığı kullanan mikroskoplar,

 Işık mikroskobu

 Polarizasyon mikroskobu

 Faz Kontrast mikroskobu

 Karanlık Saha mikroskobu

 Gözle görülemeyen

elektromanyetik dalga ya da elektronları ışık kaynağı

olarak kullanan mikroskoplar

 Fluoresan mikroskobu

 Ultraviole mikroskobu

 Konfokal Mikroskop

 Elektron mikroskobu



Mikroskoplarda elde edilen görüntü sadece

gözle incelenebileceği gibi elde edilen

görüntünün fotoğrafı da çekilebilir. Bu işleme

Mikrofotoğrafi denir.



Cismin görüntüsünün sadece objektif ile

şekillendirilip oküler kullanmaksızın

fotoğraflanmasına ise Lup Fotoğrafisi adı

verilir.

Işık Mikroskobu



Işık mikroskoplarda gözün görebildiği ışık

ışınları kullanılmaktadır.



Işık mikroskoplarda boyalı preperatlar

arkadan aydınlatılarak incelenir.



Işık mikroskoplar mekanik ve optik

kısımlardan oluşur.

I. Mekanik Bölüm: Optik sistem dışındaki metal ya da sertleştirilmiş yapay malzemelerden oluşmuş tüm

kısımları kapsar;

1. Mikroskop ayağı( Taban ): Mikroskobun yerle temas eden kısmıdır, dikdörtgen, poligonal, U ya da V harfi biçiminde olabilir. Ayak üzerinde veya içinde aydınlatma kaynağını taşır.

2. Mikroskop gövdesi( Kolu ): Ayak üzerinde yer alan optik sistem ve diğer mekanik kısımları taşıyan bölümdür.

3. Preperat tablası: İncelenecek preperatın yerleştirildiği bölümdür. Kondansörün üzerinde yer alır, kondansörden gelen ışığın geçmesini sağlayacak bir delik vardır. Aynı zamanda preperatın ileri – geri sağa –sola hareketini sağlayan bir ayar mekanizması( şaryo ) da bulunur.

4. Objektiflerin takıldığı tabla( Revolver ): Üzerinde 4 -6 objektifin takılabildiği dönen mekanizmaya sahip mikroskop bölümüdür.

5. Tüp: Mikroskobun oküler ve revolveri taşıyan bölümüdür.

Üzerine takılan okülere göre monoküler, binoküler ve trinoküler olmak üzere 3 tipi vardır. Binoküler tüpler

gözlemcinin pupilla aralığına göre ayarlanır. Trinoküler

mikroskoplarda binoküler başlığa ek olarak fotoğraf makinesi ya da video kameranın yerleştirilebileceği bir başlık bulunur.

Gözle gördüğümüz görüntünün aynısı fotoğraf filmine veya monitöre yansıtılır.

6. Makrometre ve mikrometre Vidaları: Tablanın dikey yönde az ( mikrometre ) ya da çok ( makrometre )

hareketlerle kaymasını sağlayarak görüntünün netliğini sağlayan bölümdür.

II. Optik Bölüm

1. Ayna veya ışık kaynağı: Güneş veya lambadan gelen ışınlar ayna yardımı ile mikroskop içine

yansıtılır ( ışık yeterli ise aynanın düz yüzü, yetersiz ise çukur yüzü kullanılır).

Güneş ışınları her istenildiğinde elde edilebilecek bir kaynak olmadığından düşük voltajlı elektrik lambaları mikroskobun gövde ya da ayağına

monte edilerek kullanılır. Ampulden gelen ışınlar doğrudan diyaframa gönderilir.

2. Kondansör: Tablanın altında yer alan ve dikey olarak hareket edebilen ışık kaynağından gelen ışınları kırarak cisim üzerinde toplayan

merceklerden oluşmuş bir bölümdür. Objektifin büyütme gücü ile ilişkili olarak ışığın şiddetini ayarlar.

Diyafram: Işık kaynağından gelen ışık demetinin çapını kontrol etmek için kullanılır. İleri araştırma mikroskoplarında ışık kaynağının üstünde veya kondansörün altına yerleşiktir. Diyafram ışık çapı aracılığı ile en iyi kontrast ve resolusyonu elde etmeyi sağlar. Işık şiddeti lambanın reostası ile ayarlanır.

3. Objektif: Metal bir tüp içinde uygun biçimde yerleştirilmiş birkaç mercekten oluşan ve cismin ilk büyütmesini gerçekleştiren optik kısımdır.

 Objektifler oluşturdukları görüntüdeki ışık kusurlarının azlığına ve çokluğuna göre kromatik, apokromatik

objektiflerdir.

 Kromatik olan objektifler ışığın kalitesi bakımından en fazla kusurlu olanlardır.

 En iyi olanlar apokromatik objektifler olmasına rağmen, yine de görüntü kalitesi bakımından sahada tam anlamı ile net görüntü alınamaz. Alanın orta kısmı netleşince kenarlar, kenarlar netleşince orta kısım netliğini kaybeder.

 Bu kusurun giderilmesi içinde objektiflere plan özellik katılmış ve bugün kullanılan plan apokromat objektifler geliştirilmiştir.

 Objektiflerin özellikleri belirli simgelerle işaretlenir, Örneğin plan( Pl ), apokromatik( Apo ), Akromatik(

Achr ) gibi.

 Objektifler üzerinde ayrıca sırası ile kullanılacağı

mikroskobun tüp uzunluğu, lamel kalınlığı, objektifin büyütme gücü ve nümerik apertür yazılır.

 Tüp uzunluğu ve lamel kalınlığı üst sırada ve küçük puntolarla mm olarak, objektifin büyütme gücü ve numerik apertür alt satırda büyük puntolarla yazılır.

 Objektifler kuru sistemli ya da immersiyon objektifleri olarak da ikiye ayrılabilir.

 Kuru sistemli objektiflerde objektif ile preperat arasında hava bulunur,

 İmmersiyon objektiflerinde immersiyon yağı,

sediryağı, gliserin veya su bulunabilir. Arada bulunan sıvı daha fazla ışık toplama amaçlıdır.

 İmmersiyon objektiflerinde alt uçta halka tarzında siyah bir çizgi veya hangi sıvı ile kullanılacağını bildiren bir yazı bulunabilir.

4. Oküler: Objektifin şekillendirdiği ilk görüntüyü tekrar büyüten ve ışık kusurlarını düzelten merceklerden oluşmuş bir bölümdür.

 Okülerin büyütme gücü objektiflerde olduğu gibi üzerine yazılır. Kullanım sırasında büyük görüntü elde etmek için çok yüksek büyütmeli oküler kullanmak sadece objektif görüntüsünün detaylarını kaybetmesine neden olur.

 Detaylı büyütmeler için büyük büyütmeli objektifler ile

küçük büyütmeli okülerler, küçük büyütmeli objektifler ile büyük büyütmeli okülerler kullanılmalıdır.

 Okülerler ışık kusurlarını düzeltmek üzere farklı türlerde yapılmışlardır; En çok kullanılanlar plankompenzasyon okülerleridir, plan akromat ve plan apokromat objektiflerle birlikte kullanılırlar.

Mikroskoplarda Işık Ayarı

 Mikroskopta iyi bir görüntü elde etmek için optik kalite yanında ışık kalitesi de ayrıca önem taşımaktadır.

 Mikroskoplarda optik kaliteyi etkileyen faktörler:

Ayna(düz veya konkav yüz ), Kondansör, Objektif, Okülerler.

 Işık kalitesini etkileyen faktörler ise kullanılan ışığın tür ve pozisyonu, ışık filtreleri ve poz süresidir.

 Aydınlık saha mikroskopları ile çalışırken gün ışığından ya da değişik voltajlarda sun’i ışık kaynaklarından

yararlanılır.



Fluoresan mikroskopi için civa buharlı özel

lambalar veya karbon ark ışığı kullanılır.



Işık kaynağının pozisyon ve ışık ayarı aynı

zamanda mikrofotoğrafi için de en iyi sonuç

veren Köhler ışık ayarı denen bir ayarlamayı

gerektirir. Köhler prensibine göre

aydınlatmada preperatın aydınlatılan kısmı

daraltıp genişletilebilir.

MİKROSKOBUN KULLANIMI VE PREPERATIN İNCELENMESİ

 Mikroskobun elektrik bağlantısı yapıldı mı; fiş takılı mı?

 Mikroskobun ışık ayarı yapıldı mı?

 Objektif ve oküler yerine düzgün olarak yerleştirilmiş mi?

 Binoküler mikroskoplarda iki göz için iki okülerin

mesafe ve netlik ayarı yapıldı mı? Bütün bu işlemler yapıldı ise preperat incelemeye başlayabiliriz;

Polarizasyon Mikroskobu

 Bu mikroskop biyoloji alanında ışığı çift kırıcı özelliği olan objelerin incelenmesinde kullanılır.

 Bu mikroskoplar yardımıyla ışığı çift kıran maddenin en ince yapısı rahatlıkla gözlenebilir.

 Polarizasyon mikroskoplarında nikol prizmaları

denilen iki prizma vardır. Bu prizmalar polarizör ve analizör olarak adlandırılır.

Faz Kontrast Mikroskobu

 Faz Kontrast mikroskobu, materyallerin canlı ve hareketli olarak incelenmesini sağlayabilen bir mikroskoptur.

 Temel prensip, ışığın farklı kırılma indislerinin

hücre ve hücre dışı oluşumlardan geçerken hızının ve yönünün değiştirilmesini sağlama esasına

dayanır.

Karanlık Saha Mikroskobu

 Bu tip mikroskoplarda kondansörün ortası

kapalıdır. Işık, mikroskoba dik değil eğik olarak gelir.

 Doku kültürlerinde canlı hücreler, çekirdekcik, çekirdek zarı, mitokondri ve lipid damlacıkları parlak, zemini oluşturan sitoplazma ise karanlık olarak görülür.

Fluoresan Mikroskobu

 Bazı maddeler kısa dalga boyundaki ışığı absorbe ederek uzun dalga boyunda ışığa çevirir. Bu olaya fluoresan adı verilir.

 Böylece fluoresan veren yapılar görülür.

 En çok kullanılan boya akridin orange'dır.

 Fluoresan maddeye göre sarı, yeşil ve mavi renkler izlenebilir.

Ultraviole Mikroskop

 Bu mikroskoplarda ultraviole yayan bir ışık

kaynağı, ultravioleyi geçirebilen bir optik sistem ve fluoresan bir ekran kullanılır.

 Nükleik asitler gibi bazı hücre yapıları ultraviole ışığını şiddetle absorbe ederler.

 Bu absorbsiyon ultraviole mikroskobu ile incelenir.

Konfokal Mikroskop

 Fluoresan mikroskobun bir gelişmiş modelidir.

 Floresan boyama yapılan preparatların incelenmesinde kullanılır.

 Diğer mikroskoplardan farkı, kesit kalınlığı içinde farklı seviyelerde netleşmeyi sağlayıp kesitten daha ince optik kesitler alınmasını sağlamasıdır.

Elektron Mikroskobu

 EM larla yüzbinlerle ifade edilen büyütmelere ulaşmak

mümkündür. Bu tip mikroskoplarda görüntü elde etmek için elektronlar kullanılır.

 Elektronlar negatif elektrik yüklü kısa dalga boylu partiküllerdir.

 EM nun çalışma prensibi bu vakumlu tüp içinde

elektronların yön değiştirmesi esasına dayanır. İki tip EM vardır:

TEM: İki boyutlu görüntü verir. Kesit özelliklerini ortaya koyar.

SEM: Üç boyutlu görüntü verir. Yüzey özelliklerini ortaya çıkarır.

Lenfosit

Bazofil granülosit

T lenfosit

B lenfosit