DNA izolasyonu

(1)

DNA izolasyonu

(2)

DNA izolasyonu

• Nükleik asitler kalıtsal bilgileri depolar ve aktarırlar.

• Prokaryot DNA’larına proteinler bağlı değildir, fakat ökaryotların çekirdek DNA’sına histon proteinleri bağlıdır.

• DNA yapısındaki fosfat grupları nedeni ile yüksek ölçüde negatif yüklenmiştir. DNA histon adı verilen pozitif yüklü proteinlerin etrafına sarılarak kromozomlar halinde düzenlenir.

• Deoksiribonükleik asit (DNA) ekstraksiyonu moleküler ve forensik analizler için ilk adımdır. DNA deri, kan, tükrük, mukus, kas, kemik dokusu gibi birçok biyolojik materyalden izole edilebilir.

• DNA ekstraksiyonu, DNA'nın proteinlerden, zarlardan ve hücrede

bulunan diğer hücresel materyallerden ayrıldığı prosestir.

(3)

DNA izolasyonu

• Mevcut DNA ekstraksiyon prosedürlerinin çoğu ortak noktalara sahiptir.

DNA'nın ekstraksiyonu genellikle üç temel adımı izler:

1) Hücreler lizis edilir.

2) DNA diğer hücre bileşenlerinden ayrılır. Proteinler denature edilir.

3) DNA çökelmeyi artırıcı bazı kimyasallarla ve santrifüjle çöktürülür (örn.:

izopropanol) ve izole edilir.

• Hücre zarı, aşağıdaki yöntemlerden herhangi biriyle bozulur: akışkanlığı arttırmak için ısı, disülfit bağlarını azaltmak için dithiothreitol (DTT) veya zarı bozmak için sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi bir deterjan kullanılması.

• DNA’dan uzaklaşması için proteinler, ısı denatürasyonu veya proteinaz K da dahil olmak üzere sindirim enzimleri tarafından inaktive edilir.

(4)

DNA izolasyonu

• DNA molekülünün yapısının hücredeki proteinden, membrandan farklı olması bize onu diğer moleküllerden ayırma şansını sağlar.

Bu hafta uygulayacağımız yöntemde deterjan, tuz, ve alkol yardımı ile DNA’yı basit şekilde izole edeceğiz.

• Deterjan (SDS) hücre yapısını bozar. Tuz olarak kullanılacak NaCl, DNA’yı selektif olarak bağlar. NaCl aynı zamanda DNA’nın

proteinlerden kurtulmasından sonra stabilize olması için kullanılır.

(5)

DNA izolasyonu

• Proteinlerin denatürasyonu, SDS (sodyum dodesil sülfat), proteinaz K, fenol ve organik çözücüler kullanılarak

sağlanır.

• SDS güçlü bir deterjandır ve proteinleri DNA’dan ayırıp denatüre etmektedir.

• Proteinaz K, SDS ile aktif olan ve proteinleri 65

^o

C’de

parçalayan bir enzimdir.

(6)

DNA izolasyonu

• DNA’nın çöktürülmesi kimyasal olarak isopropanol gibi çökelmeyi artırıcı bazı kimyasallar ile yapılır. DNA sulu fazda organik faza göre daha çözünürdür. Nükleik

asitlerin polarlıkları oldukça yüksektir. Bu yüzden polar solventlerde çözünebilirler, apolar solventlerde ise

çökmektedirler.

• Bu yüzden ortama isopraponal eklenmesi ile DNA’nın

çökmesi kolaylaşır.

(7)

DNA izolasyonunda kullanılan cihazlar

Homojenizatör

• Sıvı içine yayılan partikülleri mikro hale getirme ve yayma imkanı sağlayan bir cihazdır.

• Ürün, geçiş başlığı ve darbe başlığı arasındaki küçük aralığa bağlı olarak yüksek basıncın etkisinde kalmakta ve böylece mikro

boyutlarda parçalanmaktadır.

• Bu yöntemle çalışılacak doku ya da hücrelerin çeper ve zar yapıları parçalanıp yok edilmektedir.

• Elde edilen karışıma “homojenat” adı verilir. Hücre yapısı ortadan kalkmış olan homojenatta, serbest ya da organeller içerisindeki

hücre bileşenleri (zar parçaları ve bir miktar parçalanmamış hücre)

parçalanmanın yapıldığı ortamda dağılmış bir süspansiyon halinde

bulunur.

(8)

DNA izolasyonunda kullanılan çözeltiler

-ÇET (çekirdek eritici tampon) çözeltisi -SDS (sodyum dodesil sülfat) çözeltisi -NaCl çözeltisi

-İzopropanol

(9)

DNA izolasyonu

Materyal: Rat karaciğeri

• Karaciğer dokusu çekirdek eritici tampon çözelti ile buz banyosu içinde homojenize edilir.

• Homojenat üzerine 0,5 ml SDS çözeltisi ilave edilir.

• 10 dk buz banyosunda bekletilir ve 2 ml 6 M NaCl çözeltisi ilave edilir.

• Çözelti vorteks yardımı ile iyice karıştırılır.

• Karıştırdıktan sonra santrifüj işlemi yapılır.

• Santrifüjden sonra üstteki sıvı kısım (supernatant) başka bir tüpe alınır.

• Eşit hacimde izopropanol ilave edilir ve tüp hafifçe alt-üst edilerek

DNA iplikçiklerinin görünür hale gelmesi sağlanır.

(10)

Kaynaklar

• Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Pratik föyü-2004

• Practical Biochemistry (2015). Aljebory, A., And Alsalman, A.

• A Laboratory Text Book of Biochemistry, Molecular Biology and Microbiology (2014)

• Lehninger Principles of Biochemistry- 5th Edition (2008)

• Elkins, K. M. (2013). DNA Extraction. Forensic DNA Biology, 39–52.