ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
BAZI TÜRLERİN TAYİNİ İÇİN MODİFİYE AMPEROMETRİK ENZİM ELEKTROTLARIN GELİŞTİRİLMESİ
Berna DALKIRAN
KİMYA ANABİLİM DALI
ANKARA 2015
Her hakkı saklıdır.
i ETİK
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez içindeki bütün bilgilerin doğru ve tam olduğunu, bilgilerin üretilmesi aşamasında bilimsel etiğe uygun davrandığımı, yararlandığım bütün kaynakları atıf yaparak belirttiğimi beyan ederim.
07/07/2015
Berna DALKIRAN
ii ÖZET Doktora Tezi
BAZI TÜRLERİN TAYİNİ İÇİN MODİFİYE AMPEROMETRİK ENZİM ELEKTROTLARIN GELİŞTİRİLMESİ
Berna DALKIRAN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Esma KILIÇ
Bu çalışmada Co3O4 nanopartiküller ve MWCNT veya grafen ile modifiye edilen optimum bileşimde beş ayrı elektrot hazırlandı: (i) MWCNT/CH/GCE, (ii) Co3O4/CH/GCE, (iii) MWCNT/Co3O4/CH/GCE, (iv) Grafen/GCE ve (v) Grafen/Co3O4/CH/GCE. Dönüşümlü voltametri ve elektrokimyasal empedans spektroskopisi yöntemleri ile en uygun elektrotların MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve Grafen/Co3O4/CH/GCE olduğu belirlendi. Bu modifiye elektrot yüzeyine ksantin oksidaz, galaktoz oksidaz veya glutamat oksidaz enzimleri immobilize edilerek ksantin, galaktoz veya glutamat tayini için amperometrik enzim elektrotlar hazırlandı.
Ayrıca hazırlanan tüm elektrotların yüzey morfolojisi taramalı elektron spektroskopisi ile karakterize edildi. İlgili türlerin amperometrik tayini, enzimatik reaksiyonlar sonucu oluşan hidrojen peroksitin sabit potansiyelde yükseltgenmesine ve/veya indirgenmesine dayanarak yapıldı. Hazırlanan enzim elektrotların optimum çalışma koşulları belirlendikten sonra performans faktörleri ve analitik uygulanabilirliği araştırıldı. Ksantin tayini için geliştirilen
XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE, XO/HRP/MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve
XO/Grafen/Co3O4/CH/GCE’ların doğrusal çalışma aralıkları sırasıyla 2,0×10-7-1,6×10-5; 2,0×10-5-3,6×10-4 ve 5,0×10-7-8,0×10-5 M; gözlenebilme sınırları 9,0×10-8; 2,0×10-6 ve 2,0×10-7 M; duyarlıkları 9,62; 3,14 ve 6,58 µA/mM olarak belirlendi. Bu elektrotlar ile balıkta ksantin tayininin yüksek bir geri kazanım ile yapılabileceği görüldü. Galaktoz için hazırlanan GaOx/MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve GaOx/Grafen/Co3O4/CH/GCE’ların doğrusal çalışma aralığı sırasıyla 9,0×10-6-1,0×10-3 M ve 9,0×10-6-6,0×10-4 M; gözlenebilme sınırları 9,0×10-7 M ve 3,0×10-6 M; duyarlıkları 0,79 ve 0,43 µA/mM olarak bulundu ve elektrotlar serumda galaktoz tayinininde kullanıldı. Glutamat için geliştirilen GluOx/Co3O4/Grafen/CH/GCE’un doğrusal çalışma aralığı ise 4,0×10-6-6,0×10-4 M; gözlenebilme sınırı 2,0×10-6 M ve duyarlığı 0,73 µA/mM olup analitik uygulanabilirliği ile ilgili çalışmalar devam etmektedir.
Temmuz 2015, 164 sayfa
Anahtar Kelimeler: Amperometri, enzim elektrot, kobalt oksit, çok duvarlı karbon nanotüp, grafen, ksantin, galaktoz, glutamat.
iii ABSTRACT Ph. D. Thesis
DEVELOPMENT OF MODIFIED AMPEROMETRIC ENZYME ELECTRODES FOR DETERMINATION SOME SPECIES
Berna DALKIRAN Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry
Supervisor: Prof. Dr. Esma KILIÇ
In this study, five different optimal composition electrodes modified with Co3O4 nanoparticules and MWCNT or graphene were prepared. These electrodes are (i) MWCNT/CH/GCE, (ii) Co3O4/CH/GCE, (iii) MWCNT/Co3O4/CH/GCE, (iv) Graphene/GCE and (v) Graphene/Co3O4/CH/GCE. Based on the results of voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy measurements, the most suitable electrodes were found to be MWCNT/Co3O4/CH/GCE and Graphene/Co3O4/CH/GCE. Amperometric enzyme electrodes for xanthine, galactose and glutamate determination prepared by the immobilization of xanthine oxidase, galactose oxidase and glutamate oxidase on the surface of these modified electrodes. In addition, the surface morphology of all electrodes were characterized by scanning electron spectroscopy. Amperometric determination of these species is based on the oxidation or reduction of the enzymatically produced hydrogen peroxide at a certain applied potential.
Optimum working conditions, performance factors and analytical applicability of the proposed enzyme electrodes were investigated. Linear working range of the
XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE, XO/HRP/MWCNT/Co3O4/CH/GCE and
XO/Graphene/Co3O4/CH/GCE were found to be 2,0×10-7-1,6×10-5; 2,0×10-5-3,6×10-4 and 5,0×10-7-8,0×10-5 M with detection limits of ,9,0×10-8; 2,0×10-6 and 2,0×10-7 M respectively.
Sensitivities of these electrodes were 9,62; 3,14 and 6,58 µA/mM respectively. High recoverires were found for the determination of xanthine in fish with these electrodes. Lineer working range of the electrodes GaOx/MWCNT/Co3O4/CH/GCE and GaOx/Graphene /Co3O4/CH/GCE prepared for galactose determination were found to be 9,0×10-6-1,0×10-3 M and 9,0×10-6-6,0×10-
4 M, respectively. Detection limit and sensitivity of these electrodes were found as 9,0×10-7 M and 3,0×10-6 M and 0,79 and 0,43 µA/mM, respectively. These electrodes were used to measure the galactose concentration in blood. Linear working range, detection limit and sensitivity of the electrode developed for glutamate determination were 4,0×10-6-6,0×10-4 M, 2,0×10-6 M and 0,73 µA/mM, respectively and studies on the feasibility of the analytical application of this electrode have been continued.
July 2015, 164 pages
Key words: Amperometry, enzyme electrode, cobalt oxide, multi wall carbon nanotubes, graphene, xanthine, galactose, glutamate.
iv TEŞEKKÜR
Tez çalışmam sırasında ve tezimin hazırlanmasında bana her konuda yardımcı olan, ve desteğini esirgemeyen, Ankara Üniversitesi Kimya Anabilim Dalı öğretim üyesi değerli hocam Sayın Prof. Dr. Esma KILIÇ’a,
Deneysel çalışmalarım sırasında önerileriyle bana yol gösteren Tez İzleme Komitesi üyeleri Selçuk Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın Doç. Dr. Semahat KÜÇÜKKOLBAŞI ve Ankara Üniversitesi Kimya Anabilim Dalı öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Esin CANEL’e,
Doktara çalışmam sırasında bilgi ve tecrübeleriyle bana yol gösteren Sayın Doç. Dr.
Pınar Esra ERDEN’e, çalışmalarım sırasında yan yana olup birbirimize destek olduğumuz değerli çalışma arkadaşımlarım Ceren KAÇAR ve Kübra ÖZDİL İNAL’a
Tez çalışmalarımın her aşamasında hep hayatımda oldukları ve bana güven duygusunu yeniden yaşattıkları için değerli dostlarım Havva ATAŞ ve Dr. Özay MENTEŞ’e, tez yazım aşamasında karşılaştığım zorluklarda gece gündüz demeden bana yardımcı olan sayın Erdal EMİR’e,
Doktora çalışmam süresince Yurt İçi Doktora Bursu ile beni maddi olarak destekleyen Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) Bilim İnsanı Destekleme Daire Başkanlığı’na (BiDEB),
Tez çalışmalarım sırasında karşılaştığım her türlü zorlukta, yaptığım tercihlerde, kötü ve iyi her anımda yanımda olan ve beni ben yapan canım aileme içtenlikle teşekkür ederim.
Bu tez çalışması Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi Koordinatörlüğü’nce desteklenen 13L4240002 no’lu ‘Bazı Türlerin Tayini için Modifiye Amperometrik Enzim Elektrotların Geliştirilmesi’ konulu projeden temin edilen sarf malzemeler kullanılarak tamamlanmıştır.
Berna DALKIRAN Ankara, Temmuz 2015
v
İÇİNDEKİLER
TEZ ONAYI
ETİK ... i
ÖZET ... ii
ABSTRACT ... iii
TEŞEKKÜR ... iv
SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ... viii
ŞEKİLLER DİZİNİ ... x
ÇİZELGELER DİZİNİ ... xiv
1. GİRİŞ ... 1
1.1 Tezin Amacı ve Önemi ... 1
1.2 Kaynak Araştırması ... 7
1.2.1 Ksantin enzim elektrotlarla ilgili kaynak araştırması ... 7
1.2.2 Galaktoz enzim elektrotlarla ilgili kaynak araştırması ... 17
1.2.3 Glutamat enzim elektrotlarla ilgili kaynak araştırması ... 29
2. KURAMSAL TEMELLER ... 36
2.1 Ksantin ... 36
2.2 Galaktoz ... 37
2.3 Glutamat ... 38
2.4 Enzimler ... 39
2.5 Biyosensörler ... 44
2.5.1 Amperometrik Enzim Elektrotlar ... 44
2.5.2 İdeal Biyosensör Özellikleri ... 47
3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 51
3.1 Kullanılan Cihazlar ve Donanımı ... 51
3.2 Kullanılan Kimyasal Maddeler... 52
3.3 Kullanılan Çözeltiler ... 55
3.3.1 Fosfat tamponu çözeltisi ... 55
3.3.2 Hidrojen peroksit çözeltisi... 55
3.3.3 Galaktoz çözeltisi ... 55
3.3.4 Ksantin çözeltisi ... 55
3.3.5 Glutamat çözeltisi ... 56
3.3.6 Enzim çözeltileri ... 56
vi
3.3.7 Gluteraldehit çözeltisi ... 56
3.3.8 Kitosan çözeltisi ... 56
3.3.9 Diğer çözeltiler ... 57
3.4 Camsı Karbon Elektrodun Temizlenmesi ... 57
3.5 Enzimsiz Modifiye GCE’ların Hazırlanması... 57
3.6 Modifiye Amperometrik Enzimsiz Elektrotların Hidrojen Perokside ve Substrata Duyarlığının Belirlenmesi ... 58
3.7 Modifiye Elektrotların CV ve EIS Ölçümleri ... 58
3.8 Enzim Elektrotların Hazırlanması ... 59
3.9 Enzim Elektrotların Yüzey Bileşiminin Optimize Edilmesi ... 59
3.9.1 MWCNT miktarı ... 59
3.9.2 Grafen miktarı ... 59
3.9.3 Co3O4 miktarı ... 59
3.9.4 Enzim miktarı ... 60
3.9.5 Glutaraldehit derişiminin belirlenmesi ... 60
3.10 Enzim Elektrotların Optimum Çalışma Koşullarının Belirlenmesi ... 60
3.10.1 Sıcaklık ... 60
3.10.2 pH ... 60
3.10.3 Çalışma potansiyeli ... 61
3.11 Enzim Elektrotların Substrat Duyarlığının Belirlenmesi ... 61
3.12 Enzim Elektrotların Performans Faktörlerinin Belirlenmesi ... 61
3.12.1 Çalışma aralığı ve duyarlığın belirlenmesi ... 61
3.12.2 Cevap süresinin belirlenmesi ... 62
3.12.3 Tekrar kullanılabilirliğin belirlenmesi ... 62
3.12.4 Tekrar üretilebilirliğin belirlenmesi ... 62
3.12.5 Ömrünün belirlenmesi ... 62
3.12.6 Bozucu türlerin belirlenmesi ... 62
3.13 Gerçek Numune Analizi ... 63
3.13.1 Balık numunelerinin analize hazırlanması ... 63
3.13.2 Balıkta ksantin tayini ... 63
3.13.3 Kanda galaktoz tayini ... 64
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA ... 65
4.1 Modifiye Elektrotların Optimizasyonu ... 66
vii
4.1.1 MWCNT derişiminin etkisi ... 66
4.1.2 Grafen miktarının etkisi ... 67
4.1.3 Co3O4 derişiminin etkisi ... 68
4.2 Modifiye Elektrotların Yüzey Karakterizasyonu ... 70
4.2.1 MWCNT modifiye elektrotlar ... 70
4.2.2 Grafen modifiye elektrotlar ... 72
4.3 Modifiye Elektrotların Elektrokimyasal Davranışları ... 74
4.4 Modifiye Elektrotların Hidrojen Peroksit Duyarlığı ... 79
4.5 Modifiye Elektrotların Ksantin, Galaktoz ve Glutamat Duyarlığı... 81
4.6 Enzim Elektrotların Hazırlanması ... 82
4.6.1 Ksantin enzim elektrotlar ... 83
4.6.1.1 Optimum çalışma koşulları ... 86
4.6.1.2 Performans faktörleri ... 88
4.6.1.3 Analitik uygulanabilirlik ... 99
4.6.2 Galaktoz enzim elektrotlar ... 102
4.6.2.1 Optimum çalışma koşulları ... 104
4.6.2.2 Performans faktörleri ... 109
4.6.2.3 Serum numunesinde galaktoz tayini ... 116
4.6.3 Glutamat enzim elektrotlar ... 118
4.6.3.1 Optimum çalışma koşulları ... 120
4.6.3.2 Performans faktörleri ... 123
5. SONUÇ ... 130
KAYNAKLAR ... 147
ÖZGEÇMİŞ... 164
viii
SİMGELER DİZİNİ
H2O2 Hidrojen peroksit Km Michaelis-Menten sabiti NiOOH Nikel-oksi-hidroksit Eind İndirgenmiş enzim
Eyük Yükseltgenmiş enzim
Zʺ Sanal empedans
Zʹ Gerçek empedans
Kısaltmalar
ATP Adenozin trifosfat
MWCNT Çok duvarlı karbon nanotüp
ITO İndiyum kalay oksit
MSG Mono sodyum glutamat GCE Camsı karbon elektrot
CH Kitosan
DNA Deoksiribonükleik asit
CF Kafein
SEM Taramalı elektron mikroskobu
CV Dönüşümlü voltametri
EIS Elektrokimyasal empedans spektroskopisi c-MWCNT Karboksilli çok duvarlı karbon nanotüp EDC N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil) karboimid NHS N-hidroksi süksinimid
NA Noradrenalin
AC Asetaminofen
XN Ksantin
AA Askorbik asit
DA Dopamin
UA Ürik asit
HXN Hipoksantin
DPV Diferansiyel puls voltametri
FTIR Fourier dönüşümlü infrared spektrofotometre XRD X-ışını kırınım cihazı
TEM Geçirimli elektron mikroskobu HRP Horseradish peroksidaz
GA Glutaraldehit
BSA Bovin serum albumin
PB Prusya mavisi
GaOx Galaktoz oksidaz
SWCNT Tek duvarlı karbon nanotüp PVF Polivinilferrosen
AFM Atomik kuvvet mikroskobu
ix Au-Np Altın nanopartikül
MV Metil viyolojen
GLDH Glutamat dehidrogenaz GluOx Glutamat oksidaz SAM
U
Kendi kendine oluşan tek tabaka Ünite
x
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1.1 Ksantinin açık formülü ... 36
Şekil 1.2 Galatozun açık formülü ... 37
Şekil 1.3 Glutamik asitin açık formülü ... 38
Şekil 2.1 Biyosensörün genel gösterimi ... 44
Şekil 2.2 Biyosensörlerin sınıflandırılması ... 44
Şekil 3.1.a. Elektrokimyasal analiz cihazı, b. elektrokimyasal hücre standı ... 51
Şekil 4.1.a. GCE ile MWCNT derişimi, b. 0,5 mg/mL, c.1,0 mg/mL ve d.1,5 mg/mL olan MWCNT/CH/GCE’ların dönüşümlü voltamogramları (0,10 M KCl içeren 5,0 mM Fe(CN)63-/4- redoks probunda, oda sıcaklığı) ... 67
Şekil 4.2.a. GCE ile grafen miktarı, b. 5 µL, c. 7,5 µL ve d. 10 µL olan Grafen/GCE’ların dönüşümlü voltamogramları (0,10 M KCl içeren 5,0 mM Fe(CN)63-/4- redoks probunda, oda sıcaklığı) ... 68
Şekil 4.3.a. GCE ile Co3O4 derişimi, b. 0,5 mg/mL, c. 1,0 mg/mL ve d. 1,5 mg/mL olan MWCNT/Co3O4/CH/GCE’ların dönüşümlü voltamogramları (0,10 M KCl içeren 5,0 mM Fe(CN)63-/4- redoks probunda, oda sıcaklığı) ... 69
Şekil 4.4.a. GCE ile Co3O4 derişimi, b. 0,5 mg/mL, c. 1,0 mg/mL ve d. 1,5 mg/mL olan Co3O4/CH/Grafen/GCE’ların dönüşümlü voltamogramları (0,10 M KCl içeren 5,0 mM Fe(CN)63-/4- redoks probunda, oda sıcaklığı) ... 69
Şekil 4.5 Modifiye elektrotların SEM görüntüleri: a. CH/GCE, b. Co3O4/CH/GCE, c. MWCNT/CH/GCE, d. MWCNT/Co3O4/CH/GCE, e. XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve f. Nafyon/GaOx/MWCNT/Co3O4/CH/GCE ... .71
Şekil 4.6 Modifiye elektrotların SEM görüntüleri: a. Grafen/GCE, b. Co3O4/CH/Grafen/GCE, c. Nafyon/XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE, d. Nafyon/GaOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE ve e. Nafyon/GluOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE ... 73
Şekil 4.7 Dönüşümlü voltamogramlar: a. CH/GCE, b. GCE, c. Co3O4/CH/GCE, d. MWCNT/CH/GCE ve e. Co3O4/MWCNT/CH/GCE ( 0,10 M KCl içeren 5,0 mM Fe(CN)63-/4 redoks probunda, Ѵ=50 mV/s) ... 75
Şekil 4.8 Nyquist eğrileri: a. CH/GCE, b. GCE, c. Co3O4/CH/GCE, d. MWCNT/CH/GCE ve e. Co3O4/MWCNT/CH/GCE (0,10 M KCl içeren 5,0 mM Fe(CN)63-/4 redoks probunda) ... 76
Şekil 4.9 Dönüşümlü voltamogramlar: a. CH/GCE, b. GCE, c. Grafen/GCE, d. Co3O4/CH/GCE ve e. Co3O4/CH/Grafen/GCE ( 0,10 M KCl içeren 5,0 mM Fe(CN)63-/4 redoks probunda, Ѵ=50 mV/s) ... 77
xi
Şekil 4.10 Nyquist eğrileri: a. CH/GCE, b. GCE, c. Grafen/GCE, d. Co3O4/CH/GCE, ve e. Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,10 M KCl içeren
5,0 mM Fe(CN)63-/4- redoks probunda) ... 78
Şekil 4.11 Modifiye elektrotların H2O2 duyarlılığı: a. MWCNT/CH/GCE, b. Co3O4/CH/GCE, c. Co3O4/MWCNT/CH/GCE ve d. GCE (0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ... 80
Şekil 4.12 Modifiye elektrotların H2O2 duyarlılığı: a. Grafen/CH/GCE, b. Co3O4/CH/GCE, c. Co3O4/CH/Grafen/GCE ve d. GCE (0,05 M pH
7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ... 80 Şekil 4.13 Modifiye elektrotların ksantinduyarlılığı: a. MWCNT/CH/GCE,
b. Co3O4/CH/GCE ve c. Co3O4/MWCNT/CH/GCE (0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ... 81
Şekil 4.14 Modifiye elektrotların ksantinduyarlılığı: a. Grafen/CH/GCE, b. Co3O4/CH/GCE, c. Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ... 82
Şekil 4.15 Elektrotların cevabına enzim miktarı etkisi: a.
XO/Co3O4/MWCNT/CH/GCE (0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı, ksantin derişimi; 0,1 mM ), b. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı, ksantin derişimi:
0,06 mM) ve c. XO/HRP/Co3O4/MWCNT/CH/GCE (0,05 M pH 7,0
fosfat tamponu, oda sıcaklığı, ksantin derişimi: 0,1 mM ) ... 85 Şekil 4.16 Elektrotların cevabına pH’ının etkisi: a. XO/Co3O4/MWCNT/CH/GCE
(ksantin derişimi: 0,1 mM) ve b. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE (ksantin derişimi: 0,06 mM) (0,05 M fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ... 86
Şekil 4.17 Elektrotların cevabına çalışma potansiyelinin etkisi:
a. XO/Co3O4/MWCNT/CH/GCE (ksantin derişimi: 0,1 mM), b. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE (ksantin derişimi: 0,06 mM) ve c. XO/HRP/Co3O4/MWCNT/CH/GCE (ksantin derişimi: 0,1 mM) (0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, oda sıcaklığı) ... 88
Şekil 4.18 a. XO/Co3O4/MWCNT/CH/GCE’un cevabına substrat derişiminin etkisi, b. XO/Co3O4/MWCNT/CH/GCE’a ait kalibrasyon grafiği (N=3) ve c. i-t grafiği (0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V,
oda sıcaklığı) ... 90
Şekil 4.19 a. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE’un cevabına substrat derişiminin etkisi, b. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE’a ait kalibrasyon grafiği (N=3), c. i-t grafiği (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V,
oda sıcaklığı) ... 91 Şekil 4.20 XO/HRP/Co3O4/MWCNT/CH/ GCE’a ait kalibrasyon grafiği
(içteki grafik: 0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı -0,30 V, oda sıcaklığı) ... 92
xii
Şekil 4.21 Michaelis Menten sabitleri (Km) : a. XO/Co3O4/MWCNT/CH/GCE (0,05M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ve b. XO/Co3O4/CH/Grafen/ GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu,
Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ... 93 Şekil 4.22 Elektrotların tekrar kullanılabilirliği: a. XO/Co3O4/MWCNT/CH/GCE
(0,05M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ve b. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ... 95 Şekil 4.23 Elektrotların ömrü: a. XO/Co3O4/MWCNT/CH/GCE enzim (0,05 M pH
7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı, ksantin derişimi: 0,1 mM) ve b. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı, ksantin
derişimi: 0,06 mM) ... 96 Şekil 4.24 Ksantin miktarının zamanla değişimi : a. ve b. oda sıcaklığında (222ºC),
c. buzdolabında (+4ºC) ve d. derin dondurucu ( ̶ 18ºC) ... 101 Şekil 4.25 Elektrotların cevabına enzim miktarı etkisi: a.
GaOx/Co3O4/MWCNT/CH/GCE ve b. GaOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37°C, galaktoz
derişimi: 0,2 mM) ... 104 Şekil 4.26 Elektrotların cevabına sıcaklığın etkisi: a.
GaOx/Co3O4/MWCNT/CH/GCE ve b. GaOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, galaktoz derişimi:
0,2 mM) ... 105 Şekil 4.27 Elektrotların cevabına pH’ının etkisi: a. aOx/Co3O4/MWCNT/CH/GCE
ve b. GaOx/Co3O4/Grafen/CH/GCE (0,05 M fosfat tamponu,
Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37°C, galaktoz derişimi: 0,2 mM) ... 106 Şekil 4.28 Elektrotların cevabına çalışma potansiyelinin etkisi:
a. GaOx/Co3O4/MWCNT/CH/GCE ve b. GaOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, 37°C, galaktoz derişimi: 0,2 mM) ... 107
Şekil 4.29 Elektrotların cevabına glutaraldehit derişiminin etkisi:
a. GaOx/Co3O4/MWCNT/CH/GCE ve b. GaOx/Co3O4/Grafen/CH/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37°C, galaktoz derişimi: 0,2 mM) ... 108
Şekil 4.30 a. GaOx/Co3O4/MWCNT/CH/GCE’un cevabına substrat derişiminin etkisi, b. GaOx/Co3O4/MWCNT/CH/GCE’a ait kalibrasyon grafiği ve c. i-t grafiği (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37°C, N=3) ... 110 Şekil 4.31 a. GaOx/Co3O4/CH/ Grafen/GCE’un cevabına substrat derişiminin
etkisi, b. GaOx/Co3O4/CH/ Grafen/GCE’a ait kalibrasyon grafiği ve c. i-t grafiği (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V,
37°C, N=3) ... 111
xiii
Şekil 4.32 Michaelis Menten sabitleri (Km) : a. GaOx/Co3O4/CH/ Grafen/GCE ve b. GaOx/Co3O4/CH/ Grafen/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu,
Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37°C) ... 112 Şekil 4.33 Elektrotların tekrar kullanılabilirliği: a. GaOx
/Co3O4/MWCNT/CH/GCE ve b. GaOx /Co3O4/Grafen/CH/GCE
(0,05M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37°C) ... 113 Şekil 4.34 Elektrotların ömrü: a. GaOX/Co3O4/MWCNT/CH ve
b.GaOX/Co3O4/Grafen/CH (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37°C) ... 114
Şekil 4.35 Elektrodun cevabına enzim miktarı etkisi:
GluOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye
karşı +0,70 V, 37°C, glutamat derişimi: 0,2 mM) ... 119
Şekil 4.36 Elektrodun cevabına sıcaklığın etkisi: GluOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, glutamat derişimi:
0,2 mM) ... 121
Şekil 4.37 Elektrodun cevabına pH’ının etkisi: GluOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37°C, glutamat
derişimi: 0,2 mM) ... 122 Şekil 4.38 Elektrodun cevabına çalışma potansiyelinin etkisi:
GluOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M fosfat tamponu, 37°C, glutamat derişimi: 0,2 mM) ... 123 Şekil 4.39 a. GluOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE elektrodun cevabına substrat
derişiminin etkisi, b. GluOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE’a ait kalibrasyon
eğrisi ve c. i-t (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, 37°C N=3) ... 124
Şekil 4.40 Michaelis Menten sabiti (Km) : GluOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37ºC) ... 125
Şekil 4.41 Elektrodun tekrar kullanılabilirliği: GluOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37°C) ... 126
Şekil 4.42 Elektrodun ömrü: GluOx/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, 37°C) ... 127
xiv
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 1.1 Çeşitli şekerlerin MWCNT/NiOOH elektrot ile belirlenen
analitik parametreleri ... 17 Çizelge 1.2 GOD, LOD ve GAO elektrotların belirlenen analitik parametreleri ... 21 Çizelge 1.3 Glikoz, galaktoz ve glutamatın kitosan/PB elektrot ile belirlenen
analitik parametreleri ... 24 Çizelge 1.4 Sol-jel enzim sensörlerin analitik parametreleri ... 26 Çizelge 2.1 İmmobilizasyon yöntemlerinin karşılaştırılması ... 43 Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler, temin edildikleri
firmalar ve saflık dereceleri ... 53 Çizelge 3.2 Enzimler, özellikleri ve temin edildikleri firmalar ... 54 Çizelge 4.1 (a) XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve (b) XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE
ksantin enzim elektrotların cevabına çeşitli türlerin etkisi ... 97 Çizelge 4.2 Ksantin enzim elektrotların optimum çalışma koşulları ve
performans faktörleri ... 98 Çizelge 4.3 Ksantin enzim elektrotlar kullanılarak balık numunesinde
standart katma yöntemi ile elde edilen geri kazanım sonuçları... 99 Çizelge 4.4 (a) GaOx/Co3O4/MWCNT/CH/GCE ve
(b) GaOx/ Co3O4/CH/Grafen/GCE galaktoz enzim elektrotların
cevabına çeşitli türlerin etkisi ... 115 Çizelge 4.5 Galaktoz enzim elektrotların optimum çalışma koşulları
ve performans faktörleri ... 116 Çizelge 4.6 GaOx/Co3O4/MWCNT/CH/GCE modifiye galaktoz enzim elektrotlar
kullanılarak serum numunesinde standart katma yöntemi ile elde edilen geri kazanım sonuçları ... 117 Çizelge 4.7 Glutamat enzim elektrotların optimum çalışma koşulları ve
performans faktörleri ... 128
1 1. GİRİŞ
1.1 Tezin Amacı ve Önemi
Biyosensörler; enzim, doku, organel, immuno ajan, nükleik asit, mikroorganizma, reseptör molekülleri gibi biyoaktif bir bileşenin analit ile etkileşimi sonucu elektriksel, termal veya optik sinyaller yardımıyla analitin nicel ve nitel tayinine olanak sağlayan analitik cihazlardır. Biyosensörler, gıda, biyoteknoloji, ilaç, tarım gibi pek çok alanda geniş bir uygulamaya sahiptir (Rajendran vd. 2002). Günümüzde en yaygın kullanılan biyosensörler enzim temelli amperometrik sensörlerdir. Amperometri, belli bir potansiyeldeki akım şiddetinin ölçümü esasına dayanır. Amperometrik biyosensörlerde akım şiddeti, çalışma elektrodunda yükseltgenen veya indirgenen elektroaktif türlerin derişiminin bir fonksiyonudur. Amperometrik biyosensörler, uygulanan bir potansiyelde, elektroaktif türlerin kimyasal reaksiyonu sonucu üretilen akımı ölçerler ve bu akım şiddetinden, analiz edilecek türlerin derişimlerinin belirlenmesinde yararlanılır (Mello ve Kubota 2002). Örneğin, oksidaz temelli amperometrik biyosensörler, genellikle enzimatik reaksiyon sonucu oluşan H2O2’in yükseltgenmesine dayanır ve devreden geçen anodik akım oluşan hidrojen peroksitin derişimi, dolayısıyla türün derişimi ile orantılıdır (Arslan vd. 2006, Çubukcu vd. 2007, Dalkıran vd. 2014).
Enzim temelli biyosensörlerin öneminin gitgide artmasıyla, enzimlerin analitik reaktifler olarak kullanımı da artmaya başlamıştır. Ancak, enzimler suda çözündüklerinden analitik bir aygıt bileşeni olarak defalarca kullanılabilmeleri için aygıttan ayrılmaz hale getirilmeleri kısaca immobilize edilmeleri gerekir. Çapraz bağlama, kovalent bağlama, karbon pasta veya polimerik jel içinde tutuklama, elektrokimyasal adsorpsiyon gibi pek çok enzim immobilizasyon yöntemi vardır.
Elektroda enzimlerin immobilizasyonu yoluyla hazırlanan amperometrik enzim elektrotlar, yüksek seçicilik, duyarlık ve hızlı cevap verme gibi özellikler gösterirler (Xie vd. 2000, Kan vd. 2005).
Ksantin, vücut doku ve sıvılarında bulunan bir pürin bazıdır. Biyolojik sıvı ve dokularda ksantin derişiminin belirlenmesi hiperürisemi, ksantinüri, böbrek yetmezliği ve gut gibi
2
çeşitli hastalıkların teşhisi için oldukça önemlidir. Ayrıca ksantin miktarındaki artış, balık tazeliği için bir gösterge olarak kullanıldığından, ksantin tayini gıda analizlerinde de oldukça önemli bir hale gelmiştir. (Shan vd. 2009, Dalkıran vd. 2014).
Ksantinin hızlı, duyarlı, seçici ve güvenilir bir yöntemle tayin edilmesi, klinik analizler ve gıda kalite kontrolü için oldukça önemlidir. Ksantin tayini için, kapiler kolon gaz kromotografi (Pagliarussi vd. 2002), HPLC (Cooper vd. 2006), yüksek performanslı kapiler elektroforez (HPCE) (Chen vd. 2002), kapiler elektroforez‒elektrokimyasal analiz (Chen vd. 2002), kemilüminesans (Hlavay vd. 1994), spektrofotometri (Amigo vd. 2005) gibi çeşitli yöntemler vardır. Ancak bu yöntemler, genellikle zaman alıcı, pahalı cihaz parçaları, uzman kişiler ve numune ön hazırlığı gerektiren kullanışsız yöntemlerdir. Bunu aksine, amperometrik ksantin biyosensörleri kolay, hızlı, yüksek duyarlık sağlayan ve numune ön hazırlığı gerektirmeyen yöntemlerdir (Devi vd. 2011, Baş vd. 2011). Son zamanlarda, ksantin oksidaz temelli amperometrik biyosensörler ksantin tayininde yaygın olarak kullanılmaktadır. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, enzim temelli biyosensörler kullanım kolaylığı, yüksek hassasiyet ve seçicilik gibi birçok mükemmel özelliğe sahiptir. Bu tip sensörlerde de immobilizasyon için çok az miktarda XO enziminin kullanılması çok sayıda analitik tayine olanak sağlar. Bu nedenle, bu tür biyosensörlerin yapımı ve kullanımına olan ilgi artmıştır (Liu vd. 2004, Shan vd. 2009, Dodevska vd. 2010, Yuge vd. 2012). Literatürlerde, 1,4 benzokinon veya poli(vinilferrosen) modifiye Pt elektrot (Baş vd. 2011), polielektrolit çok tabakalı membran (Hoshi vd. 2006), Prusya mavisiyle modifiye edilmiş Au elektrot (Liu vd.
2004), elektrobiriktirilmiş polivinilferrosen perklorat matriksli platin (Baş vd. 2011) gibi yüzeylere ksantin oksidaz enziminin immobilize edilmesiyle hazırlanan pek çok ksantin biyosensörü vardır. Ancak bu biyosensörlerin çoğu, düşük kararlılık, düşük hassasiyet ve düşük tekrarlanabilirlik gibi dezavantajlara sahiptir.
D‒Galaktoz elzem olmayan bir monosakkarittir. Enerji üretimi ve vücuttaki birçok biyomolekülün sentezi için oldukça önemli bir substrat olan galaktozun tayini, insan sağlığı, gıda, fermantasyon ve ilaç endüstrisi için oldukça önemlidir (Kanyong vd.
2013).
3
Galaktozun klinik analizi için fluorimetri, polarimetri, kromatografi ve spektorofotometri gibi pek çok yöntem mevcuttur (Hansen vd. 1975, Parport vd. 2004, Baş vd. 2011). Ancak bu yöntemler galaktozun tayininde ortamda taneciklerin bulunması, ortamın renkli ve bulanık olması nedeniyle yeterince etkili değildir.
Biyosensörle yapılan analizlerde bu tip olaylardan kaynaklanan bozucu etkiler söz konusu değildir. Biyosensörler renk, bulanıklık veya parçacıklar tarafından etkilenmezler (Sharma vd. 2006, Şenel vd. 2011). Ayrıca bu yöntemler biyosensörlerle karşılaştırıldığında, pahalı, zaman alıcı ve karmaşıktır. Biyosensörlerle daha hızlı, kolay, ekonomik, duyarlı ve seçici tayinler yapmak mümkündür (Kan vd. 2005, Kanyong vd. 2013).
Literatürlerde, kobalt ftalosiyanin perde baskılı elektrot (Kanyong vd. 20113), polimer mikrotubulüs iletken modifiye indiyum kalay oksit (ITO) elektrot (Lee vd. 2011), poli(glisidmetakrilat‒ko‒vinilferrosen) film (Çevik ve Abasıyanık 2010), polipirol‒hidrojel kompozit film modifiye altın elektrot (Brahim vd. 2002), yüzeylerine galaktoz oksidaz enziminin immobilize edilmesiyle hazırlanan galaktoz biyosensörleri vardır. Ancak bu biyosensörlerin çoğunun, düşük kararlılık, düşük hassasiyet, dar çalışma aralığı, kısa raf ömrü ve düşük tekrarlanabilirlik gibi dezavantajları vardır
L‒glutamat, tüm organizmalarda kullanılan 20 amino asitten biridir. L‒glutamat gıda endüstrisinde aroma güçlendirici katkı maddesi olarak birçok hazır gıdada kullanılmaktadır. Ayrıca glutamat merkezi sinir sistemindeki ana uyarıcı nörotransmitterlerden biridir ve nörolojik bozukluklardan büyük ölçüde sorumludur.
Glutamat tayini için spektrofotometri, fluorimetri, kromotografi, potansiyometri, kapiler elektroforez gibi pek çok yöntem vardır (Sanchez vd. 1992, Valero ve Garcia‒Carmona 1998, Clarke vd. 2007). Bu yöntemler, uzman kişi ve numune ön hazırlığı gerektiren, karmaşık ve uzun zaman alan yöntemlerdir. Elektrokimyasal yöntemler ise, hızlı ve basit olmalarının yanı sıra, tayin edilecek tür için yüksek duyarlık ve seçicilik sağladığından, biyosensörlere dayanan yöntemlerin geliştirilmesi oldukça önemli hale gelmiştir (Maalouf vd. 2007, Chakraborty ve Raj 2007, Jamal vd. 2010,
4
Çevik ve Abasıyanık 2010, Batra ve Pundir 2013). Gıda numunelerinde bulunan glutamatın tayini için çeşitli biyosensörler geliştirilmiştir (Basu vd. 2006, Pauliukaite vd. 2006, Backer vd. 2013).
Modifiye enzim elektrotlar geliştirilirken yüksek performans elde edebilmek amacıyla çeşitli malzemeler kullanılmaktadır. Bunlar arasında; nanopartiküller, nanotüpler ve grafen gibi çeşitli malzemeler sayılabilir. Bunlardan biri olan karbon nanotüpler sadece karbon atomu içeren silindir şeklindeki bir karbon allotropudur ve S. Iijima tarafından 1991 yılında bulunmuştur. Kimyasal kararlılık, hızlı elektron aktarımı, mekanik sağlamlılık, küçük boyut, kolay modifiye edilebilirlik gibi pek çok özelliklere sahiptirler. Karbon nanotüplerin eşsiz mekanik ve fiziksel özelliklerinin yanında yüksek en/boy oranı (uzunluk/çap) ve düşük yoğunluklarından yararlanılarak kompozit malzeme sistemleri oluşturmak da mümkün olmaktadır. Oluşan nanokompozitlerin mekanik, elektriksel, termal ve morfolojik özellikleri genellikle karbon nanotüplerden farklılık göstermektedir (Dresselhaus vd. 1997, Saito vd. 1998, Li vd. 2008, Shaoo vd.
2010). Bunun yanında karbon nanotüpler, H2O2 ve NADH gibi elektroaktif türler için hızlı elektron aktarımını sağlayan bir medyatör gibi davranırlar. Enzimin aktif merkezi ile elektrot arasındaki elektron transferini artırmaları nedeniyle enzim immobilizasyonu için oldukça uygun materyallerdir. Ayrıca karbon nanotüplerin oldukça sağlam ve sert oldukları teorik ve deneysel olarak doğrulanmıştır. Bu nanomalzemelerin yüksek elektriksel ve termal iletkenliğe sahip oldukları da bilinmektedir (Dresselhaus vd. 1996, Gooding 2005, Konuk ve Oktay 2007).
Nanomateryallerden bir diğeri olan nanopartiküller küçük boyutlarından dolayı (1‒100 nm) gösterdikleri eşsiz kimyasal, fiziksel ve elektronik özellikleri ile diğer malzemelerden ayrılırlar. Boyutları ve bu özellikleri nedeniyle biyolojik sistemlere kolayca modifiye edilebilirler (Shipway vd. 2000, Wang 2005, Portakal 2008).
Nanopartiküller çok iyi iletkenlik gösterirler ve katalitik özelliklere sahiptirler. Bu nedenle, elektrokimyasal reaksiyonlarda katalizleyici olarak görev görürler ve elektrot ve enzim aktif merkezi arasında hızlı elektron transferi sağlarlar (Zhou vd. 2005, Pandey vd. 2008, Kumar ve Chen 2008). Metal ve metal oksit partiküller mükemmel fiziksel ve kimyasal özelliklerinden dolayı yüksek performanslı biyosensörlerin
5
geliştirilmesinde son yıllarda yaygın olarak kullanılmaktadır (Batra ve Pundir 2013, Dalkıran vd. 2014). Nanopartiküller geniş spesifik yüzey alanı ve yüksek serbest yüzey enerjilerinden dolayı, biyomolekülleri kuvvetli bir şekilde adsorplar ve biyosensör yapımında kullanılan biyomoleküllerin immobilizasyonunda önemli bir rol oynarlar.
Nanopartiküllerin biyosensörlerin cevap süresi, doğrusal aralık, alt tayin sınırı, tekrarlanabilirlik ve kararlılık gibi birçok özelliğini iyileştirdikleri rapor edilmiştir (Baş vd. 2011, Devi vd. 2013). Bu tez çalışmasında kullanılan Co3O4 nanopartiküller ucuz olmaları, kolay temin edilebilmeleri ve iyi bir biyouyumluluk göstermelerinin yanı sıra, H2O2’in elektrokatalitik yükseltgenmesi ve güçlü bazik çözeltilerde H2O2’in elektrokatalitik olarak indirgenmesi için iyi bir kararlılık ve aktivite göstermeleri nedeniyle son yıllarda büyük önem kazanmışlardır (Cao vd. 2008, Salimi vd. 2009).
Grafen ilk olarak 2004 yılında, Manchester Üniversitesi'nden Andre Geim ve Konstantin Sergeevich Novoselov isimli iki bilim adamının çalışmaları sonucu bulunmuştur. Karbonun bal peteği örgülü yapıları olan grafen, grafit, karbon nanotüp ve fulleren sp² hibritleşmesi sonucu oluşan iki boyutlu bir yapıdır. Karbon atomları 1s ve 2p orbitallerinin birleşimi ile 120° açılı sp² hibritleşmesi yaparken boşta kalan pz orbitalleri de grafen malzemesine sıradışı özellikler kazandırmaktadır (Novoselov vd.
2005). Elektriksel iletkenlik, geniş yüzey alanı, hızlı elektron aktarımı, yüksek mekanik sağlamlılık ve iyi biyouyumluluk özelliklerinden dolayı, grafen kullanımı son yıllarda oldukça artmıştır. Grafen, yakıt hücreleri, süperkapasitörler, piller ve elektrokimyasal sensör yapımı gibi pek çok uygulama alanına sahiptir. Bunun yanında, farklı mekanizmalar yoluyla biyolojik moleküllerin tayini için çok sayıda grafene dayalı biyosensörler geliştirilmiştir (Manjunatha vd. 2012, Fang ve Wang 2013, Parlak vd.
2013). Son zamanlarda, çeşitli metaller veya metal oksitlerin grafenlere dahil edilmesiyle; sensör, biyomedikal ve kataliz gibi pek çok uygulama alanına sahip nanokompozit yapıda fonksiyonlandırılmış grafenler elde edilmiştir (Wang vd. 2013).
Literatürde, elektrokatalitik verimliliği ve elektrodun duyarlığını artırmak için metal/metal oksit nanopartiküller ve karbon nanotüp veya grafenin bir arada kullanıldığı çalışmalar mevcuttur (Pang vd. 2009, Lin vd. 2009, Devi vd. 2012, Zhou vd. 2014 ).
Ancak ksantin, galaktoz ve glutamat türlerinin tayini için karbon nanotüp ile birçok
6
üstün özelliklere sahip olan Co3O4 nanopartikülünün bir arada kullanıldığı bir çalışma yoktur. Ayrıca bugüne kadar grafen ile birlikte herhangi bir nanopartikülün bu türlerin tayini için bir arada kullanıldığı bir çalışma literatürde mevcut değildir. Bu nedenle yapılan çalışmalar yeni ve orjinaldir.
Bu tez çalışmasında, Co3O4 nanopartiküller ve MWCNT’ler veya grafenin çeşitli kombinasyonlarda ve oranlarda kitosan (CH) biyopolimeri içerisinde dağıtılıp, camsı karbon elektrot (GCE) yüzeylerine modifiye edilmesiyle hazırlanan, ksantin, galaktoz ve glutamat türlerine duyarlı biyosensörlerin geliştirilmesi planlandı. Çok duvarlı karbon nanotüp (MWCNT) ve Co3O4 nanopartiküllerinin enzim immobilizasyonu için sadece geniş bir yüzey alanı sağlamadığı, aynı zamanda elektron transferini kolaylaştırdığı görüldü (Tseng vd. 2013). Bunun sonucu olarak yüksek duyarlığa sahip ksantin, galaktoz ve glutamat enzim elektrotlar geliştirildi.
Hazırlanan her bir elektrodun yüzey modifikasyonlarının belirlenmesi için yüzey görüntüleme tekniği olan taramalı elektron mikroskobundan (SEM) yararlanıldı. Daha sonra dönüşümlü voltametri (CV) ve elektrokimyasal empedans spektroskopi tekniğinden (EIS) yararlanılarak elektrotların performansları incelendi. Enzim elektrotların en uygun çalışma koşullarını belirlemek amacıyla tampon pH’ı, sıcaklık, çalışma potansiyeli ve elektrot bileşiminin elektrodun cevabına etkisi gibi analitik parametreler araştırıldı. Ayrıca, enzim elektrodun ilgili türe duyarlığı, cevap süresi, raf ömrü, elektrot cevabının tekrarlanabilirliği, tekrar üretilebilirlik, girişim etkisi gibi performans faktörleri incelendi çalışmamızın son kısmında, en iyi çalışma koşullarında hazırlanan enzim elektrotların, gerçek numunelerde ilgili türlerin tayininde kullanılabilirliğinin gösterildi. Bu çalışmaların literatüre katkısı yanında, klinik uygulamalarda ve gıda analizlerinde de yararlı olabileceği düşünülmektedir. Hazırlanan biyosensörlerin, türlerin hızlı, ekonomik, yerinde ve seçici tayinine olanak verecek şekilde gerçek numune analizlerinde kullanılması rutin analizler açısından büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, yapılan çalışmaların, ticari biyosensörler geliştirmeye öncülük edeceği de düşünülmektedir.
7 1.2 Kaynak Araştırması
1.2.1 Ksantin tayini ile ilgili kaynak araştırması
Ksantin tayinine yönelik geliştirilen sensör ve biyosensörler ile ilgili literatürler incelendi ve bu konuda yapılan çalışmaların bir kısmı tarih sırasına göre aşağıda kısaca özetlendi.
Dervisevic vd. (2015) tarafından yapılan çalışmada, poli (GMA‒co‒VFc) kopolimer /MWCNT kompozit film kullanılarak yeni bir ksantin biyosensör geliştirilmiştir.
Hazırlanan sensörün üretim aşamaları SEM, elektrokimyasal davranışları ise CV ve EIS kullanılarak incelenmiştir. Tüm ölçümler pH 7,0 ve 45 ºC’de Ag/AgCl elektroda karşı +0,35 V’de gerçekleştirilmiştir. Elektrodun kararlı hal akımının %95’ine ~4 s’de ulaştığı ve duyarlığının 16 mAM‒1 olduğu bulunmuştur. Elektrodun, 2‒28 µM, 28‒46 µM ve 46‒86 µM olmak üzere üç farklı derişim aralığında cevap verdiği ve gözlenebilme sınırının 0,12 µM olduğu bulunmuştur. Biyosensörün ardı ardına 15 ölçüm sonrasında başlangıç aktivitesinin hemen hemen %70’ini ve 25 gün sonunda ise başlangıç aktivitesinin %70’ini muhafaza ettiği görülmüştür. Glukoz, ürik asit, askorbik asit ve sodyum benzoat türlerinin elektrodun cevabına etkisi incelenmiş, bu türlerin elektrodun amperometrik cevabına çok az etkisi olduğu görülmüştür. Enzim elektrotlar balık tazeliğinin belirlenmesinde kullanılmışlardır. Bu amaçla balık numunesi 20 gün boyunca depolanarak, 5.; 8.; 10.; 13; 15. ve 20. günlerde ölçümler alınmış ve güne karşı ksantin derişiminin (µM) grafiğe geçirilmesiyle ksantin miktarının arttığı gösterilmiştir.
Ayrıca elektrodun analitik performansını göstermek amacıyla, balık numunelerinde standart katma yöntemi kullanılarak ksantin tayini yapılmıştır. Bu amaçla, 2,5; 5 ve 10 µM ksantin çözeltisinden uygun miktarlarda ilave edilmiş ve elektrot sırasıyla % 6,32;
% 7,06 ve % 1,31 hata ile cevap vermiştir.
Jain vd. (2015) tarafından kadmiyum oksit nanopartikül (CdO)/karboksilli çok duvarlı karbon nanotüp (c‒MWCNT) kompozit filminin Au elektrot yüzeyine elektrobiriktirilmesiyle modifiye elektrot hazırlanmıştır. Ksantin oksidaz enzimi, N‒etil‒N'‒(3‒dimetilaminopropil) karboimid (EDC) ve N‒hidroksi süksinimid (NHS)
8
ile elektrot yüzeyine kovalent olarak bağlanmıştır. Hazırlanan elektrodun optimum koşullar altında (25 ºC, Ag/AgCl elektroda karşı +0,20 V, pH 7,5 fosfat tamponu), ksantin derişimi 120 µM olana kadar doğrusal yanıt verdiği görülmüştür. Elektrodun gözlenebilme sınırı 0,05 µM (S/N=3) ve cevap süresinin en fazla 4 s olduğu bulunmuştur. 120 gün boyunca 100 ölçüm sonrasında biyosensör aktivitesinin %50’sini kaybetmiştir. Standart katma yöntemi kullanılarak balık numunelerinde ksantin tayini yapılmış ve %95,6±1,1 ve 97,3±1,7 geri kazanımlar elde edilmiştir. Ayrıca balık tazeliğinin belirlenmesi çalışmaları da yapılmış, oda sıcaklığında 20 gün boyunca depolanan balıktaki ksantin miktarının 4. günden sonra iki katına çıktığı rapor edilmiştir. Çalışmada balık numunelerinde standart katma yöntemi kullanılarak ksantin tayini de yapılmıştır. Bu amaçla, 10 ve 20 mg/L ksantin çözeltisinden 0,1 mL ilave edilmiş ve sırasıyla 95,6 ±1,1 ve % 97,3±1,7 geri kazanım sonuçları elde edilmiştir.
Zou vd. (2014) tarafından DNA ve polianilin kompozit Langmuir‒Blodgett filme dayalı (DNA/PAn‒LB) yeni bir voltametrik ksantin sensörü geliştirilmiştir. DNA/PAn‒LB sensörün karakterizasyonu, elektrokimyasal empedans spektroskopisi ve diferansiyel puls anodik voltametri yöntemleri ile incelenmiştir. DNA voltametrik sensörde ksantinin elektrokimyasal davranışları, dönüşümlü voltametri ve diferansiyel puls anodik voltametri yöntemleri kullanılarak pH 7,0 fosfat tamponunda incelenmiştir.
Optimum çalışma koşulları altında, ksantin için kalibrasyon eğrisi 7,0×10‒8 ‒ 1,0×10‒5 mol L‒1 aralığında çizilmiş ve gözlenebilme sınırı 3,0×10‒8 mol L‒1 olarak bulunmuştur.
5 ölçümün bağıl standart sapması % 2,51 olarak hesaplanmıştır. Modifiye elektrodun ürik asit ve hipoksantin varlığında ksantine mükemmel bir cevap verdiği rapor edilmiştir. Bu yöntemin uygulanabilirliği insan serum numunelerinde ksantin derişiminin belirlenmesi ile gösterilmiştir.
Amiri‒Aref vd. (2014) tarafından yapılan çalışmada, noradrenalin (NA), asetaminofen (AC), ksantin (XN) ve kafeinin (CF) aynı anda voltametrik tayini için flavanoid nanoyapılı sensörler geliştirilmiştir. Fonksiyonlu çok duvarlı karbon nanotüp modifiye edilmiş camsı karbon elektrot yüzeyine luteolinin elektrobiriktirilmesiyle modifiye elektrotlar hazırlanmıştır (Lt/fMWCNT/GCE). Hazırlanan elektrotların elektrokimyasal özellikleri EIS ile incelenmiştir. Tüm çalışmalar pH 7,0 ve oda sıcaklığında yapılmıştır.
9
NA, AC, XN ve CF için diferansiyel voltamogram pik akımları derişimleri boyunca doğrusal şekilde artmış ve NA, AC, XN ve CF için doğrusal çalışma aralıkları sırasıyla 0,7‒100,0 µM, 0,9‒80,0 µM, 1,0‒70,0 µM ve 10,0‒110,0 µM olarak bulunmuştur. NA, AC, XN ve CF için gözlenebilme sınırları ise sırasıyla 0,53, 0,78, 0,65 ve 3,54 µM olarak bulunmuştur. Optimum koşullar altında N‒asetil‒L‒sistein, glutation ve L‒sistein türlerinin girişim etkisi incelenmiş ve bu türlerin incelenen substratların cevapları üzerinde yaklaşık ±%5 bağıl hataya sebep olduğu görülmüştür.
Liu vd. (2014) tarafından askorbik asit (AA), dopamin (DA), ürik asit (UA), ksantin (XN) ve hipoksantinin (HXN) aynı anda tayini için 3,4,9,10‒perilen tetra karboksilik asit (PTCA) ve aşırı oksitlenmiş dopamine (PDAox) dayalı yeni bir elektrot geliştirilmiştir. Hazırlanan sensörlerin karakterizasyonu SEM, CV, diferansiyel puls voltametri (DPV) ve EIS kullanılarak yapılmıştır. AA, DA, UA, XN ve HXN için çizilen kalibrasyon eğrilerinden yararlanılarak, doğrusal çalışma aralıkları sırasıyla 76 µM‒3,9 mM, 0,6‒253 µM, 1,8‒238 µM, 5,1‒289 µM, 3,8‒293 µM olarak hesaplanmıştır. AA, DA, UA, XN ve HXN tayini için hazırlanan elektrotların gözlenebilme sınırları ise sırasıyla 25,3 µM, 0,20 µM, 0,60 µM, 1,7 µM ve 1,3 µM olarak bulunmuştur. NaCl, NaSO4, KCl, KNO3 ve MgSO4 türlerinin girişim etkisi incelenmiş ve elektrodun cevabı üzerinde herhangi bir bozucu etkisinin olmadığı görülmüştür. Çalışılan beş tür PDAox‒ PTCA/GCE elektrodun bağıl standart sapma (BSS) değerleri hesaplanmış ve %BSS değerlerinin <7,8 olduğu görülmüştür.
Ojani vd. tarafından (2013) camsı karbon elektrot yüzeyine L‒metiyonin’in elektrokimyasal polimerizasyonu yoluyla poli L‒metiyonin modifiye elektrot geliştirilmiştir. UA, XN ve HXN modifiye elektrotların elektrokimyasal davranışları, CV ve DPV ile incelenmiştir. Bütün deneysel çalışmalar pH 7,2 ve oda sıcaklığında yapılmıştır. Hazırlanan elektrot, UA, XN ve HXN türlerinin aynı anda tayini için kullanılmıştır. UA, XN ve HXN için gözlenebilme sınırları sırasıyla 0,0074, 0,004 ve 0,008 µM ve tüm türler için doğrusal çalışma aralığı 0,02‒0,1 µM olarak bulunmuştur.
Girişim etkisi yapabileceği düşünülen dopamin, askorbik asit ve epinefrin türlerinin, UA, XN ve HXN ‘in (UA=50 µM, XN=20 µM, HXN=60 µM) belirlenmesi üzerine etkileri incelenmiş ve incelenen türlerin elektrot cevabı üzerinde önemli bir etkisinin
10
olmadığı görülmüştür. Son olarak hazırlanan poli L‒metiyonin modifiye elektrot ile serum numunesinde yüksek duyarlık ve seçicilikte ürik asit, ksantin ve hipoksantin tayini gerçekleştirildiği rapor edilmiştir.
Devi vd. (2013) tarafından yapılan çalışmada, demir nanopartikül/kitosan (CHIT/Fe‒NPs@Au) kompozit film kalem grafit elektrot (PCE) yüzeyine modifiye edilmiş ve ksantin oksidaz bu yüzeye kovalent olarak bağlanmıştır. Enzim elektrodun karakterizasyonu SEM, fourier dönüşümlü infrared spektrofotometre (FTIR) ve EIS yöntemleri kullanılarak araştırılmıştır. Biyosensörün optimum koşullar altında (pH 7,4, 35º, 0,5 V sabit potansiyel) cevap süresi 3 s olarak bulunmuştur. Biyosensörün 0,1 µM gözlenebilme sınırında (S/N=3), 0,001169 mA µM–1 cm–2 duyarlığa sahip olduğu belirtilmiştir. 100 gün boyunca yapılan 100 ölçüm sonrasında biyosensörün aktivitesinin
%25’ini kaybettiği görülmüştür. Elektrodun amperometrik cevabına inosin 5‒fosfat, inosin, sistein, guanin, teobromin, kafein, teofilin, askorbik asit ve glukoz gibi balık numunesinde bulanabilecek olası türlerin girişim etkisi incelenmiş ve bu türlerin elektrodun cevabına önemli bir girişim etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Ksantin biyosensörü kullanılarak balık numunelerinde standart katma yöntemi ksantin miktarı belirlenmiştir. Bu amaçla, 10 ve 20 mg/L ksantin çözeltisinden 0,1 mL ilave edilmiş ve sırasıyla % 95,0±1,3 ve % 98,5±2,4 geri kazanım sonuçları elde edilmiştir. Ayrıca balıktaki ksantin değerleri enzimatik kolorimetrik yöntem ve mevcut geliştirilen yöntem ile tayin edilmiş, bu iki yöntem sonuçları karşılaştırılmıştır.
Devi vd. tarafından (2013) balık numunesinde ksantin tayini yapmak amacıyla, gümüş nanopartikül/sistein kendi kendine oluşan tek tabaka (SAM) yöntemi ile Au yüzeyine modifiye edilerek amperometrik biyosensörler hazırlanmıştır. Ksantin oksidaz enzimi Au yüzeyine EDC ve NHS yardımıyla kovalent bağlanarak immobilize edilmiştir.
Biyosensör cevabı pH 7,0 ve 35 ºC’de Ag/AgCl’e karşı +0,50 V’de incelenmiş, cevap süresi 5 s olarak bulunmuştur. Doğrusal çalışma aralığı 2‒16 µM, gözlenebilme sınırı 0,15 µM ve duyarlık 0,17 mA/µM/cm2 olarak hesaplanmıştır. Elektrodun amperometrik cevabına glukoz, ürik asit, sodyum benzoat ve askorbik asit türlerinin girişim etkisini incelenmiş, bu türlerin elektrodun cevabına önemli bir girişim etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Ancak, askorbik asidin elektrot cevabı üzerinde hafif bir azalmaya sebep
11
olduğu (%10) rapor edilmiştir. Elektrodun uygulanabilirliğini göstermek amacıyla balık numunelerinde standart katma yöntemi kullanılarak (5 g/L ve 10 g/L) geri kazanım çalışmaları yapılmıştır ve geri kazanım sonuçları sırasıyla % 96,2 ± 2,3, % 95,2 ± 3,4 olarak bulunmuştur. Biyosensör ile balık, tavuk, domuz ve inek etlerinde ksantin tayini yapılmıştır. Enzim elektrot ile 60 gün boyunca 180 ölçüm yapıldığında, başlangıç aktivitesinin % 20’sini kaybettiği rapor edilmiştir.
Devi vd. (2012) çinko oksit nanopartikül/kitosan/karboksilli çok duvarlı karbon nanotüp (ZnO‒NP/CHIT/c‒MWCNT/PANI) kompozit filminin Pt elektrot yüzeyine elektrobiriktirilmesiyle oluşan modifiye elektroda ksantin oksidazın immobilizasyonuyla ksantin duyarlı elektrotlar hazırlanmıştır. ZnO‒NPs’nin karakterizasyonu, X‒ışını kırınım cihazı (XRD), geçirimli elektron mikroskobu (TEM), CV, FTIR, EIS yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. Çalışma elektrodunun optimum koşullar altında (35 ºC, pH 7,0 ve +0,50 V sabit potansiyel) cevap süresi 4 s olarak bulunmuştur. Hazırlanan elektrotların doğrusal çalışma aralıkları 0,1‒100 mM, gözlenebilme sınırı ise 0,1 mM olarak elde edilmiştir. Bir ay boyunca 80 ölçüm sonrasında biyosensörün aktivitesinin %30’unu kaybettiği görülmüştür. Elektrodun amperometrik cevabına balık numunesinde bulanabilecek türlerin girişim etkisini incelemek amacıyla, 0,15 mM ksantinin sabit derişiminde, 40 mM inosin 5‒fosfat, inosin, ürik asit, kafein, teofilin, hipoksantin ve askorbik asit ve 0,5 mM ürik asidin girişim etkisi araştırılmıştır ve bu türlerin elektrodun cevabına önemli bir girişim etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Ancak, elektrot cevabı üzerinde hipoksantinin %3, askorbik asitin ise %20’lik bir azalmaya sebep olduğu rapor edilmiştir. Enzim elektrodun uygulanabilirliğini göstermek amacıyla balık numunesi oda sıcaklığında (30±5ºC) 15 gün boyunca depolanmış ve 10. günden sonra depolanan balıktaki ksantin miktarının iki katına çıktığı rapor edilmiştir.
Devi vd. (2012) tarafından yapılan diğer bir çalışmada Au/polipirol (AuPPy) nanokompozit filmlerin kullanıldığı elektrotlar hazırlanmıştır. Ksantin oksidaz elektrot yüzeyine gluteraldehit (GA) yolu ile immobilize edilmiştir. İmmobilizasyon öncesi ve sonrasında AuPPy/Pt elektrodun karakterizasyonunu incelemek amacıyla, FTIR, CV, XRD, SEM, TEM ve EIS yöntemleri kullanılmıştır. Amperometrik ölçümler 0,05 M pH
12
7,2 fosfat tamponunda 30 ºC, +0,40 V sabit potansiyelde gerçekleştirilmiş, cevap süresi 4 s olarak bulunmuştur. Biyosensör ile optimum koşullar altında 0,4‒200 µM çalışma aralığı ve 0,4 µM gözlenebilme sınırı (S/N=3) elde edilmiştir. 100 gün boyunca 200 ölçüm sonrasında biyosensörün aktivitesinin %40’ını kaybettiği görülmüştür.
Elektrodun amperometrik cevabına balık numunesinde bulanabilecek türlerin girişim etkisini incelemek amacıyla, 0,15 mM ksantinin sabit derişiminde, 40 mM derişimdeki inosin 5‒fosfat, inosin, sistein, ürik asit ve askorbik asit türlerinin girişim etkisi araştırılmıştır. Bu türlerin elektrodun cevabına önemli bir girişim etkisinin olmadığı, ancak askorbik asidin elektrot cevabında %20’lik bir azalmaya sebep olduğu rapor edilmiştir. Hazırlanan elektrodun uygulanabilirliğini göstermek amacıyla balık, tavuk, domuz ve inek etlerinde ksantin tayini yapılmıştır.
Liu vd. (2012) tarafından yapılan çalışmada, ksantin oksidaz (XO), GA ve 3‒aminopropiletoksisilan (KH) ile çapraz bağlanma yoluyla CH yüzeyine immobilize edilmiş ve KH/GTD/XOD/CH modifiye elektrot hazırlanmıştır. Optimum pH 7,0 olarak belirlenmiştir ve hazırlanan elektrot ile +0,67 V potansiyelde ksantin yükseltgenmesi sonucu oluşan keskin bir pik görülmüştür. Yükseltgenme pik akımının, 0,5‒18 µmol/L derişim aralığında doğrusal bir cevaba sahip olduğu, gözlenebilme sınırının 0,0215 µmol/L (N=9, R=0,9995) ve duyarlığının 6.9 A/Mcm2 olduğu rapor edilmiştir. 10 µmol/L sabit ksantin derişiminde 10 ölçümün bağıl standart sapması % 3,2 olarak bulunmuştur. Elektrodun raf ömrü 4 hafta olarak belirlenmiştir. Hazırlanan elektrotla yapılan çalışmada ürik asit, adenin ve tirosinin bozucu etkisi incelenmiş ve bu türlerin ksantinin yüksek derişimlerde bulunduğu ortamlarda elektrodun cevabına önemli etkisinin olmadığı görülmüştür.
Baş vd. (2011) ksantin oksidazın, polivinilferrosenyum perklorat matriks (PVF+ ClO4‒
) ve platine elektrobiriktirilmiş PVF+ClO4‒
matrikse immobilize edilmesiyle ksantin biyosensörler geliştirmişlerdir. Polivinilferrosenyumun Ag/AgCl’e karşı +0,70 V’da elektrokimyasal yükseltgenmesi sonucu PVF+ClO4‒
film kaplı platin elektrotlar hazırlanmıştır. PVF+ ClO4‒ elektrot yüzeyine, ‒0,20 V’de 2,0 mM H2PtCl6 çözeltisinde elektrokimyasal biriktirme yoluyla platin nanopartikülleri modifiye edilmiştir.
Biyosensörlerin amperometrik cevapları H2O2’nin +0,50 V’de yükseltgenmesi yoluyla
13
elde edilmiştir. Optimum koşullar altında, ksantin tayininde doğrusal çalışma aralığı ve gözlenebilme sınırı PVF+XO‒ elektrot için 1,73×10‒3‒1,74 mM ve 5,20×10−4 mM, PVF+XO‒/Pt elektrot için ise 0,43×10‒3‒2,84 mM ve 1,30×10−4 olarak hesaplanmıştır.
PVF+XO‒ ve PVF+XO‒/Pt elektrotların duyarlıkları ise sırasıyla 56,22 ve 68,75 µAmM‒1cm‒2 olarak bulunmuştur. PVF+XO‒ elektrot 21 gün sonunda başlangıç duyarlığının %40’ını, PVF+XO‒/Pt elektrot ise 25 gün sonunda başlangıç duyarlığının
%42’ini kaybettiği rapor edilmiştir. Hazırlanan her iki elektrotla 0,5 mM ksantinin sabit derişiminde, 0,1 mM askorbik asit ve 0,5 mM ürik asitin girişim etkisi araştırılmıştır ve bu türlerin elektrodun cevabına önemli bir girişim etkisinin olmadığı gözlenmiştir.
PVF+XO‒ ve PVF+XO‒/Pt elektrotların gerçek numune analizlerinde kullanıp kullanılamayacağını göstermek amacıyla standart katma yöntemi kullanılarak, ilaç numunelerindeki ksantin miktarları hesaplanmıştır.
Devi vd. (2011) tarafından yapılan çalışmada c‒MWCNT/polianilin (PANI) kompozit film elektrotlar hazırlanmıştır. Bu amaçla XO, EDC ve NHS kullanılarak elektrot yüzeyine kovalent olarak bağlanmıştır. Enzim elektrodun karakterizasyonu, SEM, FTIR ve EIS kullanılarak incelenmiştir. Tüm ölçümler pH 7,0 fosfat tamponunda, 35 ºC sıcaklıkta Ag/AgCl’ye karşı +0,40 V’de gerçekleştirilmiştir ve elektrodun cevap süresi 4 s olarak bulunmuştur. Hazırlanan elektrotun doğrusal çalışma aralığı 0,6‒58 µM, gözlenebilme sınırı ise 0,6 µM olarak hesaplanmıştır. 100 gün boyunca 200 ölçüm sonrasında biyosensörün aktivitesinin %50’sini kaybettiği görülmüştür.
XO/c‒MWCNT/PANI/Pt elektrodun bağıl standart sapma (BSS) değeri <%5,0 olarak hesaplanmıştır. Elektrodun amperometrik cevabına girişim etkisini incelemek amacıyla, çeşitli türler (1 mM) test edilmiştir ve bu türler arasında sadece askorbatın sensör cevabı üzerinde %10’luk bir azalmaya sebep olduğu rapor edilmiştir. Elektrodun gerçek numunelerde uygulanabilirliğini göstermek amacıyla balık numunelerinde standart katma yöntemi kullanılarak ksantin tayini yapılmıştır. Bu amaçla, 5 ve 10 mg/L ksantin çözeltisinden 0,1 mL ilave edilmiş ve sırasıyla 93,6 ±2,34 ve % 87,18±3,17 geri kazanım sonuçları elde edilmiştir.
Devi vd. (2011) yaptığı diğer bir çalışmada, çinko oksit nanopartikül (ZnO‒NPs) ve pirolün platin elektrot (Pt) yüzeyine elektrot polimerizasyonu ile ZnO‒NPs‒polipiropil
