Enzimler

39

görülebildiği belirtilmiştir. Ancak uzun süreli MSG kullanımının, nörodejeneratif hastalıkların, obezite ve diyabet gibi metabolik hastalıkların ortaya çıkmasında tetikleyici olduğu raporlanmıştır (Bunyan vd. 1976, Komeda vd. 1980, Rogers ve Blundell 1990, Bojanic vd. 2009, Pepino vd. 2010). Ayrıca glutamat merkezi sinir sistemindeki ana uyarıcı nörotransmitterlerden biridir ve nörolojik bozukluklardan büyük ölçüde sorumludur. Beyin dokusu dışında kalan alandaki glutamat seviyesinin belirlenmesi, nörolojik rahatsızlıkların tanısı için oldukça önemlidir (Chakraborty vd.

2007, Tang vd. 2007, Maalouf vd. 2007, Gholizadeh vd. 2012, Batra ve Pundir vd.

2013).

40

‘holoenzim’ olarak adlandırılır. Bu enzimin protein kısmına ‘apoenzim’ denir (Gözükara vd. 2001, Lehninger vd. 2013).

Uluslararası enzim komisyonu enzimlerin sistematik fonksiyonel sınıflandırılmasına ve adlandırılmasına ilişkin bir şema geliştirmişlerdir. Bu sistem ile enzimler katalizledikleri tepkime tipi esas alınarak 6 temel gruba ayrılmıştır:

Oksidoredüktazlar, elektron aktarımı (hidrür iyonları veya H atomları) ve moleküler oksijen katılım reaksiyonlarını katalizler. Kısaca redoks reaksiyonlarını katalizleyen enzimler bu gruptadırlar. Katalizledikleri reaksiyonun türüne göre dehidrogenaz veya redüktaz olarak da sınıflandırılabilirler. Dehidrogenazlar en yaygın oksidoredüktazlardır. Bir substrat ve bir koenzim (NAD, NADP, FAD) arasında hidrojen aktarımı gerçekleşir.

Transferazlar, bir fonksiyonel grubun bir molekülden diğerine aktarımını katalizleyen enzimlerdir. Kinazlar, fosforilazlar ve transaminazlar bu enzim grubundadır. Kinazlar ATP ya da diğer nükleosid trifosfatlardan ikinci bir substrata fosfat grubu transfer eder. Fosfat grubunun transfer edildiği substrata göre adlandırılır. Fosforilazlar inorganik fosfor ekleyerek bağları kırar. Transaminazlar amino gruplarını transfer eder.

Hidrolazlar, hidroliz tepkimelerini katalizleyerek, bir karbon atomu ile başka bir atom arasındaki bağların hidrolitik yıkımını sağlarlar. Sindirim enzimleri ve lizozomal enzimleri bu grupta yer alır. Bu enzimler substratlarına göre gruplandırılırlar (peptidazlar, esterazlar, lipazlar, fosfolipazlar, glukozidazlar, fosfatazlar gibi).

Liyazlar, substrattaki bir grubun, hidrolitik olmayan bir çift bağ oluşturarak ayrılmasını katalizler. Bu enzimler sıklıkla sentaz olarak adlandırılır. Karbon‒karbon, karbon‒sülfür ve karbon‒azot bağı kırılmasını katalizler.

İzomerazlar, molekül içi grupların aktarımı ve izomerik yapıların oluşumunu katalizleyen enzimlerdir. Katalizledikleri değişik izomerizasyon tipine göre rasemaz, epimeraz, izomeraz ve nutaz gibi isimler alabilirler.

41

Ligazlar, ATP veya benzeri bileşiklerin katkılarıyla gerçekleşen kondesyon tepkimelerinin yardımıyla C ̶ C, C ̶ S, C ̶ O ve C ̶ N bağlarının oluşumunu katalizleyen enzimlerdir. Sentetazlar olarak bilinirler (Telefoncu 1999).

Bir enzimin aktivitesi, belirli bir zamanda ve belirli başlangıç koşullarında, enzimin bilinen miktarının etkisiyle değişime uğrayan substrat miktarının ölçülebilmesi ile ifade edilen değerdir. Bir enzimin aktivitesini etkileyen başlıca faktörler aşağıda verilmiştir:

Sıcaklığın etkisi: Moleküller arası, çarpışmanın artışına bağlı olarak genellikle kimyasal ve biyokimyasal tepkimelerin hızı artmaktadır. Ancak sıcaklık artışı devam ettikçe tepkimenin hızı belli bir noktaya kadar artmakta ve sıcaklık artışının devamı ile birlikte hızda tekrar bir azalma görülmektedir. Enzimler protein yapısında oldukları için belli bir sıcaklık üzerinde yapıyı oluşturan bağlar parçalanmakta, enzim molekülleri denatüre olarak aktivitelerini kaybetmekte ve enzim‒substrat kompleks oluşumu bozulduğu için tepkimenin hızı azalmaktadır. Reaksiyonun en yüksek hıza ulaşıldığındaki sıcaklığa optimum sıcaklık adı verilmektedir.

pH’nın etkisi: Enzimlerin aktiviteleri, ortamın asidik veya bazik olmasına bağlı olarak değişmektedir. Enzimatik tepkimenin hızının optimum olduğu ve her enzim için farklılık gösteren bir optimum pH değeri bulunmaktadır. Optimum pH’ın öncesi ve sonrasında reaksiyon hızı yavaşlamakta, çok aşırı asidik veya bazik bölgelerde ise enzim aktivitesini kaybetmektedir (Gözükara 2001)

Substrat derişiminin etkisi: Sabit enzim derişiminde, enzim reaksiyonunun hızı belirli bir noktaya kadar substrat derişimi ile artar. Çünkü enzim molekülleri henüz substrat ile doymamıştır. Başlangıçta artan substrat, enzim‒substrat kompleksini oluşturur, enzimde substrat bağlayacak tüm boş yerler dolduğundan, bu noktadan sonra substrat derişiminin artması ile reaksiyon hızı değişmez.

Enzimler suda çözünen spesifik katalizörlerdir. Enzimlerin çözünmeyen destek görevi gören materyaller (matriksler) yardımıyla suda çözünmeyen hale getirilmelerine

42

immobilizasyon denir. İmmobilizasyon işlemi enzim kaçışı, enzimin kararlılığını uzun süre koruyamaması, enzimatik cevap süresinin uzun olması gibi pek çok problemin çözülmesini sağlar. İmmobilizasyon işlemlerinin üstünlükleri aşağıda kısaca verilmiştir (Telefoncu 1999):

 Enzimler üretimi zor ve genellikle pahalı malzemelerdir. İmmobilizasyon yoluyla enzimler tekrar tekrar ve uzun süre kullanılabilir

 Enzim matrikste tutunduğundan, ürünlerin enzim tarafından kirletilmesi gibi bir problem yaratmaz.

 Matriks enzimi fiziksel bir bariyer gibi koruduğundan, enzim optimum olmayan pH ve sıcaklık gibi çevre koşullarına karşı daha dayanıklı hale gelir.

 Genellikle serbest enzime göre daha iyi bir aktivite gösterir.

 Birbirini izleyen çok basamaklı reaksiyonlar için uygundur ve ürün oluşumu kontrol edilebilir.

 Enzimin kendi kendini parçalaması olasılığı azalır.

Enzimlerin elektrot yüzeyine immobilizasyonu fiziksel (adsorpsiyon, membran veya polimerde tutturma vd.) veya kimyasal (kovalent bağlama, çapraz bağlama vd.) yöntemlerle gerçekleştirilebilir. Dönüştürücü ve elektrot yüzeyinin yapısına, biyoreseptörlerin kimyasal yapısına ve fiziksel durumuna bağlı olarak pek çok yöntem vardır:

Adsorpsiyon, en eski ve en basit immobilizasyon yöntemidir. Enzim moleküllerinin taşıyıcıların yüzeyine adsorblanmaları üzerine dayanır. Enzimin konformasyonunda veya aktif merkezinde çok az veya hiçbir değişikliğe neden olmaz. Yüzey aktif, suda çözünmeyen bir adsorbanın (selüloz, silikajel, cam, ve kollajen vb.) kullanıldığı yöntemlerdir. Hidrojen bağları, çoklu tuz köprüleri ve Van der walls bağları sayesinde bağlanma gerçekleşir. Ancak bu immobilizasyon yönteminde, sıcaklık, pH ve iyonik şiddet gibi faktörlerin değişimine bağlı olarak, enzimin taşıyıcıdan kopabilir. Kararlılığı az olduğundan ve enzimin çözeltiye geçişi söz konusu olabileceğinden çok tercih edilmeyen bir yöntemdir.

43

İyonik bağlamada, iyon değiştirme yeteneğine sahip suda çözünmeyen taşıyıcılara enzimin iyonik bağlanması söz konusudur. Enzimin konformasyonunda veya aktif merkezinde çok az veya hiçbir değişikliğe neden olmaz. pH ve iyonik şiddet değişimleri olan çözeltilerde enzimin taşıyıcıdan kopması ihtimali ise bu yöntemin dezavantajıdır.

Hapsetme, enzim molekülünün bir membran veya tabaka (matriks) içerisinde hapsedilmesidir. Bu yöntemde enzim fiziksel veya kimyasal olarak bir taşıyıcıya bağlı değildir. Hapsetme, kafes tipi hapsetme ve mikrokapsülleme olmak üzere ikiye ayrılır.

Çapraz bağlama, hapsetme ve kimyasal bağlamanın birleştirilmiş şekli olarak uygulanır. Bu yöntem, bi‒ veya multi‒ fonksiyonel gruplar kullanılarak, enzim molekülleri arasında kovalent bağlanma esasına dayanır. Çapraz bağlama yönteminde genellikle glutraldehit çözeltisi kullanılır. Hekzametilendiizosiyanat, diflorodinitrobenzen ve disüksinilsuberat da yaygın olarak kullanılan diğer çözeltilerdir.

Bu reaktifler enzim molekülleri arasında bağ oluştururlar. En sık kullanılan immobilizasyon yöntemlerinden biridir.

Kovalent bağlama, enzim molekülleri üzerindeki katalitik aktivite için gerekli olmayan fonksiyonel grupların bağlanması yoluyla gerçekleşir. Kovalent bağlama genellikle proteinlerin aminoasit yan zincirlerinde bulunan amino, karboksil, imidazol, tiyol, hidroksil gibi nükleofilik fonksiyonel gruplarla bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Bu immobilizasyon yöntemi sıcaklık, pH ve iyonik şiddet gibi değişikliklere karşı dirençlidir.

Çeşitli immobilizasyon yöntemlerinin karşılaştırılması çizelge 2.1’de verilmiştir.

Çizelge 2.1 İmmobilizasyon yöntemlerinin karşılaştırılması

ÖZELLİK Kovalent Bağlama

Fiziksel Adsorpsiyon

İyonik

Bağlama Çapraz

Bağlama Hapsetme

Hazırlanması Zor Kolay Kolay Zor Zor

Enzim Aktivitesi Yüksek Düşük Yüksek Orta Yüksek Bağ gücü Kuvvetli Zayıf Orta Kuvvetli Kuvvetli

44