Galaktoz

Galaktoz tayinine yönelik geliştirilen sensör ve biyosensörler ile ilgili literatürler incelendi ve bu konuda yapılan çalışmaların bir kısmı tarih sırasına göre aşağıda kısaca özetlendi.

Sá vd. (2014) tarafından yapılan çalışmada, nikel‒oksi‒hidroksit (NiOOH) ve MWCNT ile modifiye edilen camsı karbon elektrot (GCE/MWCNT/NiOOH) ile glukoz, galaktoz, ksiloz, arabinoz ve mannozun bazik ortamda elektrokatalitik olarak indirgenmesi çalışılmıştır. Tayini yapılan şekerler için yük transfer katsayısı (0,37) elektrokatalitik hız sabiti (2,1×10⁴ L mol^‒1 s^‒1) ve difüzyon katsayısı (1,3×10^‒6 cm² s^‒1) gibi kinetik parametreler incelenmiştir. Çalışmada hazırlanan elektrodun bazı şekerler için derişim aralıkları, gözlenebilme sınırı, alt tayin sınırı ve duyarlıkları hesaplanmıştır.

Çizelge 1.1 Çeşitli şekerlerin MWCNT/NiOOH elektrot ile belirlenen analitik parametreleri

Şekerler Gözlenebilme Sınırı (mol L^‒1)

Alt Tayin Sınırı (mol L^‒1)

Duyarlık (µA Lmol^‒1)

Derişim Aralığı (mol L^‒1)

Galaktoz 2,1×10^‒4 7,0×10^‒4 2,1×10^‒4 2,5×10^‒4‒5,6×10^‒3

Glukoz 1,9×10^‒4 6,4×10^‒4 2,1×10^‒4 2,5×10^‒4‒5,6×10^‒3

Ksiloz 3,2×10^‒4 1,0×10^‒3 2,1×10^‒4 5,0×10^‒4‒5,6×10^‒3

Arabinoz 2,6×10^‒4 8,8×10^‒4 2,1×10^‒4 5,0×10^‒4‒5,6×10^‒3

Mannoz 4,3×10^‒4 1,4×10^‒3 2,1×10^‒4 5,0×10^‒4‒5,6×10^‒3

Kanyong vd. (2013) tarafından serum numunelerinde kullanılmak üzere tek kullanımlık galaktoz biyosensörleri geliştirilmiştir. Bu biyosensörler, kobalt ftalosiyanin (CoPC)

18

içeren selüloz membran (CA) filmin perde baskılı elektrot (SPCE) yüzeyine modifiye edilmesi ve bu yüzeye galaktoz oksidazın (GaOx) immobilize edilmesiyle hazırlanmıştır. Biyosensörün optimum performansı, pH 7,0 (0,05 M fosfat tamponu), 35 ºC, ve 2 ünite enzim içeren elektrot ile elde edilmiştir. Çalışma Ag/AgCl elektroda karşı +0,50 V sabit potansiyelde yapılmıştır ve elektrodun cevap süresi 30 s olarak bulunmuştur. Elektrodun doğrusal çalışma aralığı 0,1‒25 mM, gözlenebilme sınırı 0,02 mM ve duyarlığı 7,00 µA mM^‒1 cm^‒2 olarak rapor edilmiştir. Elektrot ile 14 gün boyunca ölçüm yapılmış, elektrodun aktivitesinde herhangi bir değişiklik olmadığı görülmüştür. Elektrodun uygulanabilirliğini göstermek için serum numunesinde standart katma yöntemi kullanılmış ve %99,9 geri kazanım değeri elde edilmiştir. Serum numunesinde girişim etkisi yapabileceği düşünülen üre, ürik asit, parasetamol ve askorbik asit türlerinin elektrodun cevabı üzerindeki etkisi incelenmiş ve önemli bir bozucu etkilerinin olmadığı görülmüştür.

Charmantray vd. (2012) tarafından yapılan çalışmada, Pt elektrot yüzeyine laponit kil film kaplı galaktoz biyosensörler hazırlanmıştır. Elektrokimyasal ölçümler optimum olarak seçilen pH 7,0 ve 25 ºC’de, GaOx/laponit enzim elektrodun yüzeyindeki enzimatik reaksiyon sonucu oluşan H2O2’nin +0,60 V’da yükseltgenmesine dayanarak yapılmıştır. Biyosensörlerin elektrokimyasal cevapları, tampon cinsi, pH ve GaOx/laponit oranları açısından optimize edilmiştir. Elektrodun optimum GaOx/laponit oranında (50:25; µg:µg) 1,0×10^‒6‒1,6×10^‒3 M doğrusal çalışma aralığında, yüksek duyarlık ve maksimum akım (sırasıyla 85 mA M^‒1 cm^‒2 ve 232 A cm^‒2) gösterdiği rapor edilmiştir. Elektrodun kararlı hal akımının %95’ine ~5 s’de ulaşıldığı ve gözlenebilme sınırının 1 µM olduğu bulunmuştur. Elektrot cevabının 4 hafta boyunca yapılan ölçümler sonrasında sabit kaldığı görülmüştür.

Khun vd. (2012) fonksiyonlaşmış ZnO nano çubuklara dayalı galaktoz biyosensörü hazırlamıştır. Galaktoz oksidaz, bir çapraz bağlayıcı molekül olarak gluteraldehitin kullanılmasıyla ZnO nano çubukları üzerine immobilize edilmiştir. Galaktoz biyosensör ölçümleri potansiyometrik yöntem kullanılarak yapılmıştır. Biyosensör 10‒200 mM derişim aralığında, 89,10±1,23 mV/decade seçicilikle cevap vermiştir. Gözlenebilme sınırı 1 mM olarak hesaplanmıştır. Hazırlanan biyosensör askorbik asit, ürik asit, glukoz

19

ve magnezyum gibi bozucu etki yapabilecek türler varlığında iyi bir seçicilik göstermiştir. Elektrodun cevap süresi <10 olarak bulunmuştur. ZnO nano çubukları üzerine galaktoz oksidaz immobilize edilmiş biyosensörün 4 haftadan daha fazla raf ömrüne sahip olduğu rapor edilmiştir.

Lee vd. (2011) tarafından iletken polimer mikrotübülüs demeti ile yüksek seçicilikte galaktoz biyosensör hazırlanmıştır. Amperometrik biyosensörün galaktoza 0,1‒1 mM derişim aralığında, 6,37 µA/mMcm² duyarlıkla cevap verdiği görülmüştür.

Gözlenebilme sınırı 0,01 mM (S/N=3) olarak hesaplanmıştır. Cevap süresi 30‒40 s olarak bulunmuştur. Hazırlanan elektrodun 1 hafta sonunda başlangıç duyarlığının

%82’sini koruduğu görülmüştür. Amperometrik ölçümler Ag/AgCl elektroda karşı +0,60 V sabit potansiyelde ve optimum pH 7,4’de ölçülmüştür. Hazırlanan biyosensör, galaktoz yanında çeşitli bozucu etki yapan türlerinin bulunduğu bir çözelti içerisinde test edilmiştir. Girişim etkisini incelemek amacıyla, insan serumunda bulunan askorbik asit ve ürik asit seçilmiştir. İncelen türlerin elektrodun cevabı üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığı görülmüştür.

Şenel vd. (2011) tarafından yapılan çalışmada, galaktoz oksidaz‒poli (N‒glisidilpirol‒ko‒pirol) filme dayalı amperometrik galaktoz biyosensör geliştirilmiştir. GaOx enzimi, elektrokimyasal olarak hazırlanan yeni iletken film yüzeyine doğrudan tek basamakta kovalent olarak bağlanmıştır. Yüzey karakterizasyon verileri, FTIR spektroskopisi ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile incelenmiştir.

Amperometrik cevap Ag/AgCl elektroda karşı +0,70 V sabit potansiyelde ve pH 7,5 fosfat tamponunda ölçülmüştür. Tüm ölçümler 35 ºC’de yapılmıştır. Biyosensörün cevap süresi <5 olarak belirlenmiştir. Elektrodun doğrusal çalışma aralığı 2‒16 mM, duyarlığı 1,75 µA/mM ve gözlenebilme sınırı 25 µM olarak bulunmuştur. Çalışmada Km

değeri 14,7 mM olarak hesaplanmıştır. Hazırlanan elektrodun 10 gün boyunca başlangıç duyarlığının %55’ini kaybettiği görülmüştür. Elektrodun uygulanabilirliği göstermek amacıyla galaktoz içeren numunelerde standart katma yöntemi kullanılarak galaktoz tayini yapılmış ve % 96,9‒98,8 aralığında geri kazanım sonuçları elde edilmiştir.

20

Çevik ve Abasıyanık (2010) tarafından galaktoz oksidaz‒poli (glisidilmetakrilat‒ko‒vinilferrosen) (poli (GMA‒ko‒VFc) filme dayalı amperometrik galaktoz biyosensörü geliştirilmiştir. Enzim, filme polimerik medyatördeki amino grupları vasıtasıyla immobilize edilmiştir. Optimize galaktoz biyosensörün doğrusal cevap aralığı 2‒20 mM, gözlenebilme sınırı 0,1 mM ve duyarlığı 23 nAcm^‒2mM^‒1 olarak bulunmuştur. Cevap süresinin 5 s olduğu görülmüştür.

GaOx/poli(GMA‒ko‒VFc)/Pt elektrot için Km değeri 16 mM olarak hesaplanmıştır.

Hazırlanan elektrodun cevabı pH 6,5 ve 35 ºC’de Ag/AgCl elektroda karşı +0,35 V’de ölçülmüştür. Elektrot ile 30 gün boyunca ölçüm yapılmış, başlangıç aktivitesinin

%60’ını kaybettiği görülmüştür. Elektrodun amperometrik cevabına bazı türlerin girişim etkisini incelemek amacıyla, 0,10 mM galaktozun sabit derişiminde, AA (0,1 mM), UA (0,5 mM), ve CaCl2 (0,1 mM) türlerinin girişim etkisi araştırılmıştır ve bu derişimlerde türlerin elektrodun cevabına önemli bir girişim etkisinin olmadığı gözlenmiştir.

Tkac vd. (2007) tarafından, tek duvarlı karbon nanotüplerin (SWCNT) kitosan biyopolimeri içerisinde dağıtılıp camsı karbon elektrot yüzeylerine modifiye edilmesiyle oksijen ölçümüne dayanan galaktoz biyosensörler hazırlanmıştır.

Yüzeyinde kitosan film oluşan camsı karbon elektrodun mekanik olarak kararlı olduğu rapor edilmiştir. Galaktoz oksidaz gluteraldehit ile çapraz bağlama yoluyla, SWCNT içeren kitosan film (CH‒SWCNT) kaplı GCE yüzeyine immobilize edilmiştir.

Hazırlanan elektrotların cevabı optimum pH 7,4’de, Ag/AgCl elektroda karşı ‒0,40 V’de ölçülmüştür. Biyosensörün doğrusal çalışma aralığı 1‒20 mM, gözlenebilme sınırı 25 µM (S/N=3) ve duyarlığı 1126 nAmM⁻¹ olarak bulunmuştur. Optimum koşullar altında askorbat, askorbik asit, üre, ürik asit ve asetoaminofen türlerinin girişim etkisi incelenmiştir ve bu türlerin elektrodun cevabı üzerinde önemli bir etkiye sebep olmadığı görülmüştür. Ancak AA’in ‒0,2 V’de girişim etkisi gözlenirken, ‒0,40 V’de AA/galaktoz girişim oranı 104 kat azalmıştır. Elektrodun gerçek numunelerde uygulanabilirliğini göstermek amacıyla, kan numunesinde standart katma yöntemi ile galaktoz miktarı belirlenmiştir ve geri kazanım sonuçları % 101,2‒102,7 olarak elde edilmiştir.

21

Sharma vd. (2006) tarafından yapılan çalışmada, süt ve süt ürünlerinde galaktoz tayini için polivinil formal (PVF) membran kullanılarak oksijen ölçümüne dayalı biyosensörler hazırlanmıştır. İmmobilize enzim membran karakterizasyonu atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak yapılmıştır. Biyosensörün çalışma aralığı 0,5‒3,0 g dL^‒1, gözlenebilme sınırı 0,5 g dL^‒1 olarak bulunmuştur. Optimum koşulları belirlemek amacıyla, pH, sıcaklık ve immobilize galaktoz oksidaz membranın kararlılığı araştırılmıştır. Bütün çalışmalar optimum pH 6,5 ve 35ºC’de gerçekleştirilmiştir.

Elektrodun raf ömrü > 90 gün olarak belirlenmiştir. Farklı derişimlerde kalsiyum, ürik asit ve askorbik asit gibi süt numunesinde bulanabilecek olası türlerin girişim etkisini incelenmiş ve bu türlerin elektrodun cevabına önemli bir girişim etkisini olmadığı gözlenmiştir.

Sung vd. (2006) polianyon/PEG/enzim konjuge bağı ile polipirol kullanılarak glukoz, laktaz, galaktoz biyosensörleri hazırlamıştır. Glukoz oksidaz (GOD), laktaz oksidaz (LOD) ve galaktoz oksidaz (GaOx) poli (etilen glisol) aracısına, polianyon yolu ile başarılı bir şeklide bağlanmıştır ve enzim aktivitelerinin %75’inin korunduğu rapor edilmiştir. Amperometrik ölçümler, Ag/AgCl elektroda karşı +0,40 V, 0,1 M pH 7,4 fosfat tamponunda ve 37 ºC’de gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan elektrotların cevap süresi

<40 s olarak bulunmuştur. GOD, LOD ve GAO için Lineweaver‒Burk grafiği kullanılarak hesaplanan Michaelis Menten sabitleri (Km) sırasıyla 46,7 mM, 16,7 ve 43 olarak verilmiştir.

Çizelge 1.2 GOD, LOD ve GaOx elektrotların belirlenen analitik parametreleri

Tür Gözlenebilme

Sınırı, mM Duyarlık, nA mM^‒1 cm^‒2

Derişim Aralığı, mM

Glukoz 25 217 0‒26

Laktaz 12 151 0‒12

Galaktoz 24 106 0‒24

Kan vd. (2005) tarafından mikro gözenekli poliakrilonitril (PAN) ince filme dayalı galaktoz biyosensör geliştirilmiştir. Galaktoz biyosensör, CV, FTIR ve UV‒VIS teknikleri ile karakterize edilmiştir. Hazırlanan elektrotların amperometrik cevabına

22

Ag/AgCl elektroda karşı +0,50 V’de bakılmıştır. Tüm deneysel çalışmalar pH 7,1 ve 40 ºC’de gerçekleştirilmiştir. Biyosensörün akım cevabı, 0,02‒1,60 mmol dm^‒3 galaktoz derişimi aralığında doğrusal olarak artmıştır ve bu nedenle insan serumunda kullanılabileceği rapor edilmiştir. Çalışmada Km değeri 12,15 mmol dm^‒3 olarak hesaplanmıştır. 20 gün boyunca yapılan ölçümler sonunda elektrodun aktivitesinin % 28’ini, 30 gün sonunda ise % 50’sini kaybettiği bulunmuştur.

Wen vd. (2005) tarafından eggshell (yumurta kabuğu) membran yüzeye galaktoz oksidaz enzimin immobilize edilmesiyle oksijen ölçümüne dayanan galaktoz biyosensörler hazırlanmıştır. Hazırlanan elektrotlarda, oksijenin derişimindeki azalma izlenmiştir. Galaktoz derişimi, azalan oksijen derişimi ile orantılıdır. Çalışmada biyosensörün doğrusal çalışma aralığı 0,1‒8,5 mM ve bağıl standart sapması % 3,74 olarak verilmiştir. Optimum koşullar altında (pH 7,0 ve oda sıcaklığı) elektrodun cevap süresi 100 s olarak bulunmuştur. Elektrot ile 3 ay boyunca ölçüm yapılmış ve bu süre sonunda başlangıç aktivitesinin % 83,6’sını kaybettiği görülmüştür. Girişim etkisi yapabileceği düşünülen L‒askorbik asit, laktat, etanol, sükroz, glukoz, maltoz ve fruktoz türlerinin belirlenmesi üzerine elektrodun cevabı üzerine etkileri incelenmiş ve incelenen türlerin önemli bir girişim etkisinin olmadığı görülmüştür. Ancak laktozun girişim etkisi yaptığı belirlenmiştir. Elektrodun kullanılabilirliğini göstermek amacıyla, standart katma yöntemi kullanılarak serum numunelerinde galaktoz tayini yapılmış ve

%94‒110 aralığında geri kazanım sonuçları elde edilmiştir.

Ekinci vd. (2004) tarafından yapılan çalışmada, poli (4‒metoksifenol) filme dayalı galaktoz duyarlı biyosensörler hazırlanmıştır. Amperometrik biyosensör ölçümleri oda sıcaklığında Ag/AgCl elektroda karşı +0,60 V sabit potansiyelde gerçekleştirilmiştir ve cevap süresi <4 s olarak bulunmuştur. Deneysel çalışmalar için optimum pH 11 olarak seçilmiştir. Elektrodun geniş bir çalışma aralığına (yaklaşık 16 mM kadar) sahip olduğu görülmüştür. Elektrot ile 30 gün boyunca ölçüm yapılmış ve bu süre sonunda başlangıç aktivitesinin %48’ini kaybettiği görülmüştür. Biyosensörün amperometrik cevabı üzerine bazı türlerin girişim etkisini inceleyebilmek amacıyla, elektroaktif (askorbik asit, oksalik asit, 4‒asetamidofenol) ve elektroaktif olmayan (üre, laktoz ve sükroz)

23

türlerin etkisi incelenmiştir. İncelenen elektroaktif türlerin elektrodun cevabı üzerinde etkisi olduğu görülmüştür.

Sharma vd. (2004) tarafından serumda galaktoz tayini için, poli (3‒heksil tiyofen) Langmuir‒Blodgett filme dayanan biyosensör hazırlanmıştır. Poli (3‒heksil tiyofenin) tek tabakası, indiyum oksitle birlikte camsı yüzey üzerine kaplanmıştır. Galaktoz oksidaz, poli (3‒heksil tiyofen)/stearik asit ile karıştırıldıktan sonra elektrot yüzeyine immobilize edilmiştir. Hazırlanan amperometrik biyosensörün serum numunelerindeki doğrusal çalışma aralığı 0,05‒0,5 gL^‒1 olarak bulunmuştur. Hazırlanan enzim elektrot için, en uygun çalışma potansiyeli olarak belirlenen Ag/AgCl elektroda karşı +0,40 V, 25 ºC’de ve 0,1 M pH 7,4 fosfat tamponunda galaktoz cevabına bakılmıştır. Ardı ardına 10 ölçüm sonrasında elektrodun amperometrik cevabında %10‒15’lik bir azalma olduğu rapor edilmiştir. Ayrıca 30 gün sonunda elektrodun başlangıç aktivitesinin %35’ini kaybettiği görülmüştür. Optimum koşullar altında AA (0,2 mM), CaCl2 (0,1 mM) ve UA (0,1 mM) türlerinin girişim etkisi incelenmiş ve bu türlerin elektrot cevabı üzerinde önemli bir etkisinin olmadığı görülmüştür.

Sharma vd. tarafından (2004) süt ve bazı süt ürünlerinde galaktoz tayini yapabilmek için, Langmuir‒Blodgett filme dayanan biyosensör hazırlanmıştır. Poli (3‒heksil tiyofen)/stearik asit ile galaktoz oksidaz karıştırılıp, ITO kaplı camsı yüzeye immobilize edilmiştir. P3HT/SA LB film yüzeyine immobilize olan enzim, FTIR ve SEM yöntemleri kullanılarak karakterize edilmiştir. Biyosensörün galaktoza 1–4 gdl^‒1 doğrusal çalışma aralığında, 1 gdL^‒1 gözlenebilme sınırı ile cevap verdiği görülmüştür.

Elektrodun raf ömrünün >90 gün olduğu bulunmuştur. Tüm ölçümler pH 7,0 ve Ag/AgCl elektroda karşı +0,40 V’da gerçekleştirilmiştir. Optimum sıcaklık 45ºC olarak seçilmiş ve elektrodun cevap süresi 60 s olarak belirlenmiştir. Askorbik asit, CaCl2 ve ürik asit türlerinin, elektrot cevabına girişim etkisi yapıp yapmadığı araştırılmış bu türlerin elektrot cevabı üzerinde önemli bir etkisinin olmadığı görülmüştür.

Wang vd. (2003) kitosan (CH)/Prusya mavisi (PB) filme dayalı glukoz, glutamat ve galaktoz duyarlı sensör geliştirmişlerdir. Hazırlanan biyosensör, kitosan filmin seçicilik

24

kabiliyeti ve PB yüzeyinin H2O2’i elektrokatalizi nedeniyle özellikle ürik asit ve askorbik asit varlığında iyi bir seçicilik göstermiştir. Çalışmadaki amperometrik ölçümler, pH 6,8, 25ºC ve Ag/AgCl elektroda karşı 0,05 V’de gerçekleştirilmiştir.

Optimum koşullar altında elektrotların cevap süreleri 42‒60 s olarak belirlenmiştir.

Hazırlanan elektrotların uygulanabilirliğini göstermek amacıyla insan serum numuneleri ve fermente çözeltilerde glukoz, galaktoz ve glutamat tayini yapılmıştır.

Çizelge 1.3 Glukoz, galaktoz ve glutamatın CH/PB elektrot ile belirlenen analitik parametreler

Tür Gözlenebilme

Sınırı, mM Duyarlık, nA mM^‒1

Derişim Aralığı,

mM BSS, % Raf Ömrü,

Gün

Glukoz 0,03 98 0,1‒10,0 1,3 70

Glutamat 0,06 65 0,1‒10,0 3,2 40

Galaktoz 0,06 49 0,1‒6,0 3,4 30

Jia vd. (2003) tarafından mikrofabrike ince filme dayanan galaktoz biyosensör geliştirilmiştir. Geliştirilen amperometrik biyosensör, galaktoz oksidaz immobilize edilmiş nafyon ince filmin platin elektrot yüzeyine modifiye edilmesiyle hazırlanmıştır.

Çalışma Ag/AgCl elektroda karşı +0,50 V’de ve oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir.

Optimum pH 7,2 ve oda sıcaklığında yapılan çalışmada, doğrusal çalışma aralığı 0,10‒8,0 mM ve cevap süresi <40 olarak bulunmuştur. Km değeri 29,1 mM olarak hesaplanmıştır. Biyosensörün 20 ölçüm sonrasında başlangıç aktivitesinin sadece

%10’unu kaybettiği ve elektrodun raf ömrünün >1 ay olduğu rapor edilmiştir.

Elektrodun amperometrik cevabına, AA, UA, sükroz ve glukozun girişim etkisi incelenmiş, nafyonun düşük geçirgenliği sayesinde incelenen türlerin elektrot cevabına önemli bir etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Elektrodun uygulanabilirliğini göstermek amacıyla serum numunelerinde standart katma yöntemi kullanılarak geri kazanım çalışmaları yapılmıştır ve % 97,5‒105 aralığında geri kazanım sonuçları elde edilmiştir.

Gülce vd. (2002) tarafından polivinilferrosen kaplı Pt yüzeyine, galaktoz oksidaz enziminin immobilize edilmesiyle yeni bir enzim elektrot hazırlanmıştır. Tüm deneysel çalışmalar 25 ºC sıcaklıkta ve pH 13’de yapılmıştır. Enzim elektrodun amperometrik

25

ölçümleri, Ag/AgCl elektroda karşı +0,70 V sabit potansiyelde gerçekleştirilmiştir.

Elektrodun galaktoz derişimi 40 mM olana kadar doğrusal yanıt verdiği ve cevap süresinin 30‒40 s olduğu görülmüştür. Hazırlanan elektrodun % BSS değerinin <4 olduğu görülmüştür. İmmobilize enzim için Km değeri 21,7 mM olarak hesaplanmıştır.

Elektrodun kararlılığını araştırabilmek için, 3 gün boyunca 25‒30 ölçüm sonrasında galaktozun artan derişimlerine karşı elektrodun cevabına bakılmış ve enzim elektrot kararlılığının önemli ölçüde değişmediği görülmüştür.

Rajendran ve Irudayaraj (2002) tarafından glukoz, galaktoz ve laktoz tayini için mikrodiyaliz‒çift akış enjeksiyon (µFIAS) amperometrik sensör geliştirilmiştir.

Hazırlanan sensörün üç iyi kurulmuş analitik teknik (mikrodiyaliz numunelendirme, akış enjeksiyon analizi (FIA) ve amperometrik dedeksiyon) ile kombinasyon halinde olan enzim kataliz reaksiyonu üzerine dayandığı rapor edilmiştir. Çoklu analit sensörlerinde glukoz ve galaktozu aynı anda enjekte etmek ve her türün kendisine karşılık gelen enzimi sayesinde glukoz ve galaktoz tayini yapmanın mümkün olduğu rapor edilmiştir. Amperometrik ölçümler Ag/AgCl elektroda karşı +0,50 V sabit potansiyelde ve pH 7,0’de gerçekleştirilmiştir. Glukoz, galaktoz ve laktoz için derişim aralıkları sırasıyla 0,05‒10 mM, 0,1‒20 mM ve 0,2‒20 mM olarak bulunmuştur.

Glukoz, galaktoz ve laktoz tayini için hesaplanan % BSS değerleri %3‒4 aralığında verilmiştir. Sensör ile üç farklı süt numunesinde standart katma yöntemi kullanılarak glukoz ve galaktoz miktar tayini yapılmıştır. Ayrıca süt numunelerinde laktoz miktarı tayin edilmiş ve standart yöntem infrared spektroskopisi ile karşılaştırılmıştır.

Brahim vd. (2002) tarafından polipirol‒hidrojel kompozit membran kullanılarak galaktoz biyosensörü hazırlanmıştır. Kompozit materyal, UV çapraz‒bağlı poli (2‒hidroksietil metakrilat) [p(HEMA)] hidrojel içerisinde polipirolün büyütülmesiyle oluşan karma bir malzemedir. Optimize edilmiş galaktoz biyosensörü 5,0×10^‒5‒1,0×10^‒2 M doğrusal derişim aralığında ve 25µM gözlenebilme sınırı ile cevap vermiştir. Elektrodun duyarlığı 9,37×10² µAM^‒1 olarak bulunmuştur. Optimum koşullar altında (Ag/AgCl elektroda karşı +0,70 V sabit potansiyel, pH 7,3 ve 25 ºC’de) elektrodun cevap süresi 70 s olarak bulunmuştur. Hazırlanan biyosensörün >9 ay sonunda başlangıç aktivitesinin %70’ini muhafaza ettiği görülmüştür. Standart katma

26

yöntemi kullanılarak serum numunelerinde galaktoz tayini yapılmış ve % 97‒105 geri kazanım sonuçları elde edilmiştir. Askorbat, üre ve asetoaminofen türlerinin girişim etkisi incelenmiş ve elektrodun cevabı üzerinde herhangi bir bozucu etkisinin olmadığı görülmüştür.

Yao vd. (1998) tarafından yapılan çalışmada Pt elektrot yüzey üzerine poli (1,2‒diaminobenzen) filmin elektrokimyasal olarak biriktirilmesiyle sol‒jel silikata dayanan amperometrik biyosensör hazırlanmıştır. Sensörün kararlılığının enzim yüzeyinin gluteraldehit buharına tutulması ile arttığı rapor edilmiştir. Hazırlanan sensörler ile yapılan çalışmalar Ag/AgCl elektroda karşı +0,60 V ve 25 ºC’de gerçekleştirilmiştir.

Çizelge 1.4 Sol‒jel enzim sensörlerin analitik parametreleri

Tür Derişim Aralığı, M

Raf Ömrü,

Gün Cevap süresi, s

pH Kmapp, mM

Glukoz 2×10^‒6‒2×10^‒3 15 15 7,0 4,3

Galaktoz 2×10^‒5‒4×10^‒3 6 27 7,5 7,1

Kolesterol 6×10^‒5‒3×10^‒3 32 51 6,0 30,5

Yang vd. (1998) tarafından galaktoz oksidazın immobilizasyonu için polipirol filmin elektrokimyasal sentezi gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan polipirol galaktoz oksidaz elektrodun karakterizasyonu AFM ve Raman spektrumu ile incelenmiştir. Elektrot için çalışma aralığı 0‒2mM olarak verilmiştir. Çalışma, DKE elektroda karşı +0,50 V sabit potansiyelde, pH 6,1 ve 25 ºC sıcaklıkta gerçekleştirilmiştir.

Tkac vd. (1999) tarafından yapılan çalışmada galaktoz tayini için galaktoz oksidaz‒peroksidaz temelli enzim elektrot hazırlanmıştır. Ferrosen kaplı grafit elektrot yüzeyine, galaktoz oksidaz (5‒10 ünite) ile peroksidaz (10‒15 ünite) birlikte immobilize edilmiştir. Hazırlanan elektrot için çalışma aralığı ve gözlenebilme sınırı fosfat

tamponunda 1‒110 mg L^‒1 ve 0,51 mg L^‒1, borat tamponunda 3‒210 mg L^‒1 ve 1,42 mg L^‒1 olarak hesaplanmıştır. Elektrodun kararlı hal akımının %95’ine fosfat

tamponunda 44 s, borat tamponunda ise 25 s’de ulaştığı bulunmuştur. Optimum çalışma

27

potansiyeli DKE elektroda karşı 150 mV olarak bulunmuştur. Tüm ölçümler pH 8,5 ve 28 ± 1 ºC sıcaklıkta yapılmıştır. Elektrodun ard arda 12 ölçüm sonrasında başlangıç aktivitesini muhafaza ettiği görülmüştür.

Jinqing vd. (1997) tarafından yapılan çalışmada galaktoz oksidazın immobilizasyonunda iletken polimerlerin etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla polianilin film kaplı amperometirk biyosensörler hazırlanmıştır. Hazırlanan elektrotlar SEM, Raman spektrumu ve infrared spektrumu (IR) ile incelenmiştir. Elektrodun çalışma aralığı 0,2‒10 mM olarak bulunmuştur. Çalışma, DKE elektroda karşı +0,65 V sabit potansiyel ve pH 7,5’de gerçekleştirilmiştir.

Szabo vd. (1996) oksijen ölçümüne dayalı akış enjeksiyon analiz yöntemini kullanarak amperometrik sensör geliştirmişlerdir. Bu amaçla teflon levha üzerine galaktoz oksidaz immobilize edilmesiyle elektrot hazırlanmıştır. Elektrot ile 900’den fazla örnek 6 hafta boyunca okunmuştur. Tüm ölçümler pH 6,6 ve 32 ºC sıcaklıkta yapılmıştır. Hazırlanan elektrodun uygulanabilirliğini göstermek amacıyla farklı fermentasyon ürünlerinde galaktoz tayini yapılmış ve elde edilen sonuçlar UV yöntemi ile karşılaştırılmıştır.

Biyosensörün cevabı üzerine ksiloz, maltoz, glukoz, fruktoz, sitrik asit ve etanol türlerinin girişim etkisi incelenmiştir. Bu türlerin elektrot cevabı üzerinde %5’den küçük bir girişim etkisine neden olduğu bulunmuştur.

Peteu vd. (1996) tarafından glukoz, galaktoz ve kolin tayini için Clark‒tipi oksidaz enzim temelli amperometrik oksijen mikroelektrotlar geliştirilmiştir. Poliakrilamid matriks kaplı elektrodun ucuna enzim immobilize edilerek enzim mikroelektrotlar hazırlanmıştır. Numunedeki analit derişimi, oksijenin derişimindeki azalmayla izlenmiştir. Biyosensörün cevap süresi 0,5‒5 s aralığında bulunmuştur. Hazırlanan elektrotların 2µM‒10mM doğrusal çalışma aralığında ve 2µM gözlenebilme sınırı ile cevap verdiği rapor edilmiştir. Glukoz ve galaktoz türleri için duyarlık sırasıyla 75 pA/mM ve 51 pA/mM olarak bulunmuştur. Kolin içinse çok düşük bir duyarlık bulunmuştur. Tüm çalışmalar pH 7,4 ve 20‒22 ºC sıcaklıkta gerçekleştirilmiştir.

Glukoz, galaktoz ve kolin elektrotların raf ömrü sırasıyla <1 ay, 6 ay ve 2 hafta olarak

28

bulunmuştur. Glukoz ve galaktoz mikrobiyosensörleri için çeşitli türlerin girişim etkileri incelenmiştir. Askorbik asit ve ürik asit türlerinin, glukoz mikroelektrodunun cevabı üzerinde % 4,5 girişim etkisine sahip olduğu görülmüştür.

Cosnier ve Innocent (1994) tarafından yapılan çalışmada, galaktoz ve laktoz tayini için poli(amfifil pirol)‒galaktoz oksidaz temelli elektrot hazırlanmıştır. Elektrodun cevabının enzimatik olarak ortaya çıkan H2O2’in elektrokimyasal tayinine bağlı olduğu rapor edilmiştir. Hazırlanan elektrot galaktoz için 10^‒6‒1,8×10^‒3 M doğrusal çalışma aralığında, 5×10^‒7 M gözlenebilme sınırı ve 14,2 mAM^‒1 cm^‒2 duyarlıkla cevap vermiştir. Laktoz içinse 8×10^‒6‒ 10^‒3 M doğrusal çalışma aralığında, 6×10^‒6 M gözlenebilme sınırı ve 1,35 mAM^‒1 cm^‒2 gibi düşük birduyarlıkla cevap vermiştir. En yüksek cevap pH 6’da elde edilmiştir. 25 galaktoz ölçümü için %BSS değeri %4 olarak hesaplanmıştır. 135 ölçüm sonrasında elektrot başlangıç aktivitesinin %18’ini kaybetmiştir.

Schumacher vd. (1993) tarafından galaktoz ve galaktoz içeren sakkaritlerin tayini için enzim elektrotlar geliştirilmiştir. Optimum pH 7,0 olarak bulunmuş ve pH 5,0 değerinin altındaki pH’larda enzim aktivitesinin oldukça düştüğü görülmüştür. Enzim aktivitesinin, sadece galaktoz molekül sayısına değil aynı zamanda immobilizasyon türü ve sterik etkiye bağlı olduğu rapor edilmiştir. Galaktoz enzim elektrot, galaktoz, laktoz, rafinoz ve stakiyoz türlerine karşı 10‒100 mmol/L derişim aralığında cevap vermiştir.

Shaolin (1994) tarafından yapılan çalışmada polianilin film üzerine galaktoz oksidazın immobilize edilmesiyle galaktoz oksidaz elektrot hazırlanmıştır. Optimum koşullar altında (pH 6,1 ve 30,4 °C) elektrodun derişim aralığı 0,2‒6 mmol dm^‒3 olarak bulunmuştur. Tüm ölçümler +0,50 V sabit potansiyelde yapılmıştır. Enzim kataliz reaksiyonunun aktivasyon enerjisi 41,8 kJ mol^‒1 olarak verilmiştir. İmmobilize enzim için Km değeri 0,22 mol dm^‒3 olarak hesaplanmıştır

Vrbova vd. (1992) tarafından yapılan çalışmada galaktoz tayini için Clark‒tipi oksijen sensör hazırlanmıştır. Çalışmada oksijen derişimindeki azalma takip edilerek galaktoz

29

tayini gerçekleştirilmiştir. Enzim, naylon ağ veya kollajen membran kullanılarak immobilize edilmiştir. Her iki şekilde de hazırlanan elektrotlar için doğrusal çalışma aralığı 0,0067‒6,67 mmol L^‒1, olarak verilmiştir. Elektrotların raf ömrü 30 gün olarak bulunmuştur.