4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA
4.6 Enzim Elektrotların Hazırlanması
4.6.1 Ksantin enzim elektrotlar
4.6.1.2 Performans faktörleri
Hazırlanan ksantin enzim elektrotların optimum çalışma koşulları belirlendikten sonra, bu koşullarda; çalışma aralığı ve duyarlığı, cevap süresi, tekrar kullanılabilirlik,
(a) (b)
(c)
89
tekrarlanabilirlik, ömür ve bozucu türlerin etkisi gibi performans faktörleri incelendi.
Sadece XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE enzim elektrot için belirlenen bu optimum koşulların, XO/HRP/MWCNT/Co3O4CH/GCE enzim elektrodun performans faktörlerinin incelenmesinde de geçerli olduğu düşünüldü ve bu üç elektrot için elde edilen sonuçlar ve yorumlar aşağıda verildi.
Çalışma aralığı ve duyarlığı
Hazırlanan XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE, XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE ve XO/HRP/
MWCNT/Co3O4/CH/GCE enzim elektrotların ksantine cevabı optimum çalışma koşullarında, Bölüm 3.12.1’de anlatıldığı gibi, belirlendi. Bu amaçla akım farkı ksantin derişimine karşı grafiğe geçirilerek, Şekil 4.18.a ve 4.19.a’da verildi. Bu eğrilerden yararlanılarak her bir ksantin elektrodun doğrusal çalışma aralığı, duyarlığı ve gözlenebilme sınırı, kalibrasyon eğrileri çizilerek bulundu (Şekil 4.18.b ve 4.19.b).
Şekil 4.18-4.20’deki eğriler, üç farklı kalibrasyon verilerinden elde edildi ve hata çubukları ile birlikte verildi. Bu kalibrasyon doğrularından XO/MWCNT/Co3O4/ CH/GCE ve XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE elektrotların doğrusal çalışma aralığı sırasıyla 2,0×10‒7‒1,6×10‒5 M ve 5,0×10‒7‒8,0×10‒5 M; gözlenebilme sınırları 9,0×10‒8 M ve 2,0×10‒7 M; duyarlıkları 9,62 µA/mM ve 6,58 µA/mM olarak belirlendi. Bu çalışmada elde edilen gözlenebilme sınırları, literatürde verilen pek çok ksantin enzim elektrotlarınkinden daha düşüktür: 1,0×10‒7 M (Peu ve Li 2000), 1,0×10‒6 M (Arslan vd. 2006), 2,0×10‒4 M (Villalonga vd. 2007), 1,0×10‒7 M (Shan vd. 2009), 5,20×10‒4 ve 1,30×10‒4 mM (Baş vd. 2011), 0,8 µM (Devi vd. 2011), 0,6 µM (Devi vd. 2011), 1,5×10‒6 M (Dodevska vd. 2010), 1,7 µM (Liu vd. 2014), 0,65 µM (Amire‒Aref vd.
2014). XO içermeyen MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve Co3O4/CH/Grafen/GCE elektrotların +0,7 V’da ksantine cevap verdiği Şekil 4.13 ve 4.14’den görülmektedir. Bu durum hazırlanan bu enzim elektrotlar için bir dezavantaj gibi görülebilir. Ancak, MWCNT/Co3O4/CH/GCE ile XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE’un ve Grafen/Co3O4/CH/GCE ile XO/Grafen/Co3O4/CH/GCE’un ksantin duyarlıkları karşılaştırıldığında enzim elektrotların duyarlıklarının MWCNT’lü elektrotlar için yaklaşık 2,5 kat; grafenliler için ise 3,5 kat daha iyi olduğu belirlendi.
90
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
0 0,4 0,8 1,2 1,6
Akım Farkı, µA
Ksantin Derişimi, mM
y = 9,62x + 0,0036 R² = 0,9993
0 0,08 0,16
0 0,004 0,008 0,012 0,016
Akım Fakı, µA
Ksantin derişimi, mM
0 0,5 1 1,5
100 1100 2100
Akım, µA
Zaman, s
Şekil 4.18.a. XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE’un cevabına substrat derişiminin etkisi, b. XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE’a ait kalibrasyon grafiği (N=3) ve c. i‒t grafiği (0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda
sıcaklığı)
Ayrıca XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE enzim elektrotların doğrusal çalışma aralıkları daha geniş, gözlenebilme sınırları ise daha düşüktür. Bu nedenle, ksantin tayini için enzim immobilize edilmiş elektrotların çok daha iyi özellikleri sahip olduğu söylenebilir. Sonuç olarak, pek çok biyolojik numunede girişim etkileri numunelerin seyreltilmesi ile giderildiğinden, böyle düşük bir gözlenebilme sınırına sahip bu ksantin enzim elektrotlar yardımıyla bu tip numunelerde ksantin tayininin yapılabileceği düşünüldü (Erden vd. 2012, Devi vd. 2012, 2013).
(a) (b)
(c)
91 0,0
0,3 0,6 0,9 1,2 1,5
0 0,5 1
Akım Farkı, µA
Ksantin Derişimi, mM
y = 6,58x + 0,0285 R² = 0,9896
0 0,2 0,4 0,6 0,8
0 0,05 0,1
Akım Farkı, µA
Ksantin Derişimi, mM
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5
3000 4000 5000 6000
Akım,µA
Zaman, s
Şekil 4.19.a. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE’un cevabına substrat derişiminin etkisi, b. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE’a ait kalibrasyon grafiği (N=3), c. i‒t grafiği (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V,
oda sıcaklığı)
XO/HRP/MWCNT/Co3O4/CH/GCE elektrodun doğrusal çalışma aralığının, 2,0×10−5‒3,6×10−4 M; gözlenebilme sınırının 2,0×10‒6 M ve duyarlığının 3,14 µA/mM olduğu Şekil 4.20’den görülmektedir. Bu elektrodun gözlenebilme sınırının çalışmada hazırladığımız diğer iki elektrottan daha yüksek olduğu görüldü.
(a) (b)
(c)
92
y = 3,1359x + 0,1199 R² = 0,9821
0 0,4 0,8 1,2
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Akım Farkı, µA
Ksantin Derişimi, mM
Şekil 4.20 XO/HRP/MWCNT/ Co3O4/CH/GCE’a ait kalibrasyon grafiği
(içteki grafik: 0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı ‒0,30 V, oda sıcaklığı)
Ancak, bu elektrodun düşük çalışma potansiyelinde cevap vermesi, biyolojik ortamlarda bulunan pek çok türün ise, cevap vermemesi önemli bir üstünlük olarak değerlendirildi.
Ayrıca, bu potansiyelde enzimsiz MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve Co3O4/CH/Grafen/GCE elektrotların ksantine cevap vermemesi bu enzim elektrodun önemli bir özelliğidir.
Michaelis‒Menten sabitleri (Km) enzimatik ilginin bir göstergesi olup, Lineweaver‒Burk eşitliği kullanılarak hesaplandı:
i 1=
imaks
1 +
maks M
i
K ×
c 1
Bu eşitlikte i, substrat ilavesinden sonraki kararlı hal akımı; imaks, doygun substrat şartları altında ölçülen kararlı hal akımı; c ise, çözeltideki substrat derişimidir. Bu çalışmada sadece XO içeren ksantin enzim elektrotlar için Michaelis‒Menten sabiti hesaplandı. Bu amaçla 1/c’e karşı 1/i değerleri grafiğe geçirildi (Şekil 4.1).
XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE için Lineweaver‒Burk grafiğinden hesaplanan Michaelis‒Menten sabitleri (Km) sırasıyla 0,06 mM ve 0,17 mM olarak bulundu.
0 200 400 600 800
-3 -2 -1 0
time(s)
y= 3,14x+0,12 R2=0,9821
93 Şekil 4.21 Michaelis-Menten sabitleri (Km)
a. XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE (0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ve b. XO/Co3O4/CH/Grafen/ GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı)
Ksantin oksidazın kullanıldığı çeşitli modifiye enzim elektrotların Km‘leri için, 1,11 mM (Pei ve Li 2000), 9,9 mM (Villalonga vd. 2007), 1,33 mM (Arslan vd. 2006), 3,45 mM (Baş vd. 2011) gibi değerler rapor edilmiştir. Enzim elektrotlar için bulduğumuz Km
değerinin daha önce literatürde rapor edilen pek çok ksantin enzim elektrot için bulunan Km değerlerinden düşük olması, immobilizasyon işleminden sonra XO’ın ksantine ilgisinin arttığının bir göstergesidir (Liu vd. 2012).
Cevap süresi
Analitik kimyanın en önemli amaçlarından bir tanesi, analizin en kısa sürede yüksek doğrulukla yapılabilmesidir. Enzim elektrotlar durumunda analiz süresinin kısa olabilmesinin en önemli göstergesi elektrodun dinamik cevap süresidir. Tüm enzim elektrotlarda bu sürenin mutlaka belirlenmesi gerekir. Bu amaçla hazırlanan modifiye ksantin enzim elektrotların dinamik cevap süresi, Bölüm 3.12.2’de anlatıldığı gibi, her ksantin ilavesinden sonra kararlı hal akımına ulaşılması için gerekli süre ölçülerek belirlendi. Cevap süresi olarak bu sürenin %95’ine ulaşıldığındaki değer alındı (Arai vd. 1996, Peu vd Li 2000, Arslan vd. 2006, Shan vd. 2009, Dervisevic vd. 2015). Buna göre dinamik cevap süresi XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE için 5s;
y = 0,09x + 1,43 R² = 0,9961 0
10 20 30 40
0 200 400 600
1/i
1/c y = 0,10x + 0,59
R² = 0,999 0
6 12 18
0 50 100 150
1/i
1/c
(a) (b)
94
XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE için 10s; ve HRP/XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE için ise 10 s olarak bulundu. Bu cevap sürelerinin literatürlerde <1 dakika (Arai vd. 1996), 15s (Peu ve Li 2000), 15s (Arslan vd. 2006), 20s (Villalonga vd. 2007), 13s (Rahman vd.
2007), 24s (Gao vd. 2009), >5s (Shan vd. 2009), 60s (Dodevska vd. 2010), 15‒20s (Baş vd. 2011), 5s (Devi vd. 2011, 2013), olarak verilen cevap süreleri ile yarışabilecek kadar düşük olduğu görüldü. Elde edilen bu kısa cevap sürelerinin, kitosan film ile substrat arasındaki hızlı yük aktarımını ve immobilize edilmiş XO ve substrat arasındaki hızlı elektron değişimini gösterdiği; bunun da, hazırlanan elektrot yüzeyindeki filmlerin, enzimin katalitik özelliklerini engellemediğinden kaynaklandığı düşünülmektedir (Shan vd. 2009).
Tekrar kullanılabilirlik
Enzim elektrotların hazırlanarak ilgili substrat tayininde kullanılmasında istenen durumlardan biri de daha az enzim kullanılarak, daha çok analiz yapabilmektir. Bu nedenle enzim elektrotlar için önemli bir parametre olan tekrar kullanılabilirliğin belirlenmesi gerekir. Bu tez çalışmasında hazırlanan ksantin enzim elektrotların tekrar kullanılabilirliği, Bölüm 3.12.3’te anlatıldığı gibi, aynı enzim elektrot kullanılarak ard arda çizilen 5 ayrı kalibrasyon eğrilerinin duyarlıklarının BSS’sı hesaplanarak belirlendi (Şekil 4.22 ve 4.23). Şekillerden görüldüğü gibi, kalibrasyon eğrilerinin tekrarlanabilirliği oldukça yüksektir. Duyarlıklardan hesaplanan BSS değerleri XO/
/MWCNT/Co3O4/CH/GCE için %0,5; XO/Co3O4/Grafen/CH/GCE için %1,0 olarak bulundu.
Çalışmada bulunan %BSS değerlerinin literatürlerde verilen %6,0 (Arslan vd. 2006),
%7,5 (anodik) ve %6,7 (katodik) (Rahman vd. 2007), %6,3 (Çubukcu 2007), %3,4 (Gao vd. 2009), %4,9 (Shan vd. 2009), %6,2 (Teng vd. 2010), %5,1 (Devi vd. 2011), %3,2 (Liu vd. 2012) ve %5,2 (Devi vd. 2012) değerlerinden çok daha düşük olması hazırlanan elektrotların tekrar kullanılabilirliğin iyi olduğunun ve bu elektrotlar ile ard arda çok sayıda analiz yapılabileceğinin bir göstergesi olduğu söylenebilir.
95 Şekil 4.22 Elektrotların tekrar kullanılabilirliği
a. XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE (0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı) ve b. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı)
Tekrar üretilebilirlik
Çeşitli çalışmalarda geliştirilen elektrotlar rutin analizlerde kullanılacak ise, bu elektrotların tekrar üretilebilirliğinin iyi olması istenir. Bu çalışmada aynı gün aynı şartlarda hazırlanan 3 farklı ksantin enzim elektrotların tekrar üretilebilirliği, Bölüm 3.12.4’de anlatıldığı gibi, belirlendi. Bu XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE elektrotların kalibrasyon eğrilerinin duyarlığının BSS’sı %2,0; XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE elektrodun ise %1,2 olarak bulundu. Literatürler incelendiğinde bu iki elektrodun tekrar üretilebilirliğinin, %2,7 (Pei ve Li 2000), %3,5 (Liu vd. 2012), <7,8 (Liu vd. 2014),
%1,1 (Mao vd. 2000) gibi pek çok çalışmada elde edilenden daha iyi olduğu görüldü.
Çalışmamızda elde edilen yüksek tekrarlanabilirlik sonuçları, elektrot yüzeyinde oluşturulan filmlerin enzim immobilizasyonu için elverişli ve yeniden üretilebilir bir zemin oluşturulduğunu göstermektedir (Shan vd. 2009). Ayrıca, grafenli elektrotların tekrar üretilebilirliğinin daha iyi olması, grafen ile modifiye edilen GCE yüzeyinin, MWCNT’e göre daha tekrarlanabilir bir yüzey oluşturmasından kaynaklanabilir. Çünkü MWCNT’ler CH içinde dağıtılarak yüzeye damlatıldığında her seferinde aynı homojen dağılım elde edilemeyebilir. Bu durum otomatik bir sistem oluşturularak ortadan kaldırılabilir.
y = 6,08x + 0,05 R² = 0,9908 y = 6,02x + 0,02
R² = 0,9883
y = 6,15x + 0,04 R² = 0,9916 y = 6,17x + 0,03
R² = 0,9895 y = 6,18x + 0,03
R² = 0,9899
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0 0,02 0,04 0,06 0,08
Akım Farkı, µA
Ksantin Derişimi, mM y = 9,72x + 0,02
R² = 0,9959 y = 9,75x + 0,01
R² = 0,9853
y = 9,70x + 0,01 R² = 0,9822
y = 9,72x + 0,01 R² = 0,9907 y = 9,61x - 0,004
R² = 0,9945 0
0,1 0,2 0,3
0 0,01 0,02 0,03
Akım Farkı, µA
Ksantin Derişimi, mM
(a) (b) (b)
96 Ömrü
Enzim elektrotların normal koşullar altında duyarlıklarını korudukları süre, elektrot ömrü olarak ifade edilir. Hazırlanan ksantin enzim elektrotların ömrü, Bölüm 3.12.5’te anlatıldığı gibi, sabit derişimde ksantin içeren optimum şartlarda hazırlanmış 0,05 m tampon çözeltisinde farklı günlerde ölçülerek, akımı farkının güne karşı grafiğe geçirilmesiyle belirlendi (Şekil 4.23). XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE elektrodun bir ay sonunda başlangıç duyarlığının %35’ini kaybettiği görüldü. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE elektrodun ise başlangıç duyarlığının bir ay sonunda %11’ini, iki ay sonunda ise
%17’sini kaybettiği görüldü. Literatürlerde, Shan vd. (2009) 28 gün sonunda elektrodun başlangıç aktivitesinin %15’ini, Arslan vd. (2006) 45 gün sonunda %65’ini, Çubukçu vd. (2007) bir hafta sonunda %18’ini, Devi vd. (2012) bir ay sonunda %30’unu kaybettiğini rapor edilmiştir. Çalışmada elde edilen yüksek uzun ömür kararlığının, XO/MWCNT/Co3O4/CH ya da XO/Co3O4/CH/Grafen matrikslerinin XO ile kuvvetli etkileşiminden ve bu matrikslerde XO’ın aktivitesinin uzun süre korunmasından kaynaklandığı düşünülmektedir (Li vd. 2008).
Şekil 4.23 Elektrotların ömrü
a. XO/Co3O4/MWCNT/CH/GCE enzim (0,05 M pH 7,0 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda
sıcaklığı, ksantin derişimi: 0,1 mM) ve b. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE (0,05 M pH 7,5 fosfat tamponu, Ag/AgCl’ye karşı +0,70 V, oda sıcaklığı, ksantin derişimi: 0,06 mM)
0 0,4 0,8 1,2 1,6 2
0 10 20 30
Akım Farkı, µA
Süre, Gün
0 0,1 0,2 0,3
0 10 20 30 40 50 60
Akım Farkı, µA
Süre, Gün
(a) (b)
97 Bozucu türlerin etkisi
İdeal bir enzim elektrot sadece analitin derişimindeki değişikliklere cevap vermeli, ortamda bulunan diğer kimyasal türlerin varlığından etkilenmemelidir. Aksi taktirde, bozucu türlerin derişimleri değiştiğinde, analitin derişimi için yanlış sonuçlar elde edilir.
Eğer bozucu türlerin derişimlerini kontrol etmek mümkün değilse, bu türlerin enzim elektrotların cevabına etkisi belirlenmelidir. Bu amaçla çalışmamızda XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE modifiye enzim elektrotların cevabına, balık numunesinde bulunabilecek ve bozucu etki yapabilecek glukoz, ürik asit, askorbik asit ve sodyum benzoat türlerinin etkisi, Bölüm 3.12.6’da anlatıldığı gibi, sabit ksantin derişiminde incelendi. Hesaplanan % girişim sonuçları çizelge 4.1’de verildi.
Çizelge 4.1 incelendiğinde, XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE için, glukoz, ürik asit, askorbik asit türlerinin yüzde girişim etkisi sırasıyla 1, 15 ve 10;
XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE için ise glukoz, ürik asit, askorbik asit ve sodyum benzoat için yüzde girişim ‒3, 15, 20 ve ̶ 4 olarak bulundu. Çalışmada askorbik asit ve ürik asidin girişim etkisinin diğerlerine göre daha yüksek olması, bu elektrotların +0,7 V’da
Çizelge 4.1.a. XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE, b. XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE ksantin enzim elektrotların cevabına çeşitli türlerin etkisi
XO/MWCNT/Co3O4//CH/GCE XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE Girişim yapan
tür Derişima (M) Girişim (%)
Girişim yapan
tür Derişima (M) Girişim (%)
Glukoz 5,0×10−5 1 Glukoz 2,0×10−5 ̶ 3
Ürik asit 5,0×10−5 15 Ürik asit 2,0×10−5 15
Askorbik asit 5,0×10−5 10 Askorbik asit 2,0×10−5 20
Sodyum Benzoatb ̶ ̶ Sodyum Benzoat 2,0×10−5 ̶ 4
Ksantin 5,0×10−5 ̶ Ksantin 2,0×10−5 ̶
a Girişim yapan türlerin hücre içerisindeki derişimleri
b Girişim etkisi incelenmedi
98
çalışıyor olması, bu potansiyelde bu türlerin yükseltgenmesinden kaynaklanmaktadır.
Ancak, balık numunesinde ksantin ve tazelik tayini yapılırken numunenin seyreltilmesi ve standart katma yöntemi kullanılmasıyla askorbik asit ve ürik asidin girişim etkisinin azaltılabileceği düşünüldü.
Literatürlerdeki ksantin ile ilgili bazı çalışmalar incelendiğinde, Devi vd. (2012) tarafından yapılan çalışmada 0,5 V’de askorbik asitin %20 girişim etkisi olduğu, Devi vd. (2013) ve (2011) yılında yapılan diğer bir çalışmada 0,5 V’de askorbik asitin %10 girişim etkisi olduğu, Erden vd. (2012) tarafından yapılan çalışmada 0,25 V’de askorbik asitin %18,2 girişim etkisi olduğu rapor edilmiştir. Bu çalışmada elde ettiğimiz sonuçların literatürde elde edilenlerin bir kısmından daha iyi olduğu görüldü.
Bu tez çalışması sonucunda hazırlanan XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE ve XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE ksantin enzim elektrotların optimum çalışma koşulları ve performans faktörleri çizelge 4.2 özetlendi. Çizelgedeki sonuçlar bu enzim elektrotların balık numunelerinde ksantin tayininde kullanılabileceği şeklinde değerlendirildi.
Çizelge 4.2 Ksantin enzim elektrotların optimum çalışma koşulları ve performans faktörleri
Optimum Çalışma Koşulları
XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE
XO/HRP/MWCNT/Co3O4/CH/GCE XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE
Enzim miktarı (U) 0,12 ; 6 0,3
pH 7,0 7,5
Çalışma potansiyeli (V) +0,7 +0,7
Performans Faktörleri XO/MWCNT/Co3O4/CH/GCE
XO/HRP/MWCNT/Co3O4/CH/GCE XO/Co3O4/CH/Grafen/GCE Çalışma aralığı (M) 2,0×10‒7‒1,6×10‒5 ; 2,0×10‒5‒3,6×10‒4 5,0×10‒7‒8,0×10‒5
Gözlenebilme sınırı (M) 9,0×10‒8 ; 2,0×10‒6 2,0×10‒7
Duyarlığı (µA/mM) 9,62 ; 3,14 6,58
KM sabiti (mM) 0,06 0,17
Cevap süresi (s) 5 ; 10 10
Tekrar kullanılabilirilik
(%BSS) 0,5 1,0
Tekrar üretilebilirlik
(%BSS) 2 1,2
Ömür (gün) >30 >60
Bozucu türler (% girişim) Ürik asit (%15), askorbik asit (%10); ─
Ürik asit (%15), askorbik asit (%20)
99