ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
SUCUKTA NİTRİT İÇERİĞİNİN AZALTILMASINDA KOMBUCHA EKSTRAKTININ KULLANIM OLANAĞI
Sümeyye TEMİZGÜL
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ANKARA 2021
Her hakkı saklıdır
ii ÖZET Yüksek Lisans Tezi
SUCUKTA NİTRİT İÇERİĞİNİN AZALTILMASINDA KOMBUCHA EKSTRAKTININ KULLANIM OLANAĞI
Sümeyye TEMİZGÜL Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Kezban CANDOĞAN
Çalışmada, farklı oranlarda Kombucha çayı (KOM) ilave edilerek nitrit miktarı azaltılması hedeflenen sucuklarda fiziksel, kimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal değişimler belirlenmiştir. Bu amaçla kontrol, %5 ve %10 Kombucha çayı ilave edilmiş gruplar (%5-KOM ve %10-KOM), formülasyondaki nitrit miktarı %50 azaltılarak %5 ve %10 KOM ilave edilmiş gruplar (%5-KOM-NA ve %10-KOM-NA) olmak üzere 5 grup sucuk üretilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre Kombucha çayı ekstraktı kullanımının sucuklarda nem, protein, yağ, kül ve tuz içerikleri ile su aktivitesi değerleri üzerine önemli bir etki yapmadığı tespit edilmiştir (p>0.05). Yüksek konsantrasyonda Kombucha çayı ilave edilmiş %10 KOM ve %10 KOM-NA gruplarının sırasıyla 4.70 ve 4.64 olarak belirlenen pH değeri kontrol grubundan (pH 4.98) önemli ölçüde düşük bulunmuştur (p<0.05). Bununla birlikte sucuklarda %1.14-1.48 laktik asit arasında değişen titrasyon asitliğinin gruplar arasında önemli bir farklılık göstermediği saptanmıştır (p>0.05). Kontrol grubunda 17.50 ppm olan kalıntı nitrit miktarının, Kombucha çayı ilave edilmiş grupların kalıntı nitrit miktarından (15.36-15.78 ppm) önemli ölçüde farklı olduğu saptanmıştır (p<0.05). Kombucha çayı ilavesinin sucuklarda enstrümental renk değerleri, tiyobarbitürik asit reaktif maddeler ve nitrozohemokrom miktarında istatistiksel açıdan önemli bir değişime yol açmadığı belirlenmiştir (p>0.05). Sucuklarda gerçekleştirilen mikrobiyolojik analizler sonucunda toplam aerob mezofil bakterilerileri, laktik asit bakterileri, mikrokok/stafilokoklar ve maya/küf sayılarının da Kombucha çayı ekstraktı kullanımından istatistiksel açıdan önemli ölçüde etkilenmediği saptanmıştır (p>0.05). Çiğ ve pişmiş sucuklarda görünüş, renk, koku, lezzet, tekstür ve genel beğeni özellikleri dikkate alınarak yapılan duyusal analizde Kombucha çayı ekstraktı ilavesinin sucukların duyusal özellikleri üzerine olumsuz yönde bir etkisinin olmadığı gözlenmiştir (p>0.05).
Ocak 2021, 66 Sayfa
Anahtar Kelimeler: Sucuk, Kombucha Ekstraktı, Nitrit azalması, Fonksiyonel et ürünü
iii ABSTRACT
Master Thesis
POSSIBILITY OF USING KOMBUCHA EXTRACT TO REDUCE NITRITE CONTENT IN SUCUK
Sümeyye TEMİZGÜL
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering
Supervisor: Prof. Dr. Kezban CANDOĞAN
In this study, the effects of Kombucha tea extract (KOM) addition into sucuk formulation for the purpose of nitrite reduction on physical, chemical, microbiological and sensory changes were evaluated. For this aim, five groups of sucuk were manufactured as follows: control, 5% or 10% KOM added groups with or without 50%
nitrite reduction (NA) in the formulation. The results ontained from this study indicated that there was no significant effect of KOM addition into sucuk formulation on moisture, protein, fat, ash and salt contents, and water activity values (p>0.05). The groups with the addition of the higher KOM concentration, that are 10% KOM and 10%
KOM-NA groups, exhibited lower (p<0.05) pH values (pH 4.70 and 4.64,respectively) than the control (pH 4.98). However, titratable acidity which ranged between 1.14% and 1.48% lactic acid in sucuk samples did not show a significant difference between groups (p>0.05). The control sucuks possessed residual nitrite content of 17.50 ppm which differed significantly (p<0.05) from those of KOM groups (between 15.36-15.78 ppm residual nitrite range). Addition of KOM tea extract did not result in significant change in instrumental color (CIE lightness-L*, redness-a* and yellowness-b* values), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), and content of nitrosohemochrome pigment (p>0.05). Furthermore, in microbiological analyses, counts of total aerobic mesophilic bacteria, lactic acid bacteria, Staphyloccocus-Micrococcus spp. and yeast/mold were not affected by KOM tea extract incorporation into the sucuk formulation (p>0.05). In sensory evaluation, no adverse effect of Kombucha tea extract addition on the appearance, odor, color, flavor, texture and overall acceptability attributes of was detected (p>0.05).
January 2021, 66 pages
Key Words: Sucuk, Kombucha Extract, Nitrite reduction, Functional meat product
iv
ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR
Tez çalışmam boyunca bana bilgisi ve tecrübesiyle yol gösteren hem maddi hem manevi her zaman yanımda olan danışmanım Sayın Prof. Dr. Kezban CANDOĞAN’a, sucuk üretim koşullarının temini için Et ve Süt Kurumu (ESK) Sincan Et Kombinası Müdürlüğünden Sayın Yüksek Gıda Mühendisi Hazret ÖZDEMİR, Sayın Gıda Mühendisi Cansu GENÇ ve ESK çalışanlarına, mikrobiyolojik çalışmalarım için benden yardımlarını esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Kamuran AYHAN, Sayın Dr. Esin ORHAN YANIKAN’a, Sayın Dr. Aysu TOLUN’a, Sayın Aysun METE’ye, tecrübesiyle bana yol gösteren Sayın Dr. Öğretim Üyesi Eda DEMİROK SONCU ve Sayın Prof. Dr. Nuray KOLSARICI’ya, analizlerimde bana yardımcı olan Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisi Doktora öğrencisi Elvan Gökçen BULUT ve Pınar KADIOĞLU, Yüksek Lisans öğrencileri Betül GÖKSÜN, Ali Mekarim ÖZGÜR, Gizem ÖZDEMİR, Tuğba Gözde GÜN, Feyza YETİMOĞULLARI, Büşra CANBAZ ve Kombucha ile tanışmama vesile olan Sayın halam Zennure AKBAYIR’a ve en büyük destekçim olan her zaman yanımda olan değerli aileme teşekkürlerimi borç bilirim.
Sümeyye TEMİZGÜL Ankara, Ocak 2021
v
İÇİNDEKİLER
TEZ ONAYI ... i
ETİK ... i
ÖZET ... ii
ABSTRACT ... iii
ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR ... iv
SİMGELER DİZİNİ ... vii
ŞEKİLLER DİZİNİ ... ix
ÇİZELGELER DİZİNİ ... x
1. GİRİŞ ... 1
2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ÖZETLERİ ... 4
2.1 Geleneksel Bir Et Ürünü Olarak Sucuk ... 4
2.2 Nitrit Kullanımına Alternatif Ürün: Kombucha ... 14
3. MATERYAL VE YÖNTEM ... 21
3.1 Materyal ... 21
3.2 Kombucha Çayının Üretimi ... 21
3.3 Sucuk Üretimi ... 22
3.4 Başlangıç Sucuk Hamurunda ve Son Üründe Yapılan Analizler ... 24
3.4.1 Nem içeriği ... 24
3.4.2 Kül içeriği ... 24
3.4.3 Yağ içeriği ... 25
3.4.4 Protein içeriği ... 25
3.4.5 Tuz içeriği ... 25
3.4.6 pH ve titrasyon asitliği değerleri ... 26
3.4.7 Su aktivitesi değeri ... 26
3.4.8 Kalıntı nitrit içeriği ... 26
3.4.9 Enstümental renk değerleri ... 27
3.4.10 Nitrozohemokrom içeriği... 28
3.4.11 Tiyobarbiturik asit reaktif madde (TBARS) değerleri ... 28
3.4.12 Mikrobiyolojik analizler ... 28
3.4.12.1 Toplam aerob mezofil bakteri (TAMB) sayımı ... 29
3.4.12.2 Laktik asit bakteri (LAB) sayımı ... 29
vi
3.4.12.3 Maya ve küf sayımı ... 29
3.4.12.4 Mikrokok-Stafilokok sayımı ... 30
3.4.13 Duyusal analiz ... 30
3.4.14 İstatistik analiz ... 30
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ... 31
4.1 Kimyasal Bileşim ... 31
4.3 pH ve Titrasyon Asitliği Değerleri ... 37
4.4 Kalıntı Nitrit İçeriği ... 42
4.5 Renk Değerleri ... 44
4.6 Nitrozohemokrom Değerleri ... 47
4.7 Tiyobarbiturik Asit Reaktif Madde (TBARS) Değerleri ... 48
4.8 Mikrobiyolojik Analizler ... 50
4.9 Duyusal Analiz Sonuçları ... 53
5. SONUÇ ... 55
KAYNAKLAR ... 57
EK 1 SUCUK DUYUSAL DEĞERLENDİRME FORMU ... 65
SKALA ... 65
ÖZGEÇMİŞ ... 66
vii
SİMGELER DİZİNİ
mg miligram
g gram
kg kilogram
m metre
cm santimetre
mm milimetre
nm nanometre
s saniye
L Litre
µL mikrolitre
mL mililitre
m3 metre küp
ppm milyonda bir
% yüzde
oC santigrat
β beta
± artı/eksi
ε epsilon
L* açıklık/koyuluk
a* kırmızılık
b* sarılık
aw su aktivitesi değeri
s/h yüzey/hacim
w/v ağırlık/hacim
dk dakika
A.Ş Anonim Şirketi
log logaritmik
kob koloni oluşturan birim
⁓ yaklaşık
NaNO2 sodyum nitrit
KNO2 potasyum nitrit C6H806 Askorbik asit HNO2 nitröz asit
C6H6O6 Dehidroaskorbik asit
NO Azot monoksit
NO3 Nitrat
N2O Nitröz oksit
N2 Azot
NH3 Amonyak
H2O Su molekülü
Fe2+ Ferro demir
Fe3+ Ferrik demir
IC50 %50 oranında inhibe eden konsantrasyon
-SH Sülfidril iyonu
viii Kısaltmalar
FAO Gıda ve Tarım Örgütü
WHO Dünya Sağlık Örgütü
JECFA Gıda Katkı Maddeleri Uzman Komitesi EFSA Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi
IBM International Business Machines- Uluslararası İş Makineleri
AB Avrupa Birliği
PE Pre-converted Extract- Önceden dönüştürülmüş Ekstrakt
POS Pozitif
yy yüzyıl
YGC Yeast Extract Glucose Chloramphenicol
BPA Baird Parker Agar
SPSS Statistical Package for the Social Sciences- Sosyal Bilimler için İstatistik Programı
PCA Plant Count Agar
MRS de MAN ROGOSA SHARPE
EC European Commission
PDCAAS Protein Sindirilebilirliği Düzeltilmiş Amino Asit Skoru
TS Türk Standartları Enstitüsü
TE Tespit Edilmedi
MDA Malondialdehit
M Molar çözelti
TCA Triklor Asetik Asit
SF Seyreltme Faktörü
TBARS Tiyobarbiturik Asit Reaktif Madde
MDA Malodialdehit
DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl TAMB Toplam Aerob Mezofil Bakteri LAB Laktik Asit Bakterisi
abs absorbans değeri
NA Nitrit Azaltılmış
rRNA ribozamal Ribonükleik Asit
UV Ultra Viyole ışın
GC/MS Gaz Kromotografisi/Kütle Kromotografisi DSL D-sakarik asit-1,4-lakton
SCOBY Simbiyotik Bakteri ve Maya Kültürü IARC Uluslararası Kanser Ajansı
ix
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Fermente sosislerde görülen biyokimyasal değişimler ... 5
Şekil 2.2 Sucuklarda fermentasyon sırasında renk oluşum mekanizması ... 9
Şekil 2.3 Kombucha yararlı bileşikleri... 18
Şekil 4.1 Başlangıç sucuk hamurlarının ve sucukların kimyasal bileşimi ... 33
Şekil 4.2 Kombucha ilavesinin sucukların tuz içeriğine etkisi ... 35
Şekil 4.3 Kombucha ilavesinin sucukların su aktivitesi değerleri üzerine etkisi ... 37
Şekil 4.4 Kombucha ilavesinin sucukların pH değeri üzerine etkisi ... 38
Şekil 4.5 Kombucha ilavesinin sucukların titrasyon asitliği (% laktik asit) değeri üzerine etkisi ... 41
Şekil 4.6 Kombucha ilavesinin sucukların kalıntı nitrit içerikleri (ppm) üzerine etkisi ... 43
Şekil 4.7 Kombucha ilavesinin sucuk hamurunda CIE açıklık-koyuluk (L*), kırmızılık (a*) ve sarılık (b*) değerleri üzerine etkisi ... 45
Şekil 4.8 Kombucha ilavesinin sucukların nitrozohemokrom değerleri (ppm) üzerine etkisi ... 47
Şekil 4.9 Kombucha ilavesinin sucukların TBARS değerleri (mg MDA/kg) üzerine etkisi ... 49
x
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1 Geleneksel ve endüstriyel fermente gıda ürünleri arasındaki temel farklar ... 6 Çizelge 3.1 Sucuk gruplarına ait formülasyonlar (g/2kg et) ... 22 Çizelge 3.2 Sucuk fermentasyon ve kurutma aşamaları olgunlaştırma kabin
koşulları ... 23 Çizelge 4.1 Hamur ve sucuklara ait kimyasal bileşim sonuçları (%) ... 32 Çizelge 4.2 Kombucha ilavesinin sucukların tuz içeriğine etkisi ... 35 Çizelge 4.3 Kombucha ilavesinin sucukların su aktivitesi değerleri üzerine
etkisi ... 36 Çizelge 4.4 Kombucha ilavesinin sucukların pH değeri üzerine etkisi ... 38 Çizelge 4.5 Kombucha ilavesinin sucukların titrasyon asitliği (% laktik asit)
değeri üzerine etkisi ... 40 Çizelge 4.6 Kombucha ilavesinin sucukların kalıntı nitrit içerikleri (ppm)
üzerine etkisi ... 42 Çizelge 4.7 Kombucha ilavesinin sucukların CIE açıklık-koyuluk (L*),
kırmızılık (a*) ve sarılık (b*) değerleri üzerine etkis ... 44 Çizelge 4.8 Kombucha ilavesinin sucukların nitrozohemokrom değerleri (ppm)
üzerine etkisi ... 47 Çizelge 4.9 Kombucha ilavesinin sucukların TBARS değerleri (mg MDA/kg)
üzerine etkisi ... 49 Çizelge 4.10 Kombucha ilavesinin sucukların TAMB, LAB, mikrokok-stafilokok
ve maya ve küf sayıları (log kob/g) üzerine etkisi ... 51 Çizelge 4.11 Kombucha ilavesinin sucukların görünüş, renk, koku, lezzet, tekstür
ve genel beğeni özellikleri üzerine etkisi ... 54
1 1. GİRİŞ
Geçmişten günümüze ilerleyen teknolojik gelişmelerin de etkisiyle insan sağlığının korunmasında gıdaların önemi giderek artmaktadır. Asırlardan beri insanoğlunun temel gıda maddeleri içinde baş sıralarda yer alan et ve et ürünleri, içerdikleri elzem amino asitleri nedeniyle günlük diyette büyüme ve gelişme için temel fonksiyonların yerine getirilmesinde önemli olan yüksek biyolojik değere sahip proteinlerin, ayrıca demir, selenyum ve çinko gibi mikroelementlerin ve B grubu vitaminlerin iyi bir kaynağıdırlar (Pereira and Vicente 2013).
Taze et herhangi bir işlem uygulanmadığında raf ömrü oldukça kısadır. Bu nedenle, tarih boyunca, taze etin temin edilemediği zamanlarda tüketimini sağlamak amacıyla, kurutma, tuzlama, fermentasyon gibi işlemler uygulanmış ve bu işlemler sonunda farklı hammadde ve ingrediyenlerle birlikte yüzlerce et ürünü ortaya çıkmıştır. Bu ürünler içinde tüm dünyada çeşitli şekillerde üretilen fermente sosisler birçok ülkede beğeniyle tüketilen et ürünleridir (Corral vd. 2013, Marco vd. 2008). Ülkemizde geleneksel et ürünleri içinde başta gelen sucuk da uluslararası sınıflandırmada fermente sosis olarak değerlendirilmektedir. Diğer fermente sosislerde olduğu gibi sucukta da gerek istenmeyen mikrobiyal gelişimin ve biyokimyasal reaksiyonların kontrol altına alınması, gerekse renk, yapı, lezzet gibi fiziksel ve duyusal özelliklerin tedarik zinciri boyunca muhafaza edilmesi için farklı kimyasal katkı maddelerinin kullanılması kaçınılmazdır (Olesen vd. 2004).
Sucukta kullanılan katkı maddeleri içinde nitrit ve nitratlar üretim gereği mikrobiyal gelişimin önlenmesi, arzu edilen tipik pembe-kırmızı rengin oluşumu ve stabilizasyonu için kullanılması zorunlu olan bileşiklerdir ve et ürünlerine sodyum veya potasyum tuzları olarak ilave edilmektedir. Önce FAO/WHO Gıda Katkı Maddeleri Uzman Komitesi (JECFA) ve Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) tarafından değerlendirilmesi yapılmış olan sodyum (E250) ve potasyum (E249) nitrit; Avrupa Birliği Gıda Katkı Maddeleri 1333/2008 sayılı Yönetmeliğinin Ek II'sine (Annex II to Regulation (EC) No 1333/2008) göre gıda katkı maddeleri olarak yeniden onaylanmıştır (John Wiley and Sons Ltd. 2017).
2
Nitrit ve nitrat kullanımına sınırlandırma getirilmesinin nedeni, kanserojenik özellikte nitrozamin oluşturmalarıdır. Uluslararası Kanser Ajansı (IARC) 2010 yılında nitritin mide, karaciğer ve kolon kanserine sebep olması nedeniyle 2A sınıfı muhtemel kanserojen maddeler arasında olduğunu ilan etmiştir (Anonymous 2010). Kanserojen oldukları bilindiği halde dünyada belli sınırlar içinde kullanımına izin verilen nitrit/nitratların kullanımının belirli bir tüketim seviyesinde tutulmasının gerekliliği göz önünde bulundurularak bu değer çeşitli standartlar tarafından sınırlandırılmıştır.
Günümüzde, tüketicilerin daha güvenli ve sağlıklı ürünlere yönelme isteği, toksisitesi nedeniyle et ürünleri üretiminde kullanımı bu ürünlere sağlık açısından olumsuz bir imaj yükleyen nitrit ve nitratı azaltma çalışmalarının artmasına neden olmuştur. Bu amaçla, alternatif doğal katkı maddelerinin ikamesi son yıllarda üzerinde önemle durulan konuların başında gelmektedir (Jung vd. 2015, Slima vd. 2017). Nitrat içeriği yüksek kereviz, ıspanak vb. sebzelerin tozları, çeşitli biyoaktif bileşikler gibi doğal alternatifler üzerinde çalışmalar yapılmakta, hatta nitrit alternatifi doğal katkı maddelerinin endüstriyel uygulamalarda kullanımı da yaygınlaşmaktadır (Alahakoon vd. 2015).
Bu hususta Kombucha mantarı, doğal fermente bir ürün olması ve sağlık açısından içerdiği birçok olumlu özelliğinden dolayı bu çalışmanın temelini oluşturmaktadır.
Kombucha mantarı daha çok çay olarak tüketilen, içeriğinde asetik asit bakterileri ve ozmofilik mayaların ortama hakim olduğu, hafif ekşimsi-tatlı lezzete sahip, fermente içecek olarak adlandırılan bir üründür (Malbaša vd. 2008, Jayabalan vd. 2014).
Kombucha yüzeyinde selülozik bir tabaka ve sıvı kısımdan oluşan iki tabaka mevcuttur (Jayabalan vd. 2014). Yüzeydeki selülozik tabakayı oluşturan Simbiyotik Bakteri ve Maya Kültürü (SCOBY) olarak adlandırılan bu mikroorganizma topluluğunun biyofilmleri, görünümü itibariyle mantar yüzeyine benzediği için Kombucha mantarı şeklinde de ifade edilmektedir (Leal vd. 2018).
3
Genellikle siyah çay ile özdeştirilmekle beraber, üretimde yeşil ve beyaz çayın da kullanılabildiği Kombucha’nın antimikrobiyal, antioksidan, hepatoprotektif ve antikanserojenik etkisine üretimde kullanılan çay türü de farklı şekillerde katkıda bulunmaktadır (Jayabalan vd. 2008, Jayabalan vd. 2014, Nguyen vd. 2015, Anonim 2019a). Malbaša vd. (2011) antioksidan aktivitesi yüksek Kombucha çayının, çeşitli kanser türlerine, kardiyovasküler ve serebrovasküler hastalıklara karşı etkili olduğunu ve özellikle detoksifiye edici etkisi yüksek olan glukuronik asit içeriğinden dolayı karaciğer fonksiyonlarını düzenlediğini bildirmişlerdir.
Kombucha çayı üzerine gerçekleştirilen bir çalışmada, içeriğindeki Acetobacter nitrogenifigens RG1T’nin azot bağlayıcı etki gösterdiği belirlenmiştir (Dutta ve Gachhui 2006). Ayrıca, Kombucha içeriğinde yer alan Gluconacetobacter kombuchae RG3T de diğer bir azot bağlayıcı bakteridir (Dutta ve Gachhui 2007). Azot bağlayıcı etkileri olan bu bakterileri bünyesinde bulunduran Kombucha çayının bu özelliğinden dolayı et ürünlerinde nitrit alternatifi olarak kullanım potansiyeline sahip olduğu fikri gündeme gelmiştir. Vossen (2014) sentetik nitrit içeriği azaltılarak farklı oranlarda Kombucha ekstraktı ilavesinin ciğer ezmelerinde kalıntı nitrit miktarını azalttığını bildirmiştir.
Diğer bir çalışmada ise Kombucha ekstraktı bazlı doğal ekstraktlar kullanılarak yüksek besin değerine sahip ve kimyasal katkı maddesi, özellikle de nitrit içermeyen güvenli ürünler elde edilebileceği belirtilmiştir (Bordea vd. 2017).
Bu çalışmada, sucuklarda bulunan nitrit oranının azaltılmasında kimyasal nitrite alternatif olarak, biyolojik aktivitesi yüksek doğal bir ekstrakt olan Kombucha ekstraktı kullanılarak ürün kalite özelliklerine etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Böylece, hem üründe kalıntı nitrit içeriği azaltılmış hem de Kombucha ekstraktının antimikrobiyal etkisinden ve biyoaktif özelliklerinden dolayı güvenli, sağlık açısından faydalı fonksiyonel bir ürün üretimi hedeflenmiştir.
4
2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ÖZETLERİ
2.1 Geleneksel Bir Et Ürünü Olarak Sucuk
Dünya’da farklı şekillerde üretimi gerçekleştirilen ve çeşitli isimlerle adlandırılan sucuk ülkemizde geçmişten günümüze en çok tüketilen et ürünleri arasında yer almaktadır (Toptancı ve Ercoşkun 2017). Sucuk Türk Gıda Kodeksi Et, Hazırlanmış Et Karışımları ve Et Ürünleri Tebliği’ne göre tanım itibariyle ‘Büyükbaş ve/veya küçükbaş hayvan karkas etlerinin ve yağlarının kıyılarak lezzet vericiler ile karıştırıldıktan sonra doğal veya yapay kılıflara doldurularak belirli koşullarda fermentasyon ve kurutma işlemleri uygulanarak kesit yüzeyi mozaik görünümünde olan ısıl işlem uygulanmamış fermente et ürününü ifade eder’ şeklindedir (Anonim 2019b).
Sucuk üretiminde önemli noktalardan biri kullanılan etin kalite özellikleridir. Bu amaçla iyi kalitede sucuk üretimi için kullanılacak etin miyoglobin içeriğinin yüksek, mikrobiyal kontrolünün sağlanmış olması ve pH değerinin 5.4-5.8 aralığında olması gerekmektedir (İpek 2019). Fermentasyon genel olarak et ürünlerin korunması ve kalitesinin sağlanması açısından uygulanan geleneksel bir yöntemdir (Kolsarıcı 2005).
Fermentasyon sırasında üründe meydana gelen değişimler sucuğun karakteristik fonksiyonel ve duyusal özelliklerinin oluşmasına neden olur ve sonuçta mikrobiyal açıdan koruma sağlanır (Kumar vd. 2017).
Fermente et ürünleri üretiminde günümüzde standart ürün elde edilebilmesi için starter kültürlerin kullanılması kaçınılmazdır. Starter kültürler; sucuk üretimi sırasında hem fermentasyonun gerçekleşmesinde etkilidirler hem de fermentasyon işlemi süresince ortamda gelişen istenmeyen mikroorganizmalar üzerinde inhibe edici etki gösterirler.
(Franciosa vd. 2018, Candogan and Acton 2004). Sucuk üretiminde kullanılan starter kültürlerin başında laktik asit bakterileri gelmektedir (Hammes and Knauf 1994).
Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus ve Lactobacillus plantarum genellikle et ve et ürünlerinde kullanılan başlıca laktik asit bakterileridir (Hugas vd. 1993, Kittisakulnam vd. 2017, Pisacane vd. 2015). Laktik asit bakterileri, ürettikleri laktik asit
5
ile pH değerini düşürerek antimikrobiyal bir etki oluştururlar. Bu şekilde starter kültür olarak kullanılan laktik asit bakterileri hem patojenik hem de bozulma yapan mikroorganizmaları inhibe ederek ürünün güvenliğini sağlarlar ve sucuklarda renk ve lezzet gelişimine katkıda bulunurlar (Cenci-Goga vd. 2008, Cenci-Goga vd. 2012). Et ürünlerinde kullanılan diğer bir grup starter kültür ise koagülaz negatif stafilokoklardır.
Stafilokoklar içinde Staphylococcus carnosus ve Staphylocuccus xylosus fermente sosislerde renk oluşumunda, lezzet gelişiminde etkili starter kültürlerdir (Candogan vd.
2008). Ayrıca antioksidan etki de gösterirler. Proteolitik etkiye sahip laktik asit bakterileri, ayrıca, serbest amino asitlerin oluşumuna neden olurlar. Bu serbest amino asitleri uçucu ve uçucu olmayan lezzet bileşenlerinin öncü maddeleri olarak görev yaparlar (Søndergaard ve Stahnke 2002, Yalınkılıç ve Kaya 2012). Fermente sosislerde meydana gelen biyokimyasal değişimler ve mikroorganizmaların etkisi şekil 2.1’de özetlenmiştir.
Lactobacillus Pediococcus Kocuria Staphylococcus
L.sakei P.pentosaceus K.varians S.xylosus
L.curvatus P.acidilactici K.kristinae S.simulans
L.plantarum S.carnosus
Protein Karbonhidrat pH =6.0 Mikrobiyal NO3 Kataliz Yağ aktivite
Peptit Pürivik asit pH= 5.0-4.8 Bakteriyosin NO2 Peroksit Yağ üretimi azalması asidi
Serbest Laktik asit Proteinlerin NO Acılaşmanın Oksidasyon
aminoasit pıhtılaşması önlenmesi
LEZZET TEKSTÜR RAF ÖMRÜ RENK LEZZET
Şekil 2.1 Fermente sosislerde görülen biyokimyasal değişimler (Franciosa vd. 2018)
6
Fermente sosisler dünya genelinde geleneksel ürünler olarak üretilirler ve bu tür fermente ürünler üretildikleri bölgeye özgü spesifik bir mikrobiyotaya sahiptirler (Franciosa vd. 2018). Ürüne özgü bu özelliklerin oluşmasında, herhangi bir bölge veya bölgeye ait "tipik" ürünler, o bölgeye bağlı olan yerel malzemeler ve özel üretim tekniklerinin bir arada kullanılması etkili olmaktadır (Aquilanti vd. 2007, Casaburi vd.
2007). Bu açıdan geleneksel ve endüstriyel fermente ürünlerin karşılaştırılması çizelge 2.1’de verilmiştir.
Çizelge 2.1 Geleneksel ve endüstriyel fermente gıda ürünleri arasındaki temel farklar (Franciosa vd. 2018)
Geleneksel fermente ürünler Endüstriyel fermente ürünler
Küçük ölçekli Büyük ölçekli
Manuel Otomatik
Yoğun zaman gereksimi Zamana duyarlı
Olası kontaminasyona maruz kalma Minimum düzeyde maruz kalma
Değişken kalite Sabit kalite
Kompleks duyusal özellikler Daha az kompleks duyusal özellikler
Daha kısa raf ömrü Daha uzun raf ömrü
Geniş belirsiz mikrobiyal çeşitlilik Azaltılmış mikrobiyal çeşitlilik
Günümüzde geleneksel olarak üretilen fermente sucukların yanında endüstriyel ölçekte ısıl işlem görmüş sucuklar üretim prosesindeki farklılık sebebiyle diğer bir sucuk çeşididir. Türk Gıda Kodeksi Et, Hazırlanmış Et Karışımları ve Et Ürünleri Tebliği’ne göre ısıl işlem görmüş sucuk “Büyükbaş ve/veya küçükbaş hayvan karkas etlerinin ve yağlarının veya kanatlı hayvan karkas etleri ve yağlarının kıyılarak lezzet vericiler ile karıştırıldıktan sonra doğal veya yapay kılıflara doldurularak belirli koşullarda fermentasyon ve kurutma işlemleri uygulanarak kesit yüzeyi mozaik görünümünde olan ısıl işlem uygulanmış et ürününü ifade eder” şeklinde tanımlanmaktadır (Anonim 2019b). Isıl işlem görmüş sucuklara uygulanan pastörizasyon işlemi; sucuklarda bulunabilecek istenmeyen mikrobiyal yükün azaltılmasını ve sucukların raf ömürlerinin
7
uzatılmasını sağlar. Merkez sıcaklığı 65-75oC olarak ayarlanan pastörizasyon işleminde sıcaklığın daha yüksek bir değere ulaşmasıyla sucukların yapısında ve lezzetinde değişimlerin gözlenebildiği aynı zamanda sıcaklığın etkisiyle ürünün yapısında proteinlerin denatüre olması ve enzimleri inaktif hale getirmesi açısından kontrolün daha etkin bir proses yardımıyla sağlanması gerekmektedir (Dalmış 2007, Soyer 2005).
Üretim koşullarının hem fermente sucuk hem de ısıl işlem sucukta sağlanması ve son ürün kontrollerin yapılması açısından referans olarak Türk Gıda Kodeksi Et, Hazırlanmış Et Karışımları ve Et Ürünleri Tebliği’ne göre üretilen son üründe bazı maksimum sınır değerleri belirlenmiştir (Anonim 2019b). Sucuk için bu değerler:
toplam et proteini değeri kütlece en az %16, toplam et proteinindeki kolajen bağ doku proteini oranı en fazla %20, nem miktarının toplam et proteinine oranı 2.5’in altında, yağ miktarının toplam et proteinine oranı 2.5’in altında ve pH değeri en yüksek 5.4 olmalıdır. Isıl işlem görmüş sucukta ise: toplam et proteini değeri kütlece en az %14, toplam et proteinindeki kolajen bağ doku proteini oranı en fazla %25, nem miktarının toplam et proteinine oranı 3,6’nın altında, yağ miktarının toplam et proteinine oranı 2.5’in altında ve pH değeri en yüksek 5.6 olarak belirtilmiştir (Anonim 2019b).
Türk Standartları Enstitüsü TS 1070’e göre sucukta nem oranı en fazla %40, tuz en fazla %5, inorganik boya bulunmamalı, pH değeri 5.4 ile 5.8 arasında, yağ oranları ise;
birinci kalite sucuklar için maksimum %30, ikinci kalite sucuklar için maksimum %40 ve üçüncü kalite sucuklar için ise maksimum %50 olmalıdır. Protein oranları ise birinci kalite sucuklar için minumum %22, ikinci ve üçüncü kalite sucuklar için minumum
%20, kokuşma testleri negatif, iç organ bulunmamalı ve bağ dokusu oranı aşırı yüksek olmamalıdır. Tek tırnaklı hayvan eti veya diğer yabancı tür hayvan eti bulunmamalı, çeşitli patojen mikroorganizma ve E.coli bulunmamalı, toksikolojik muayene negatif sonuç vermelidir şeklinde ifade edilmektedir (Anonim 1997).
Sucuk üretiminde kaliteyi etkileyen faktörlerden hammadde ve starter kültür özellikleri yanında bir diğer önemli nokta ise kullanılan katkı maddeleridir. Türk Gıda Kodeksi
8
Gıda Katkı Maddeleri Yönetmeliği’ne göre katkı maddeleri “Besleyici değeri olsun veya olmasın, tek başına gıda olarak tüketilmeyen ve gıdanın karakteristik bileşeni olarak kullanılmayan, teknolojik bir amaç doğrultusunda üretim, muamele, işleme, hazırlama, ambalajlama, taşıma veya depolama aşamalarında gıdaya ilave edilmesi sonucu kendisinin ya da yan ürünlerinin, doğrudan ya da dolaylı olarak o gıdanın bileşeni olması beklenen maddeleri ifade eder” şeklinde tanımlanmıştır (Anonim 2013).
Sucuk üretiminde bazı katkı maddeleri, yapının korunması, istenmeyen mikrobiyal gelişimin kontrol altına alınması amacıyla belirli oranlarda ilave edilmektedir (Lücke 2000).
Sucuk üretiminde kullanılan bazı katkı maddeleri antimikrobiyal etki oluşturması amacıyla katılmaktadır. Bu katkı maddeleri arasında sorbik asit ve sorbik asidin Na, Ca ve K tuzları, benzoik asit, sodyum benzoat ve asetik asit olarak sıralanabilmektedir. Tuz ve şeker ise dolaylı yoldan antimikrobiyal etki göstermektedir. Şekerin fonksiyonu sucukta asitliği artırması ve sucuğun su aktivitesini düşürerek ozmotik basıncı değiştirmesi şeklinde açıklanmaktadır (Cosansu vd. 2010, Bozkurt 2002).
Sucuk üretiminde kür pigment renginin gelişiminde askorbik asitin en etkili katkı maddelerinden olduğu ve güçlü bir indirgeme ajanı olduğu ifade edilmektedir. Sucukta gerçekleştirdiği mekanizması ise NO2 den NO oluşturması şeklindedir (Bozkurt 2002).
C6H806 + 2 HNO2 C6H6O6 + NO + 2H2O Askorbik asit Dehidroaskorbik asit
Ette bulunan miyoglobin, etin renginden sorumlu sarkoplazmik bir protein olup renk işlevini miyoglobin pigmentinde yer alan heme grubunun görünür ışığı absorbe etme yeteneği sayesinde gerçekleştirmektedir. Heme gruplarının demir iyonu içermesi ve indirgenmiş form olan ferro (Fe+2) yapısında ya da oksitlenmiş form olan ferrik (Fe+3) yapısında olabileceği de ifade edilmektedir (Suman and Joseph 2013).
9
Sucuklarda meydana gelen fermentasyon sırasında renk oluşum mekanizması şekil 2.2’
de verilmiştir.
NH3 N2O N2
Nitrat redüktaz Nitrit redüktaz NO3
-
NO2
-
NO Miyoglobin (Fe2+)
Metmiyoglobin (Fe3+)
NO Metmiyoglobin (Fe3+) -SH
Askorbik asit NO Miyoglobin (Fe2+)
Şekil 2.2 Sucuklarda fermentasyon sırasında renk oluşum mekanizması (Ordóñez vd.
1999)
Demir iyonun hem indirgenmesi hem yükseltgenmesi taze et pigmentinin farklı formlarda olmasını sağlamaktadır. Bu formlar; deoksimiyoglobin (DeoxyMb), oksimoglobin (OxyMb), karboksimiyoglobin (COMb) ve metmiyoglobin (MetMb) olup demir iyonunun altıncı bağına bağlanan molekülün bu oluşumu etkilediği bildirilmektedir (Mancini and Hunt 2005).
Nitritin miyoglobin ile olan reaksiyonu sayesinde kürlenmiş etlerin pembe renginin oluştuğu ifade edilmektedir ve etlerin kürlenmesi esnasında nitrit, su ile temas ettiğinde oluşan nitröz asit Mb ile reaksiyona girerek MetMb’ne okside etmektedir. Nitröz asit
10
MetMb ile NO bağlantısını sağlayarak oluşan NO-MetMb anaerobik ortamda nitrosil- Mb'ye (kırmızı renk) indirgendiği, nitrosil-Mb, ısı ile temas ettikten sonra denatüre olup pembe bir pigment olan nitrosil hemokromuna dönüştüğü ifade edilmektedir (Mancini and Hunt 2005, Alahakoon vd. 2015).
Sucuklarda kullanılan en önemli katkı maddeleri arasında yer alan nitrit ve nitrat tuzlarının fonksiyonları kırmızı-pembe kürlenmiş et renginin, arzu edilen lezzetin oluşması, antioksidan özelliği sayesinde ransit tadın oluşmasının önlemesi, antimikrobiyal etkisi nedeniyle tuz ile birlikte Clostridium botulinum gelişimini engellemesidir (Bozkurt 2002). Sucuk üretiminde kullanılan nitrit, bu tür fonksiyonlara sahip olmasının yanında kanserojen olması sebebiyle bazı endişeleri de beraberinde getirmektedir (Cassens 1997, Sen 1997). Bu tür endişeleri azaltmak amacıyla yeni yöntemlerin geliştirilmekte ve daha doğal kaynakların kullanılması yönünde çalışmalar yapılmaktadır (Alahakoon vd. 2015).
Bu doğrultuda yapılan araştırmalar incelendiğinde bazı durumlarda 2500 mg/kg'dan fazla nitrat içeren kereviz, ıspanak, turp ve marul gibi sebzelerin doğal nitrat kaynağı olarak kullanılabileceği bildirilmektedir (Santamaria 2006). Bu sebzelerin arasında daha çok kerevizin kullanıldığı ve et ürünlerine herhangi bir şekilde kötü lezzet oluşturmadığı da ifade edilmektedir (Sebranek ve Bacus 2007).
Sucuk üretiminde nitrit kullanımına alternatif olarak pancar tozu kullanılan bir çalışmada 150 mg/kg sodyum nitrit; 100 mg/kg sodyum nitrit + %0.12 pancar tozu; 50 mg/kg sodyum nitrit + %0.24 pancar tozu ve %0.35 pancar tozu ilavesi ile dört farklı sucuk formülasyonu oluşturulmuştur. Üretilen sucuklar içinde en yüksek kalıntı nitrit içeriği 20.12 mg/kg ile kontrol örneğinde gözlenmiş, depolama boyunca kalıntı nitrit içeriğinin azaldığı belirtilmiştir (Sucu and Turp 2018).
11
Doğal katkı maddelerinin et ve et ürünlerinde nitrit kullanımına alternatif diğer bir çalışma da pırasa unu üzerinedir. Yapılan bu çalışmada dondurularak kurutulmuş pırasa tozu (FDLP) ilave edilerek 6 grup oluşturmuşlardır; %0.84+0 mg/kg NaNO2, %0.84+75 mg/kg NaNO2, %0.84+150 mg/kg NaNO2 ve %1.68+0 mg/kg NaNO3, %1.68+75 mg/kg NaNO3, %1.68+150 mg/kg NaNO3. Kontrol grubu olarak ise 150 mg/kg NaN02
içeren sucuk grubu da oluşturularak analizler sonucunda FDLP'li sucukların kontrolden daha koyu ve sarılık değerinin yüksek olduğunu bildirmişlerdir. 75 ve 150 mg/kg NaN02 sodyum nitrit ilaveli sucuklarda TBARS değeri, renk değerleri, tekstür parametreleri, lezzet ve genel kabul edilebilirlik bakımından hiçbir fark bulunmadığı belirtilmiştir. Sonuç olarak %0.84 FDLP ve 75 mg/kg NaNO2 kullanılarak üretilmiş fermente sucukların ilave nitritte %50 azalma sağlaması açısından en uygun değer olduğu ifade edilmiştir (Tsoukalas vd. 2011).
Ispanak ile yapılan bir çalışmada ise doğal nitrit ve sentetik nitritin kürlenmiş domuz filetosuna etkileri incelenmiştir. Bu amaçla 6 grup hazırlanmış: kontrol (-): Hiçbir nitrit ilavesi yapılmamış, kontrol (+): %0.08 w/v sodyum nitrit çözeltisi ile muamele edilmiş, T1: %0.04 w/v oranında fermente ıspanak suyu ve %0.04 w/v sodyum nitrit çözeltisi, T2: %0.04 w/v sodyum nitrit çözeltisi içerisinde ıspanak suyu, T3: %0.04 w/v oranında sodyum nitrit içermeyen fermente ıspanak suyu ve son olarak da T4: sodyum nitrit içermeyen ıspanak suyu domuz filetolarına uygulanmıştır. Kontrol (+), T1 ve T3'te eklenen nitrit içerikleri aynı olmasına rağmen, Kontrol (+) örneklerinin en yüksek kalıntı nitrit içeriği gösterdiği bildirilmiştir. Doğal nitrit kaynağı ile muamele edilen örneklerin ise daha düşük kalıntı nitrit içerdiğini ve daha düşük kalıntı nitrit içeriklerine sahip et ürünleri üretmek amacıyla doğal nitrit kaynaklarının kullanılabileceği ifade edilmiştir (Kim vd. 2019).
Bir başka araştırmada, portakal liflerinin sucuklarda kullanımı ile hem antioksidan özellik kazandırılarak sucuklarda oluşabilecek oksidasyon engellenmiş hem de kalıntı nitrit seviyesinde azalmalar gözlemlenmiştir. Bu çalışmaya göre kuru kürlenmiş sosislere 0, 5, 10, 15 ve 20 g/kg düzeyinde portakal lifi ilave edilmiştir. Örneklerde portakal liflerin sucuklara ilavesiyle nitrit miktarında önemli düzeyde düşüşün olduğu,
12
portakal liflerinin bu etkisini içeriğinde bulunan en önemli fenolik bileşenin hesperidin olduğu ve bu etkiyi nitrozaminlerin oluşumunu engelleyerek gerçekleştirdiği bildirilmiştir (Ferna´ndez-Lopez vd. 2007).
Et ürünlerinde kullanılan nitrite alternatif başka yöntemlerin araştırıldığı bir başka araştırmada (Alirezalu vd. 2019), nisin (200 ve 400 ppm), ε-polilisin (%0.1 ve %0.2) ve kitosan (%0.5 ve %1); yeşil çay, ısırgan otu ve zeytin yaprağı özleri ile ekstrakte edilmiş karışım, nitrit içermeyen frankfurter tip sosislere ilave edilmiş; fizikokimyasal ve mikrobiyolojik özellikleri, yağ asidi kompozisyonu ve duyusal özellikleri bakımından 45 günlük depolama süresince incelenmiştir. Kontrol grubuna göre en düşük Tiyobarbiturik Asit Reaktif Madde değeri (TBARS) ve toplam uçucu azot (TVN) değeri %1 kitosan ilave edilen sosislerde gözlenmiştir. Aynı zamanda frankfurter tip sosislerinin toplam doymuş, tekli doymamış ve çoklu doymamış yağ asitleri (SFA, MUFA ve PUFA), doğal antioksidanlar ve antimikrobiyal bileşiklerin açısından büyük ölçüde etkilenmediği bildirilmiştir. %0.2 ε-polilisin ve %1 kitosan ile hazırlanmış sosislerde nitrit içermeyen frankfurter tip sosislerin raf ömrünü uzatmakta etkili olduğu ve bu nedenle, bu kombinasyonların frankfurter tipi sosislerde nitrit yerine kullanılabilmesi açısından olumlu sonuçların elde edildiği belirtilmiştir (Alirezalu vd.
2019).
Kitosan kullanılarak yapılan diğer bir çalışmada belirli oranlarda (%0.011; %0.016 ve
%0.0212) sodyum nitrit ve %0.25 ve %0.5 oranlarında kitosan kullanılarak domuz sosisi üretilmiş ve raf ömrünü süresince 4°C'de depolamada fizikokimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal açıdan incelenmiştir. Kitosan kullanımının üründe duyusal özellikleri etkilemediği, nitrit miktarını azaltmada etkili olduğu ve sucukların raf ömrünü artırdığı bildirilmiştir (García vd. 2011).
Nitrit düzeyinin azaltılmasıyla kullanılan organik asitlerin etkisinin araştırılması amacıyla karaciğer ezmesinde gerçekleştirilen bir çalışmada sodyum askorbat SA; 500, 750, 1000 mg/kg ve sodyum nitrit SN; 40, 80, 120 mg/kg ilave edilmiş; SN dozunun 80
13
mg/kg'a düşürülmesinin kırmızılık (a*) değeri ve lipit oksidasyonu (TBARS) üzerinde olumsuz bir etkisi olmadığı ifade edilmiştir. SN'nin 40 mg/kg'a düşürülmesinin düşük renk stabilitesine neden olduğu ve lipit oksidasyonunu artırdığı bildirilmiştir. Aynı zamanda düşük SN değerinde SA miktarının artırılmasıyla TBARS değerinde düşüş gözlenmiştir (Vossen vd. 2012).
Nitrit kullanımının azaltılması amacıyla çay yaprağının kullanıldığı bir çalışmada, farklı konsantrasyonlarda (75, 100 and 125 ppm) NaNO2 ve 300 mg/kg çay yaprağı ile kombine edilerek kuru kürlemiş sosislerde; TBARS, toplam uçucu baz azotu (TVBN), pH değeri, L*, a* ve b* değerleri ve kalıntı nitrit düzeyi, üretimden bir gün sonra ve 3- 5°C'de 10, 20 ve 30 günlük soğutma işleminden sonra incelenmiştir. Kalıntı nitrit miktarının üründe dondurma sırasında düştüğü, nitrit ile muamele edilmiş çay kateşinlerinin, ürün kalite özelliklerini olumlu yönde etkilemiş, aynı zamanda çay yaprağı ilave edilmiş sosislerde kırmızı rengin korunduğu ve TBARS değerinin daha düşük olduğu bildirilmiştir (Moawad vd. 2012).
Pişmiş sosislerde nitrit yerine doğal koruyucu kullanılmasının amaçlandığı bir çalışmada turp kullanılarak üretilen sosislerde 4 haftalık depolama süresince yaklaşık olarak %32 nitrit azalmasının gözlendiği bildirilmiştir. Aynı zamanda, renk açısından nitritli gruba yakın bir renk değeri elde edilmiş, lipit oksidasyonu geciktirilmiş ve 4°C' de Listeria monocytogenes ve 8°C'de Staphylococcus aureus'un gelişmesi önlenmiştir (Ko vd. 2017).
Nitrit kullanımına alternatif diğer yönem ise starter kültür kullanımıdır. Nitritin azaltılması amacıyla Lactobacillus sakei kullanılarak üretilen Çin fermente sosislerinde gıda kaynaklı patojen mikroorganizmaların fermentasyon boyunca gelişiminin inhibe edildiği, L. sakei fermente edilen sosislerde kalıntı nitrit içeriğinin 9.6 ppm, doğal fermente koşullarında üretilen sosislerde ise 32.1 ppm olduğu bildirilmiştir. Duyusal özellikleri açısından ise L. sakei ile fermente edilen sosisler tüketiciler tarafından daha fazla kabul görmüş ve patojen gelişimini inhibe etmiştir (Wang vd. 2013).
14
Nitrit yerine starter kültürlerin kullanıldığı benzer bir diğer çalışmada ise Lactobacillus fermentum RC4 and Lactobacillus plantarum B6 taze domuz etinde kullanılmıştır. Hiç nitrit kullanılmadan hazırlanan deneysel grup (EG), sadece tuz kullanılarak hazırlanan kontrol grubu (CG-S) ve hem tuz hem de nitrit kullanılarak hazırlanan (CG-N) toplam üç grup üründe 18-20°C’de 20 gün depolama sonucunda kalıntı nitrit miktarları sırasıyla 0.75 mg kg−1 ,1.85 mg kg−1 ve 4.67 mg kg−1 olarak tespit edilmiş ve en düşük kalıntı nitrit içeriğinin hiç nitrit kullanılmadan hazırlanan grupta bulunduğu ifade edilmiştir (Huang vd. 2020).
2.2 Nitrit Kullanımına Alternatif Ürün: Kombucha
Kombucha hafif ekşimsi-tatlı lezzete sahip, daha çok çay olarak tüketilen, fermente içecek olarak adlandırılan bir ürün olarak tanımlanmaktadır. Bir diğer tanıma göre:
Kombucha çayı, çay yapraklarının infüzyonu ile bakteri ve mayaların fermentasyonu yoluyla ‘çay mantarı’nı oluşturması ile elde edilen ürün olduğu bildirilmektedir (Jayabalan vd. 2014).
Kombucha’nın tarihi incelendiğinde M.Ö.220’e kadar uzandığı ve kökeni Mançurya'daki Tsin Hanedanlığına kadar yayıldığı, Uzak Doğu’dan ise ticaret yolları ile Rusya ve Doğu Avrupa’ya gittiği bildirilmektedir. II. Dünya Savaşı sırasında ise Batı Avrupa ve Kuzey Afrika'ya yayıldığı ve Avrupa’da daha çok kan ve sindirim sistemi üzerine detoksifiye etkisi nedeniyle tüketildiği ifade edilmiştir (Greenwalt vd. 2000).
Bir diğer ismiyle SCOBY olarak adlandırılan Kombucha çayının en temel özelliği asetik asit ve diğer organik asitler gibi bazı metabolitik ürünleri oluşturması, bu bileşiklerin antibakteriyel özellik göstermesi ve patojen bakteriler tarafından meydana gelebilecek kontaminasyonun engellenmesidir (Leal vd. 2018).
15
Kombucha üretiminde temel noktalardan biri içeriğinde bulunan mikroorganizmaların şekeri substrat kaynağı olarak kullanmasıdır. Genel olarak Kombucha, çay yapraklarının ilavesi, daha sonra karbon kaynağı şekerin ve takiben Kombucha kültürünün eklenmesi ile 7 ile 10 gün süresince fermentasyona bırakılmasıyla üretilmektedir (Grumezescu and Holban 2019). Kombucha çayı içeriğinde fermente sonrası asetik asit ve diğer organik asitler gibi bazı metabolitik ürünleri oluşmaktadır. Bu bileşikler antibakteriyel özellik göstermekte ve patojen bakteriler tarafından meydana gelebilecek kontaminasyonu engellemektedir (Leal vd. 2018). Oluşan metabolitlerin çeşitliliği fermentasyon koşullarına, kullanılan şeker ve çay miktarına, çay yaprağının çeşidine, iklime ve üretim sırasındaki hijyenik koşullara bağlı olarak değişiklik gösterir (Değirmencioğlu vd.
2019).
SCOBY içerisinde yer alan mayalar başlangıçta ortama eklenen sükrozu invertaz enzimleriyle metabolize ederek glukoz ve fruktoza çevirir. Üretilen glukoz ortamdaki asetik asit bakterileri tarafından glukonik aside dönüştürülürken, mayalar fruktozdan etanol ve CO2 oluşturur. Etanol, asit fermentasyonu ile ortamda bulunan oksijen ile asetik asit bakterileri sayesinde asetik asit ve suya okside olmaktadır. Böylece ortamın asiditesi artar ve diğer mikroorganizmaların gelişimi engellenmiş olur (Değirmencioğlu vd. 2019, Tran vd. 2020). Kombucha’nın fermentasyonu sonrasında asetik asit ve glukonik asit çeşitli asitlerin oluşması Kombucha’nın karakteristik ekşi lezzetine sahip olmasını sağlamaktadır (Villarreal‐ Soto vd. 2018).
Kombucha çayında yüzeyde selülozik bir tabaka ve sıvı kısımda oluşan 2 tabaka mevcuttur (Jayabalan vd. 2014). Yüzeydeki selülozik tabakayı oluşturan SCOBY olarak adlandırılan bu mikroorganizma topluluğunun biyofilmleri, görünümü itibariyle mantar yüzeyine benzediği için genellikle Kombucha mantarı olarak adlandırılmaktadır (Leal vd. 2018).
Bu mikroorganizma kültüründe: Komagataeibacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Gluconobacter oxydans, Gluconacetobacter hansenii, Oenococcus oeni, Komagataeibacter europaeus, Lactobacillus sp. gibi bakterilerin ve Saccharomyces sp.
16
Schizosaccharomyces pombe, Zygosaccharomyces kombuchaensis, Torulaspora delbrueckii, Brettanomyces sp. gibi mayaların olduğu belirtilmektedir (Villarreal-Soto vd. 2019).
Kombucha çayında bulunan mikroorganizmalar substrat kaynağı olarak şekeri kullanır.
Genel olarak Kombucha çayı bir litre kaynamış suya 5 gram çay yapraklarının ilave edilmesi daha sonra litre başına 50 gram substrat kaynağı şekerin eklenmesi ve 10 dk karıştırılması şeklinde üretilmektedir. İçerisine ilave edilen çay yaprakları süre sonunda süzülmekte, içerik oda sıcaklığında soğumaya bırakılmakta ve soğuma tamamlandıktan sonra önceden fermente edilmiş Kombucha kolonisinden ve sıvı kısımdan yaklaşık 100 mL ilave edildiği belirtilmektedir. Hazırlanan Kombucha içeriğinin üzeri temiz bir pamuklu bez ile örtülmekte ve 7 ile 10 gün süresince fermentasyona bırakılmaktadır (Greenwalt vd. 2000, Leal vd. 2018). Kullanılan çay yaprakları ise genel olarak siyah çay, yeşil çay ve oolong çay yapraklarıdır (Leal vd. 2018).
Kombucha’nın insan sağlığı üzerine etkisi ve kimyasal kompozisyonunda bu etkiyi sağlayan maddelerin tespiti amacıyla çeşitli çalışmalar yürütülmüştür. Bu bileşenler arasında asetik asit, glukonik ve glukuronik asit gibi organik asitler; sakaroz, glukoz ve fruktoz gibi şekerler; B1, B2, B6, B12 ve C vitamini gibi suda çözünür vitaminler;
ayrıca aminoasitler, biyojen aminler, pürinler, pigmentler, lipitler, proteinler, hidrolitik enzimler, etanol, asetik asit bakterileri ve laktik asit bakterileri, karbondioksit, polifenoller; manganez, demir, nikel, bakır, çinko, kobalt, krom ve kadmiyum gibi mineraller; florür, klorür, bromür, iyodür, nitrat, fosfat ve sülfat gibi anyonlar ve D- sakarik asit-1,4-lakton (DSL) içerdiği bildirilmektedir (Blanc 1996, Jayabalan vd. 2010, Jayabalan vd. 2014).
İçeriğinde bulunan Acetobacter cinsi bakterilerin etanolden asetik asit ürettiği ve bu işlemi, Krebs döngüsünde alkol dehidrojenaz ve aldehit dehidrojenaz enzimleri ile gerçekleştirdiği belirtilmiştir (Leal vd. 2018). Kombucha çayı üretiminde oluşan bileşenlerin gösterdiği olumlu etkiler şekil 2.3’te verilmiştir.
17
Kombucha üretimi esnasında oluşan bu bileşenlerin sağlık üzerine etkilerini açıklamak amacıyla yapılan araştırmalardan birinde Kombucha’nın kanser hücrelerinin çoğalmasını önleyici etkileri incelenmiştir (Leal vd. 2018). A549 akciğer kanser hücresi ve Hep-II epidermoid kanser hücreleri üzerine 12 gün boyunca fermente edilen yeşil çay ve siyah Kombucha çayları ayrı ayrı ilave edilmiş, yeşil çayın daha fazla sitotosik etki gösterdiği ve %50 inhibisyon etkisinin kanser hücreleri üzerine 200 ila 250 μg/mL oranında etkili olduğu ifade edilmiştir (Leal vd. 2018).
Kombucha’nın fermentasyon koşullarına bağlı olarak antikanser, anti-enflamatuvar ve antioksidan etkilerinin değişim gösterdiği, siyah çayın Kombucha ile fermentasyonunun biyoaktif potansiyeli artırdığı bildirilmiştir (Villarreal-Soto vd. 2019). Fermentasyon koşullarının Kombucha üzerine etkilerinin araştırıldığı bir diğer çalışmada beyaz, yeşil, oolong, siyah ve pu-erh çay yaprakları kullanılarak Kombucha çayı üretilmiş ve 21 gün fermentasyon süresi boyunca incelemeler yapılmıştır. Pu-erh çay yapraklarıyla üretilen kombucha çaylarının mikroorganizmalar üzerinde en fazla antibakteriyel etkiyi gösterdiği ifade edilmiştir (Değirmencioğlu vd. 2019).
18
Siyah çay
Yeşil çay Oolong çay + Şeker
Polifenoller
Detoksifikasyon
Antioksidan
Glukuronik asit
Detoksifikasyon
Fenolik taşınım
Antioksidanların taşınımı Vitaminler
B1,B2,B6,B12,C
Koenzimler
DSL
Detoksifikasyon
Antioksidan
β-glukuronidaz inhibasyonu Asetik asit
pH kontrolü
İstenmeyen mikrobiyal gelişmenin kontrolü
Mineraller
Organizma yapı bileşeni
pH ve ozmotik basınç dengesi
Metabolizma kofaktörü
Ethanol
Kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi
Şeker
Enerji kaynağı
Bakteri ve maya gelişimi
Şekil 2.3 Kombucha yararlı bileşikleri (Leal vd. 2018).
+
SCOBY
(Simbiyotik Bakteri ve Maya Kültürü)
Fermentasyon
19
Kombucha çayının insan sağlığına gösterdiği etkileri yanında taze meyveler üzerinde gösterdiği etkisinin incelendiği bir çalışmada (Zhou vd. 2019); üzümler hasat edildikten sonra 4oC’de depolanmaları sırasında hem meyve kalitesinin ölçülmesi hem de gösterdiği antioksidan aktivitesinin incelendiği ifade edilmiştir. Bu amaçla üzümler 15 dk boyunca Kombucha içerisine daldırılıp 4oC’de depolanarak, depolama süresi boyunca üzümün; iyi meyve oranı, meyve sertliği, askorbik asit (Vitamin C) ve malondialdehit (MDA) gibi fiziksel parametreleri ölçülerek Kombucha’nın üzüm meyvesinin çürümesini azalttığı, meyve sertliğinin ve C vitaminin azalmasını geciktirdiği, MDA birikimini engellediği bildirilmiştir.
Kıyma haline getirilmiş biftekler üzerine yapılan bir çalışmada ise kombucha çayı ilave edilmiş kitosan kaplı aktif ambalajlar %1–3 w/w oranında kaplanmıştır. İncelemeler sonucunda aktif ambalajın antioksidan aktivitesini artırdığı, ürünün 4 gün depolama sonucunda lipit oksidasyonunda gecikme olduğu ve mikrobiyal gelişimin de yavaşladığı belirtilmiştir (Ashrafi vd. 2018).
Et ve et ürünleri üzerine yapılan bir diğer araştırmada “salami” formülasyonunda Kombucha ekstraktı kullanımının ürün fiziksel, kimyasal ve mikrobiyolojik özellikleri üzerine etkisi incelenmiştir. Çalışmada kimyasal sodyum nitrit kullanımı yerine doğal bir ekstrakt olan Kombucha ekstraktının kullanılabileceği bildirilmiştir (Bordea vd.
2017).
Farklı oranlarda Kombucha ekstraktı (%10, %15, %20 ve %25) ile beslenen ördeklerin etinde yağ seviyelerinin azaldığı ve kolesterol seviyelerinde düşüş tespit edildiği bildirilmiştir (Adriani 2011).
Kombucha çayı ile nitrit azalması arasındaki ilişkinin incelendiği bir çalışmada gastrointestinal kanser ve diğer hastalıkların önlenmesi amacıyla bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, Kombucha çayı içerisine 100 ⁓ 1000 mg/L sodyum
20
nitrit ilave edilmiş ve 2 saat içerisinde 89.02 ⁓ 431.16 mg/L ‘e kadar parçalandığı ve 20 dakika içerisinde 5⁓200 mg/L sodyum nitritin, 52.3⁓376.1 mg/m3 NO oluşturabildiği bildirilmektedir. Çalışma sonucunda araştırmacılar tarafından Kombucha çayının nitrit miktarı üzerinde etkili bir azalmayı sağladığı ifade edilmektedir (Yi vd. 2009).
Sentetik nitrit yerine doğal katkıların kullanılması amaçlanan bir çalışmada ise ciğer ezmesi üzerine yapılan bir çalışma gerçekleştirilmiştir (Vossen 2014). Bu amaçla 20, 45 ve 90 mg nitrit/kg Kombucha ekstraktı içeren üç adet grup, hiç nitrit içermeyen grup ve 120 mg NaNO2 mg/kg pozitif kontrol grubu olmak üzere 5 gruba ayrılmış ve bu gruplara çeşitli analizler uygulanmıştır. Çalışma sonucunda 20 mg nitrit/kg Kombucha ekstraktı içeren grupta en düşük kalıntı nitrit seviyesi bulunmuştur. Aynı şekilde 45 mg nitrit/kg Kombucha ekstraktı içeren grubun düşük kalıntı nitrit oranına sahip olmasına rağmen renk stabilitesinin 20 mg nitrit/kg grubuna benzer şekilde sağladığı saptanmıştır.
Çalışma sonucunda renk özelliklerinde önemli bir değişim olmadan kalıntı nitrit seviyesinin düşürülebildiği, ancak nitritin protein karbonil mekanizmasına etkisi üzerine çalışmaların yapılması gerektiği belirtilmiştir (Vossen 2014).
Kombucha çayının özellikle azot üzerine gösterdiği etkinin incelendiği bir çalışmada Kombucha çayının yapısında Acetobacter nitrogenifigens RG1T bulunmuş, bu bakterinin nitrojen bağlayıcı özelliğe sahip olduğu bildirilmiştir (Dutta and Gachhui 2006).
Yapılan bu çalışmanın yanında diğer bir nitrojen bağlayıcı bakterinin Gluconacetobacter kombuchae RG3T olduğu ve bu bakterinin aynı zamanda selüloz üretebilen Gluconacetobacter cinsine ait bir bakteri olduğu 16S rRNA gen dizimi ile tespit edilmiştir (Dutta and Gachhui 2007).
21 3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1 Materyal
Sucuk üretiminde Et ve Süt Kurumu’ndan (Sincan Et Kombinası, Ankara) Angus ırkına ait 16-22 aylık sığırlardan elde edilen et kullanılmıştır. Sucuk üretiminde baharat olarak kullanılan tatlı toz biber, kimyon, acı toz biber, karabiber, yenibahar, karanfil (Bağdat Baharat, Ankara) ile tuz ve nitritli tuz da Et ve Süt Kurumu’ndan temin edilmiştir.
Starter kültür olarak ticari Pediococcus pentosaceus ve Staphylococcus carnosus (BFL- F02 BactoFlavor®, Chr. Hansen, Danimarka) karışımı ve üretilen sucukların dolumu için 34 mm çapında kolagen kılıf (Elit, Kocaeli) materyali kullanılmıştır. Sucuk formülasyonlarına ilave edilen Kombucha ekstraktı üretiminde kullanılan kültür Ankara piyasasından temin edilmiştir.
3.2 Kombucha Çayının Üretimi
Kombucha çayı üretiminde geleneksel yöntem kullanılmıştır. Kombucha kültürünün mikrobiyal açıdan kontaminasyonunun engellenmesi amacıyla kullanılan malzemeler kaynar su içinde 5 dk bekletilmiştir. Üretimde kullanılan 3 L içme suyu 5 dk kaynatıldıktan sonra (100oC), cam bir kavanoz içerisine 8 adet demlik poşet çay (Lipton A.Ş, İstanbul) ve 60 gram/L olacak şekilde sakkaroz ile birlikte ilave edilmiş ve steril bir spatül ardımıyla yaklaşık 30 sn karıştırılarak, 30 dakika demlenmeye bırakılmıştır. Demleme işleminden sonra kavanoz içerisindeki demlik poşet çaylar süzülmüş ve Kombucha kültürünün sıcaktan etkilenerek zarar görmesinin engellenmesi amacıyla karışım yaklaşık 25oC’ye soğutulmuştur. Daha sonra Kombucha kültürü ortama ilave edilmiş, cam kavanozun üzeri hava geçirgenliği olan temiz bir pamuklu bez ile örtülerek, oda sıcaklığında ve karanlıkta 15 gün süreyle fermentasyona bırakılmıştır. Fermentasyondan sonra sucuk üretiminde kullanılan Kombucha çayının pH değeri Orion Star™ A211 model pH metrede ölçülmüştür. Bu amaçla, 10 mL çay üzerine 100 mL destile su ilave edilerek manyetik karıştırıcıda sürekli karışması
22
sağlanmış ve çözeltinin pH değeri ölçülmüştür (Anonymous 2000). Sucuk üretiminde kullanılan Kombucha ekstraktının ortalama pH değeri 3.05±0.05 olarak bulunmuştur.
3.3 Sucuk Üretimi
Sucuk üretiminde dana döş-kaburga et karışımı (1:1, ağırlık/ağırlık) kullanılmıştır. Dana et karışımı (10 kg) 3 mm’lik aynadan kıyma çekilmiş ve her biri 2 kg olan farklı 5 gruba ayrılmıştır; 1: kontrol, 2: %5 kombucha çayı ilave edilen grup (5-KOM), 3: %10 kombucha çayı ilave edilen grup (10-KOM), 4: formülasyondaki nitrit düzeyi %50 oranında azaltılarak %5 kombucha çayı ilave edilen grup (5-KOM-NA), 5:
formülasyondaki nitrit düzeyi %50 oranında azaltılarak %10 kombucha çayı ilave edilen grup (10-KOM-NA). Her bir sucuk grubu çizelge 3.1’de ingrediyenler ve katkı maddeleri kullanılarak formüle edilmiştir.
Çizelge 3.1 Sucuk gruplarına ait formülasyonlar (g/2kg et)
Formülasyon KONTROL 5-KOM 10-KOM 5-KOM-NA 10-KOM-NA
Baharat Karışımı
71.6 71.6 71.6 71.6 71.6
Beyaz Karışım
30 30 30 30 30
Şeker 6 6 6 6 6
Askorbik Asit 1 1 1 1 1
Fosfat 5 5 5 5 5
Starter 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Buz 120 120 120 120 120
Sarımsak 30 30 30 30 30
NaCl 30 30 30 35 35
Nitritli Tuz 10 10 10 5 5
Kombucha çayı (mL/2kg et)
- 100 200 100 200
*Baharat karışımı: Tatlı toz biber, kimyon, acı toz biber, karabiber, yenibahar, karanfil
*Beyaz Karışım: İnce tuz, nitritli tuz, polifosfat, askorbik asit
23
Sucuk hamuru karışımlarının hazırlanması için, kıyma et diğer ingrediyen ve katkı maddeleri ile Tefal karıştırıcıda (Wizzo, Tefal, France) zaman zaman alt üst edilerek 10 dk süreyle karıştırılmıştır. Bu şekilde elde edilen sucuk hamurları, Tefal marka kıyma makinesinin dolum ünitesi (HV8 Plus meat mincer, Tefal, France) kullanılarak kolajen kılıflara doldurulmuştur. Ayrıca, her bir gruptaki sucuk hamurundan yaklaşık 200 gram sucuk hamuru analizlerini gerçekleştirmek üzere ayrılmıştır. Hazırlanan bütün grupların sucuk dolum işlemi her gruptan beş kangal olacak şekilde gerçekleştirilmiş ve paslanmaz çelik askılara asılarak iğne ile havası alınmıştır. Sucuklar sıcaklığı, nemi ve hava hızı kontrol edilebilen kabine alınarak dinlendirilmiştir. Daha sonra olgunlaştırma kabinine alınan sucuklar Et ve Süt Kurumu tarafından rutin uygulanan 3 aşamalı fermentasyon ve daha sonra 3 aşamalı kurutma işleminden (çizelge 3.2) sonra, ısıl işleme tabi tutulmuştur. Isıl işlem, %100 bağıl nem ve 75oC’de, 100 m/sn hava hızı bulunan kabinde sucukların merkez sıcaklığı 60oC olacak şekilde 10 dk süreyle uygulanmış, süre sonunda sucuklar yaklaşık 20oC’deki musluk suyu ile yaklaşık 15 dk duşlanarak soğutulmuştur.
Çizelge 3.2 Sucuk fermentasyon ve kurutma aşamaları olgunlaştırma kabin koşulları
Ortam Koşulları 1. aşama 2. aşama 3. aşama
Fermentasyon
Fırın sıcaklığı (oC) 25 25 10
Bağıl nem (%) 95 80 20
Temiz hava (m/s) 20 20 20
Dolaşımlı hava (m/s) 25 25 25
Süre (saat) 10 14 14
Kurutma
Fırın sıcaklığı (oC) 45 55 70
Dolaşımlı hava (m/s) 100 100 100
Süre (saat) 30 30 30
24
3.4 Başlangıç Sucuk Hamurunda ve Son Üründe Yapılan Analizler
Et ve Süt Kurumu Sincan Et Kombinası’nda 3 farklı tekerrür şeklinde üretimi tamamlanan sucuklar Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Et Teknolojisi Laboratuvarına getirilmiştir. Analizlerin ilk günü her bir grup sucuk kangallarından rastgele olacak şekilde, mikrobiyolojik analizler için steril koşullar sağlanarak örnek alımı gerçekleştirilmiştir. Her bir gruptan birer kangal duyusal analiz için ayrılmış ve -18oC’de muhafaza edilmiştir. Diğer sucuk kangalları dilimler haline kesilerek el blenderi (Waring-8011 EB, USA) ile parçalanarak homojen hale getirilmiştir.
Homojenize edilen örnekler üzerinde; nem, protein, yağ, kül, tuz, nitrozohemokrom ve kalıntı nitrit içerikleri, pH, titrasyon asitliği, su aktivitesi (aw), enstrümental renk [CIE* açıklık-koyuluk (L*), kırmızılık (a*) ve sarılık (b*) değerleri] ve TBARS değerleri analiz edilmiştir. Örneklerde ayrıca, Toplam Aerob Mezofil Bakteri (TAMB), Laktik Asit Bakteri (LAB), Stafilokok/Mikrokok ve toplam maya-küf sayıları belirlenmiştir.
Belirtilen analizler sucukların dolumdan önce ayrılan başlangıç hamurunda da gerçekleştirilmiştir. Aynı zamanda, hammadde üzerinde de kimyasal bileşim analizleri gerçekleştirilmiştir. Sucuklarda duyusal analiz hem çiğ örneklerde hem de pişmiş örneklerde yapılmıştır. Tüm analizler 3 tekerrür ve en az 2 paralel olacak şekilde yapılmıştır.
3.4.1 Nem içeriği
Sabit ağırlığa getirilen kuru madde kaplarına yaklaşık olarak 5 g örnek tartılmış ve 105oC’deki etüvde sabit ağırlığa gelene kadar kurutulup kuru madde kaplarının tartım farkından örnekteki % nem miktarı belirlenmiştir (Anonymous 2000).
3.4.2 Kül içeriği
Sabit ağırlığa getirilen porselen kül kapsüllerine yaklaşık 3 g örnek tartılmış ve kül fırınına konulmuştur. Porselen krozeler öncelikle 250oC’de 2 saat tutulmuş daha sonra sıcaklık 550oC’ye artırılarak kül kapsülündeki örnek rengi gri-beyaz olana kadar yakma
25
işlemine devam edilmiştir. Kül kapsüllerinin tartım farkından örnekteki % kül miktarı belirlenmiştir (Anonymous 2000).
3.4.3 Yağ içeriği
Sucuklarda yağ miktarı Soxhelet yöntemine göre belirlenmiştir. Bu amaçla kullanılacak olan yağ balonları 105oC etüvde sabit ağırlığa getirilmiştir. Kartuş içerisine kuru madde analizi sonunda elde edilen kuru örnek aktarılmış ve kartuşun üzeri pamukla kapatılmıştır. Düzeneğe yerleştirilen yağ balonlarına çözgen olarak petrol eteri 1.5 sifon yapacak şekilde ilave edilmiş ve ekstraksiyon işlemine yaklaşık 6 saat kadar devam edilmiştir. Ekstraksiyondan sonra yağ balonunda kalan çözgenin uzaklaştırılması amacıyla yağ balonları 105oC’de etüvde en az 2 saat bekletilmiştir. Yağ balonları desikatöre alınarak oda sıcaklığına soğutulmuş ve hassas olarak tartılmıştır. Sonuçlar % yağ içeriği şeklinde hesaplanmıştır (Anonymous 2000).
3.4.4 Protein içeriği
Kjeldahl yöntemine göre protein miktarının tespiti amacıyla, örneklerde öncelikle % azot (N) miktarı tespit edilmiş daha sonra elde edilen % N miktarı 6.25 faktörü ile çarpılarak % protein miktarı bulunmuştur (Anonymous 2000).
3.4.5 Tuz içeriği
Tuz miktarının belirlenmesi için kül haline getirilen örnek kullanılmıştır. Kül, sıcak destile su ile yıkanarak, külsüz filtre kağıdından (Whatman No:42) erlanmayer içerisine süzülmüştür. Filtrat, 3-4 damla fenol fitalein indikatörü ilave edilerek 0.1 N H2S04 çözeltisi ile pembe renk renksizleşinceye kadar titre edilmiş ve üzerine 3-4 damla
%5’lik K2CrO4 eklenerek 0.1 N AgNO3 çözeltisi ile kiremit kırmızısı renge titre edilmiştir. Sonuçlar % şeklinde hesaplanmıştır (Anonymous 2000).
