3. VİROLOJİDE KULLANILAN METODLAR

(1)

3. VİROLOJİDE KULLANILAN METODLAR

3.1. Morfolojik Yapının Belirlenmesi

 elektron mikroskobu

 Bazı büyük virüsler ışık mikroskobu

 örnek hazırlama işlemleri sonucu viral yapıda deformasyonlar olmakta

 Bunu önlemek için boyama yada kaplama işlemlerinin yapılmadığı cryo-elektron

mikroskobisi olarak adlandırılan bir teknik geliştirilmiştir.

 Ayrıca moleküler yapının daha detaylı çalışılmasında X-ışını kristalografisi de kullanılmaktadır.

 Canlı hücrelerdeki viral yapının gözlenmesinde Atomik Güç Mikroskobu (AFM)

(2)

3. VİROLOJİDE KULLANILAN METODLAR

3.2. Virüslerin Üretilmesi

 Hayvan Virüsleri:

1. Embriyonlu yumurta:

2. Laboratuvar hayvanları:

3. Hücre kültürleri:

(3)

 B. Bitki Virüsleri:

 Bitkilerde yada bitki doku (hücre ve

protoplast) kültürlerinde üretilmektedir.

Aşındırılan yada tahriş edilen bitki

yapraklarına virüs karışımı sürülür. Bu

şekilde hücre duvarı kırılan bitki hücrelerini virüs enfekte eder. Virüsün geliştiği

kısımlarda ya nekrotik zon adı verilen

çürüme bölgeleri oluşur yada yaprağın şekli ve pigmentasyonunda değişim olur.

 C. Bakteriyofajlar:

 Sıvı yada katı ortamlarda gelişen aktif

bakteri hücrelerinde üretilmektedir. Üreme sonucu sıvı kültürlerde lizis nedeniyle

bulanıklık hızla azalır. Katı ortamlarda ise faj

plakları gözlenir. Faj çeşitine göre farklı tipte

oluşan faj plakları Şekilde gösterilmiştir.

(4)

3.3. Virüslerin Saflaştırılması

 1. Santrifüjleme:

Gradient santrijüjleme:

Diferensial Santrifüjleme:

 2. Kimyasallarla çöktürme:

 3. Kontaminantların denatürasyonuyla:

 4. Enzimatik sindirimle:

(5)

Diferensial Santrifüjleme

Hüc+Vir  100.000 g 1-3 saat  çökelek

 8.000-10.000 g 10-20 dak  süpernatant

 100.000 g 1-3 saat virüs çöker

(6)

3.3. Virüslerin Saflaştırılması

 1. Santrifüjleme:

Gradient santrijüjleme:

Diferensial Santrifüjleme:

 2. Kimyasallarla çöktürme:

Amonyum sülfat

 3. Kontaminantların denatürasyonuyla:

Isı, pH, organik çözücüler

 4. Enzimatik sindirimle:

proteaz, nükleaz

(7)

3.4. Virüs Miktarının Belirlenmesi

 Toplam virion sayısının belirlenmesi:

1. Direk sayım:

2. Hemaglutinasyon testi:

 Enfektif virion sayısının

belirlenmesi:

(8)

4. RNA VİRÜSLERİ

 4. 1. Kılıfsız Pozitif Anlamlı Tek İplikli RNA Virüsleri

 4.2. Kılıflı Pozitif anlamlı Tek İplikli RNA Virüsleri

 4.3 Kılıflı Negatif Anlamlı yada

Ambisens Tek İplikli RNA Virüsleri

 4.4. Çift iplikli RNA Virüsleri

(9)

Kılıfsız Pozitif Anlamlı Tek İplikli RNA Virüsleri

 Hayvanlarda bulunan virüsler, Picornaviridae (picorna = küçük RNA), Caliciviridae,

 Bakterilerde bulunanlar Leviviridae (levis = ağırlığı az, hafif) familyası altında toplanmıştır.

 Bitkilerde bulunan bu virüslere ise

bir familya ismi verilmemiştir.

(10)

 Genomları 4 000 – 10 000 nükleotid içerir.

 Enfekte hücrelerde, viral genomik RNA’dan farklı iki tip RNA vardır.

 Çift iplikli, replikatif form (RF)

 Kısmen tek iplikli, replikatif intermediat (RI)

 RF denatüre edildiğinde, iki eşit uzunlukta (+ ve – anlamlı) tek ipliklere ayrıldığı, RI’in ise nükleaz muamelesi sonrasında bir uzun ve birkaç tane daha kısa tek ipliklere ayrıldığı belirlenmiştir.

Kılıfsız Pozitif Anlamlı Tek İplikli

RNA Virüsleri

(11)

 Replikasyonda görevli olan, + ve – ss viral RNA sentezinden sorumlu olan RNA’ya bağlı RNA polimeraz enzimi, RNA replikaz olarak

adlandırılmaktadır.

 Bu enzim en iyi Qβ fajında çalışılmıştır.

 Fosfodiester bağ oluşumu ve konukçu protein

sentezinin uzamasını sağlayan faktör (EF-Tu ve EF- Ts) sentezini sağlayan core replikaz,

 60 kDa’luk virüs tarafından şifrelenen bir alt ünite

 ile birlikte konukçu ribozomal proteini SI

 ve konukçu faktörü olarak bilinen RNA bağlanma proteinini bu reaksiyonu gerçekleştirmek için

istemektedir.

Kılıfsız Pozitif Anlamlı Tek İplikli RNA

Virüsleri

(12)

Familya: Picornaviridae

 Enterovirus: Çocuk felci poliovirüs

 Rhinovirus: soğuk algınlığı Rhinovirus

 Aphthovirus: Food and mounth disease virus

 Cardiovirus:

 Hepatovirus: Hepatit A virüsü

 Tanımlanamayan virüsler:

Familya: Caliciviridae

Kılıfsız Pozitif Anlamlı Tek

İplikli RNA Virüsleri

(13)

Enterovirus: Çocuk felci poliovirüs

 Omurilikteki kasların kasılmasını başlatan sinir hücrelerinin zarar görmesi sonucu oluşur. Omuriliğin ön kordonlarının

iltihaplanması sonucu felçle neticelenen bir hastalıktır. (poliomyelit)

 Çocuk felcinden korunmak için "Salk aşısı" veya "Sabin aşısı" yaptırmak gerekir. Bu aşının ilki çocuk 6 aylık

olmadan önce, ikincisi ilk aşıdan 2 ay sonra,

üçüncüsü, ikinci aşıdan 6 ay sonra yapılır.

5 ve 15 yaşlarında da tekrarlanır.

(14)

Hepatovirus: Hepatit A virüsü

 Ülkemizde erişkin yaş gurubunda %7,8(İstanbul)-

%87,5(Elazığ) arasında varlığı gözlenmiştir.

 USA da tüm viral hepatit vakalarının %65 ini oluşturur. 1996 yılında 29.000 HAV vakası bildirilmiştir, buna rağmen gerçek rakamın 143.000 civarında olduğu tahmin edilmektedir. Tüm dünyada bu rakam 1.4 milyona ulaşmaktadır.

 Hepatit virüslerinden B, C ve D virüsleri kan ve kan ürünleri ile bulaşırken, A ve E virüslerinin bulaşması virüsle enfekte yiyecek ve içeceklerin ağız yolu ile alınmasıdır. Virüs enfekte insanların dışkılarında bulunduğu için hijyen koşulları ve

tuvaletler ve içme suyu ilişkisi önemlidir.

 HAV enfeksiyonu geniş bir yelpazede kendisini gösterir:

farkında olmadan geçirilebilen bir enfeksiyon olabileceği gibi, ölümle seyreden klinik tablolara da yol açabilir.

 HBV ve HCV den farklı olarak HAV enfeksiyonu kronikleşmez.

(15)

Familya: Picornaviridae Familya: Caliciviridae

 Tek tip kapsit proteini vardır.

 İnsanlarda hastalık yapanlar:

 Norwalk

 Hepatit E

Astrovirüsler: Barsak has sebep olur, sınıflandırılmamış, genom ve

kapsitleri Picornaviridae ye benzer Kılıfsız Pozitif Anlamlı Tek

İplikli RNA Virüsleri

(16)

Familya: Picornaviridae Familya: Caliciviridae

Astrovirüsler:

Böcek Virüsleri

Familya: Nodaviridae Familya: Tetraviridae

Kılıfsız Pozitif Anlamlı Tek

İplikli RNA Virüsleri

(17)

Bitki Virüsleri

Kapsitleri tek tip proteinden oluşur (Comovirüs hariç)

Konukçuyu öldürmezler

Adsorpsiyonda rol oynayan proteinleri yoktur

Polihedral

Uzamış (Quasi) polihedral Çubuk şeklinde (TMV)

Filamentli

Kılıfsız Pozitif Anlamlı Tek İplikli

RNA Virüsleri

(18)

Genom ekspresyonlarında 5 farklı yol vardır.

1. Poliproteinler sentezlerler 2. Çok parçalı genomları vardır 3. Subgenomik mRNA ları vardır.

4. Aynı bölgeyi iki kere okuyup farklı proteinler sentezlerler

5. Ribozomda durdurucu kodondan bir nükleotid çıkarıp farklı üçlü bazlar oluştururlar.

Kılıfsız Pozitif Anlamlı Tek

İplikli RNA Virüsleri

(19)

Bakteriyofajlar

Familya: Leviviridae

Levivirüs (MS2 fajı)

Allolevivirüs (QB fajı)

(20)

Familya: Leviviridae

 Escherichia coli  MS2 faj genomu 3569 nükleotid uzunluğundadır.

 Polisistronik olan RNA’lardan ribozomda dört protein sentezlenir.

 Olgunlaşma proteini (A proteini)

 Kapsit proteini

 Liziz proteini

 RNA replikaz

(21)

faj protein sentezi üç şekilde kontrol edilir.

 İlk olarak, mRNA’da ribozoma bağlanma bölgeleri değiştirilerek önce istenilen

proteinlerin sentezi (kapsit ve replikaz) gerçekleştirilir.

 İkinci olarak, bazı genler (olgunlaşma, A) RNA replikasyonunda aktifleşir. Bu şekilde

olgunlaşma proteini ve genomil RNA 1:1 oranında sentezlenmiş olur.

 Üçüncü olarak, repressör görevi gören küçük bir molekül RNA’ya bağlanarak o genin

(polimeraz) transkripsiyonunu önler.

(22)

 Fam: Togaviridae

 Fam: Flaviviridae

 Fam: Coronaviridae

 Fam: Toroviridae

Kılıflı Pozitif Anlamlı Tek İplikli

RNA Virüsleri

(23)

Fam: Togaviridae

 1. Genus: Alphavirus, Kuşlarda bulunur.

Kuşlar arasında yada kuşlardan atlara

sivrisinekler yoluyla yayılmaktadır. Bu grupta yer alan Sindbis ve Semliki Forest virus

moleküler düzeyde yapıları en iyi çalışılmış virüslerdir.

 2. Genus: Rubivirus, Böcek vektörler

kullanmazlar. İnsandan insana hava yoluyla bulaşırlar. Bu grupta genellikle gençlerde görülen Rubella (kızamıkçık) virüsü bulunur.

 3. Genus: Arterivirüs, Equine arteritis virus

ve Lactic dehydrogenase virus bu grupta

bulunur. Bu cinse ait türler son yıllarda ayrı

bir familya, Arterividiae, altında toplanmıştır.

(24)

Fam: Flaviviridae

1. Genus: Flavivirus: Sivrisinek - insan –

sivrisinek bulaşma döngüsüne sahip sarı humma hastalığına sebep olan, Yellow fever virus; Panama kanalı yapımında Walter Reed tarafından 1900 yılında keşvedilmiştir.

2. Genus: Pestivirus: Sığırlarda isale sebep olan Bovine diarrhea virus bu grupta

bulunur.

3. Genus: Hepativirus: Hepatitis C virus, ilk

kez 1989

(25)

Zika virus

 Zika virüsü 1947'de Uganda'nın Zika Ormanı'nda yaşayan

maymunlarda keşfedildi.

 Virüsün insanlarda görüldüğü ilk vakaya 1954'te Nijerya'da

rastlandı.

(26)