Nörotransmitter döngüsü:
Veziküler ve Plazma Membranı Taşıyıcılarının Moleküler Yapısı ve
Düzenlenmesi
Doç. Dr. Güvem Gümüş Akay
Ank. Üniv. Disiplinlerarası Sinirbilim Doktora Programı/
Sinapsların Moleküler Nörobiyolojisi
Nörotransmitterler (NTler)
• Sinir sisteminde mesajcı olarak iş gören moleküllerdir
• Yapıları son derece çeşitlilik gösterir
• 2C’lu Gly Büyük peptidler
Otto Loewi
Bir molekülün NT olabilmesi için şu koşulları sağlanması gerekir:
• Nöronda sentezlenmeli veya nöronda bulunmalı
• Nöron uyarıldığında salınmalı ve hedefte bir yanıt oluşturmalı
• Molekülün deneysel ortamda hedef üzerine uygulanması ile aynı yanıt elde edilmeli
• İşlevini yerine getirdikten sonra bulunduğu
yerden uzaklaştırılmalı
Sinaptik iletimde ilk basamak NT’lerin
sentezlenmesidir
Küçük-molekül yapısındaki NT’ler
• Akson terminalinde lokal olarak sentezlenirler
• Sentezlenmeleri için gerekli olan öncü moleküller, membran üzerindeki seçici taşıyıcılar aracılığı ile akson terminaline alınır.
• Bir grup öncü molekül ise hali hazırda nöronda meydana gelen metabolik olayların ara ürünleridir.
• Bu işlemleri katalizleyecek olan enzimler ise hücre gövdesinde üretilip yavaş aksonal taşınma ile akson terminaline ulaştırılırlar.
Peptid NT’ler
• Büyüklük ve sentezlendikleri yer bakımından diğer NT’lerden farklıdırlar.
• 3-36 aa uzunluğunda
• Hücre gövdesindeki ribozomlarda sentezlenirler
• Sentez süreçleri daha karmaşıktır, sekretuvar protein sentezine benzer
Asetilkolin (ACh)
• İlk keşfedilen NT
• 1921de Alman Biyolog Otto Loewi tarafından izole edilmiştir
• Kolinden sentezlenir
• İnhibitör/Eksitatör
Dopamin (DA)
• Tirozin’den sentezlenir
• Motor aktivite, duygu
durum, motivasyon ve
dikkat
Norepinefrin=Noradrenalin (NE)
• Dopaminden direkt olarak sentezlenir
• Epinefrinin öncü molekülüdür
• Sinaptik vezikül içerisinde sentezlenir
• Kalp atım hızı ve kan
basıncının artmasına neden olur
• Bellek oluşumunda da
önemli işlevi vardır
Glutamat (Glu)
• Aminoasittir
• Eksitatör sinapsların çoğunda bulunur
• Algı, bellek, öğrenme gibi çok farklı beyin
işlevlerinde rol oynar
• Krebs döngüsünün bir ara ürünü olan α-ketoglutarattan
sentezlenir
GABA (Ɣ-amino bütirik asit)
• Glutamat’tan sentezlenir
• En önemli inhibitör NT’dir
• CNS’de yüksek
konsantrasyonda
bulunur
Serotonin (5-HT)
• 5-Hidroksitriptamin
• Triptofan’dan 2
basamakta sentezlenir
• Dikkat, yeme, duygu
durum, rüya görme, ağrı regülasyonu gibi
kompleks bilişsel
işlevlerde rol oynar
NT döngüsü
• NTlerin sinaptik veziküllerde paketlenmesi
• Hücre dışı ortamdam geri alınması
– Sinaptik iletimin sonlandırılması – NTnin bir sonraki salınım için geri
dönüştürülmesi
Sinaptik iletimin hızı ve etki gücü
• Aksonal butona uyarım geldiği anda, yüksek
konsantrasyonda NT ile doldurulmuş sinaptik
veziküllerin mevcudiyetine bağlıdır
• Çok aktif olarak geri alınma söz konusu olur ise:
– Salınabilir NT havuzu yenilenebilir
– Postsinaptik hücrede meydana gelen sinyalin süresi ve seviyesi azalır
• Geri alınma ortadan kalkar ise:
– Postsinaptik reseptörler aşırı aktive olur
– NT kaynakları tükenir
• Veziküllerde dik bir konsatrasyon gradyanı söz konu olur ise
– Vezikül başına salınan NT miktarı artar
– Ancak veziküllerin tekrar doldurulmasında kullanılacak sitoplazmik NT kaynakları azalır
• Veziküllerde yüzeyel bir konsantrasyon gradyanı söz konusu olur ise
– Veziküllerin NT ile doldurulması için gerekli sitoplazmik kaynak bol miktardadır
– Ancak salınma için mevcut NT miktarı azalır
Veziküllerin NT ile doldurulmasında 3 önemli belirleyici söz konusudur
1. NT’nin sitoplazmik konsantrasyonu
2. Vezikül membranı boyunca oluşan protonun elektrokimyasal gradyanının itici gücü
3. Veziküler taşıcı proteinlerin içsel özellikleri
Bütün klasik NT’lerin sinaptik veziküllere taşınması veziküler H
+/ATPaz (V-ATPaz)
tarafından oluşturulan H
+’nin elektrokimyasal
gradyanının itici gücüne (ΔμH+) bağlıdır
H
+/ATPaz (V-ATPaz)
• ATP hidrolizinden salınan enerjiyi kullanarak protonları vezikül lümenine pompalar
• Membran sektör V0 ve membran sektör V1’den oluşan bu H+ pompası, aynen mitokondriyal ATP sentazdaki gibi, dönerek çalışan mekanizmaları kullanır
V-ATPaz’ın düzenlenmesi
• Vezikül dışı ortamda Cl- yokluğunda, V-ATPaz pozitif elektriksel membran potansiyeli (Δψ) oluşturur
• Veziküler NT taşıyıcısı (örn: VGLUT) protona karşılık
olarak NT molekülünü konsantrasyon gradyanının aksi yönde vezikül içerisine transfer eder.
• Vezikülün NT ile dolması yavaştır ve giren NT miktarı azdır.
• Vezikül dışı ortamda az miktarda Cl- bulunması, veziküler NT taşıyıcısı aracılığı ile Cl-’un vezikül içerisine doğru akışına neden olur.
• Anyonun girişi Δψ’yi ortadan kaldırır
• Anyon varlığına bağlı ve ikincil olarak H+ pompası aktive edilir.
• pH gradyanı oluşurulur (ΔPh)
• ΔPh’nın bir miktar artmasına bağlı olarak, Cl-
olmadığı duruma göre daha kuvvetli bir NT girişi söz konusudur.
V-ATPaz’ın düzenlenmesi
• Vezikül içerisinde yüksek konsantrasyonda Cl-
bulunduğunda, veziküler NT taşıyıcısı Cl-’un vezikülü terketmesine aracılık ederek elektriksel gradyanın yükselmesine neden olur.
• Elektriksel gradyanın oluşturduğu itici güç ile NT’nin vezikül içerisine girişi kolaylaşır.
• Vezikülün hızlı ve etkin bir biçimde NT ile doldurulması anlamına gelir.
V-ATPaz’ın düzenlenmesi
• Hücre dışı ortamda Cl- konsantrasyonunun lokal olarak değişkenlik göstermesi, GABA reseptörleri veya Cl-değişitiricileri aracılığıyla sağlanıyor olabilir.
• Düşük Cl- konsantrasyonuna sahip bölgelerde endositozla alınan veziküller daha yavaş ve az miktarda NT ile doldurulurlar.
• Sinaptik veziküller çok sayıda ClC izoformu içerir.
• Ancak bu kanallardan hangilerinin vezikül
asidifikasyonu için gerekli Cl- akışına katkı sağladığı net değildir
• Aslında Glu, Cl-’dan daha etkin ve kalıcı bir biçimde ΔPh oluşturabilmektedir.
• Monoamin nöronlar tarafından salınan Glu, vezikül asidifikasyonu ve monoamin depolanmasındaki rolünden bağımsız olarak postsinaptik Glu reseptörlerini de aktive etmektedir.
• Herhangi bir monoamin salındığında (örn DA/5-HT) eş zamanlı olarak az miktarda da olsa Glu salınımının da gerçekleştiği tahmin edilmektedir.
• Dolayısı ile eş zamanlı glutamaterjik yanıt da oluşmaktadır.
• Bir nörondan iki farklı sinyalin salınmasının rolü henüz bilinmemektedir.
Veziküler NT Taşıyıcıları
Sinaptik veziküller üzerinde bulunan ve veziküllerin NT ile doldurulmasından sorumlu membran
proteinleridir.
1. VMATs : Veziküler Monoamin Taşıyıcıları (+ yüklü) 2. VAchTs: Veziküler Asetilkolin Taşıyıcıları (+ yüklü) 3. VGATs/VIAATs: Veziküler inhibitör aminoasit
taşıyıcıları (nötral zwitteriyon)
4. VGLUTs: Veziküler Glutamat Taşıyıcıları (- yüklü)
Bütün klasik NT’lerin sinaptik veziküllere taşınması veziküler H+/ATPaz (V-ATPaz) tarafından oluşturulan H+’nin elektrokimyasal gradyanının itici gücüne (ΔμH+)
bağlıdır
Veziküler NT Taşınması
• H
+’nin elektrokimyasal itici gücünün (ΔμH+), ΔPh veya Δψ şeklinde ifade bulması, NT
salınmasında özel bir öneme sahiptir.
• Farklı veziküler NT taşıyıcıları H
+gradyanının
bu iki bileşenine farklı ölçülerde bağlıdır
Veziküler Monoamin Taşıyıcıları (VMATlar)
• 2 lümenal proton (H+) ile 1 sitozolik protonlanmış monomanin’in karşılıklı değiş tokuşu
• Dopamin, serotonin, epinefrin, norepinefrin, histamin
• Daha ziyade ΔPh’ya dayanır
• pHsı 5.8 ve Δψ 60 mV olan bir vezikül lümen/sitozol monoamin gradyanı 10^5
VMATlar
• Memelilerde 2 tip: VMAT1 ve VMAT2
• VMAT1 non-nöronal hücrelerde (adrenal kromafin hücrelerinde) eksprese olur
• VMAT2 nöronlarda eksprese olur
• Substratlarına afiniteleri çok yüksek (Km:
mikromolar seviyelerinde)
• Vmax: 5-20/sec
• Sitozolik monoamin konsantrasyonları çok düşük olsa bile vezikülleri etkin bir biçimde
doldurabilirler
VAChT
• Asetil kolinin veziküler depolanmasından sorumlu taşıyıcı proteindir
• Proteinin primer aa dizisi bakımından VMATlara benzer
• Ancak Km’i daha yüksektir
• Vmax ~1/sec
VGAT
• İnhibitör NT’ler olan GABA ve Gly’nin her ikisi için de veziküler taşıyıcıdır
• Yapı olarak VMATlardan oldukça farklıdır.
• İşlevi büyük ölçüde Δψ’ye olmakla birlikte ΔPh’ya da dayanır
• Aktif aşınma için Cl
-’a ihtiyaç duyar.
• Km’i diğer taşıyıcılarla karşılaştırıldığında oldukça yüksektir (GABA için ~5mM, Gly için ~25 mM).
• Vezikülleri doldurabilmek için yüksek sitozolik
konsatrasyona ihtiyaç duyar.
VGLUTlar
• Diğer veziküler taşıyıcılar içinde işlevi Δψ’ye en bağlı olan ayrı bir protein ailesine dahildir.
• Veziküler Glu taşınmasında rol oynar
• Farede VGLUT genlerinin fonksiyonlarının engellenmesi sinaptik Glu salınmasını
engellemektedir.
• DA nöronlar VGLUT2
– VGLUT2 inaktive edilirse DA depolanması ve salınmasındaki azalma nedeni ile
psikostimülanların etkisi azalıyor
• Striyatumdaki kolinerjik internöronlar VGLUT3
– VGLUT3 inaktive edilirse ACh depolanması ve salınması azalıyor
• VGLUT1-3
• Beyinde bu genleri eksprese eden nöronlar Glutamaterjik nöronlar olarak kabul edilir
• VGLUT1: Hipokampüs ve korteks
• VGLUT2: Talamus ve beyin kökü
• VGLUT3: Glutamat salınması ile ilişkisi olmayan
nöronlarda
• Farklı VGLUT izoformlarının vezikül doldurma aktivitleri birbirine benzer
• Ancak bu izoformların hücre içi trafikleri farklılık gösterir
• VGLUT1 ve VGLUT2 neredeyse her zaman aksonal
• VGLUT3 ise dendritik ve bazı hücre
populasyonlarının aksonlarında
• VGLUT1 iki adet poli-prolin motifi içeriyor
• Bu motif sayesinde endofilin gibi proteinlerle etkileşerek endozitozda rol oynuyor
• Böylece taşıyıcının geridönüşümünde de etkili
Veziküler Taşıyıcıların Düzenlenmesi
• Vezikül üzerinde bulunan taşıyıcı sayısındaki farklılıkların vezikülün NT ile doldurulma hızını etkileyeceği tahmin edilebilir.
• Aslında tek bir VGLUT proteini bir vezikülü Glu ile doldurmak için yeterlidir.
• VGLUT1 heterozigotlarda sinaptik iletimde belirgin bir değişiklik yok.
• Farede davranış değişiklikleri rapor edilmiş.
• VGLUT genleri aktivite ile düzenlenen genler
• Nöronal aktiviteye bağlı olarak ekspresyonları artmakta ve NT salınması üzerinde etkili
olmaktadırlar
• Taşıyıcıların trafiği de düzenlenmede ve dolayısıyla sinaptik vezikül üzerindeki
sayılarının belirlenmesinde son derece önemli
Plazma Membranı NT Taşıyıcıları
• Küçük molekül yapılı NT’lerin postsinaptik hücredeki etkilerinin sonlanması için bu
moleküllerin sinaptik yarıktan temizlenmesini sağlayacak mekanizmalar gereklidir.
– NT’in taşıyıcı aracılı geri alınması
– Enzimatik olarak inaktif forma dönüştürme
• Asetilkolinesteraz
Sinaptik yanıtın akıbeti pekçok faktör tarafından belirlenir
• Sinapsın geometrisi
• Salınan NT’nin tipi
• NT reseptörlerinin özellikleri, sayısı ve lokalizasyonu
• NT taşıyıcıları
– NT tarafından ne kadar reseptörün ne süre ile
aktive olacağını etkileyerek sinaptik yanıt üzerinde önemli belirleyici olarak işlev görürler.
Plazma Membranı NT Taşıyıcılarının İşlevleri
• Seçici olarak taşıyıcı blokörlerinin kullanılması
• Taşıyıcı proteinleri kodlayan genler bakımından transgenik hayvan modelleri
Reseptörlere yakın lokalizasyonda ve yoğun olarak bulunduklarında sinaptik yarıkta ulaşılabilecek maksimum NT konsantrasyonunu
düşürmek
Reseptörleri aktive etmek için NT’lerin ulaşılabilir olduğu zamanı azaltmak
NT’nin salındıktan sonra difüze olabildiği mesafeyi kısaltmak
Komşu sinapslara yayılarak oradaki reseptörlere bağlanmayı (crosstalk) engeller
Aynı anda aktif olan sinapslardaki NT’ler ile karışmayı (pooling) engeller
• NT’in taşıyıcı aracılı olarak geri alınması çoğunlukla salındığı membran tafından gerçekleşir.
• Fakat özellikle aa yapısındaki NT’lerin sinaptik yarıktan temizlemesi astrosit membranında veya başka bir NT’nin salındığı presinaptik
membranda bulunan taşıyıcılar tarafından geri
alınma yoluyla gerçekleşir.
• Ekzositoz ile salınmadan sonra, NT’lerin
ekstraselüler alana difüzyonu son derece hızlı gerçekleşir ki bu hız taşıyıcı aracılığı ile hücre içine tekrar alınmasından çok daha fazladır.
• Bu nedenle sinaptik yarığın NT’den
temizlenmesinde en önemli aşama, taşınma işleminden ziyade mümkün olan en kısa
sürede (etrafa çok dağılmadan) taşıyıcıya
bağlanmasının sağlanmasıdır.
• Vezikül membranında bulunan taşıyıcılara benzer
şekilde plazma membranı taşıyıcıları da transmembran iyon veya voltaj gradyanını temizleme işleminde enerji olarak kullanır.
• Bu özellikle aa NT’ler için son derece önemlidir. Çünkü sitozolik konsantrasyonları son derece yüksektir. Bu nedenle büyük bir konsantrasyon gradyanına karşı taşınmaları gerekir.
• Eğer membranın her iki tarafından konsantrasyonu
dengeye eriştirecek şekilde bir taşınma olsaydı bu geri alınma değil: salınma olurdu.
• Plazma membranı taşıyıcıları, plazma
membranı boyunca Na
+/K
+ATPaz tarafından
meydana getirilen Na
+ve K
+gradyanını geri
alma işlemi sırasında kullanır.
• KO fare çalışmaları bu taşıyıcıların sinaptik fonksiyondaki fizyolojik önemlerini ortaya koymuştur.
• Beklendiği üzere NT temizlenmesinde
azalmanın yanı sıra presinaptik NT havuz homeostazında da önemli.
• Etki sinapsın her iki tarafında söz konusu
Plazma Membranı NT Taşıyıcılarının
Farmakolojisi
NET ve DAT Antagonistleri
• NET: Atomoxetine
• DAT: Methylphenidate
Plazma Membranı Taşıyıcılarının Moleküler Yapısı
• GABA, Gly, NE, DA, 5-HT taşıyıcıları SLC6 ailesine dahil
• 12 adet transmembran domain
• EAAT’lar ayrı bir gen ailesinin üyesi
• SLC1
• 8-10 TMD
• İlk yapı SLC1 ailesi üyesinde aydınlatılmış
• Kase şeklinde bir trimer
• Her bir momomerde birer adet olmak üzere 3 ayrı substrat bağlanma bölgesi
• Ortada bir koridor
Plazma Membranı Taşıyıcılaının Düzenlenmesi
• Transkripsiyon seviyesinde
• En çok çalışılmış ve en iyi bilinen örnek:
• SERT promotor’undaki tekrar dizisi polimorfizmi
• 5HTTLPR
• Kısa form «s»: Az sayıda tekrar: Azalmış mRNA ve Protein
• Uzun form «l»: Çok sayıda tekrar
• Kısa form: Anksiyete, duygu durum bozuklukları
• Trafik ve Fosforilasyon seviyesinde düzenlenme
• Diğer tüm membran proteinlerinde olduğu gibi bu proteinler için de hücre yüzeyine doğru ve aksi yöne doğru konstitütif ve düzenlenmiş trafik söz konusudur. Tüm bu süreçler çok sayıda protein kinazlar tarafından düzenlenmektedir.
• İlave olarak, bu taşıyıcıların fosforilasyon-bağımlı olarak katalitik aktivasyon değişikliği gösterdiği bildirilmiştir.
• Ancak sadece birkaç düzenleyici fosforilasyon
bölgesi bildirilmiştir ve henüz hiç birinin
in vivo önemi gösterilememiştir.
• İlave olarak, bu taşıyıcıların fosforilasyon-
bağımlı olarak katalitik aktivasyon değişikliği gösterdiği bildirilmiştir.
• Ancak sadece birkaç düzenleyici fosforilasyon
bölgesi bildirilmiştir ve henüz hiç birinin
in vivo önemi gösterilememiştir.
• PKC Glu taşıyıcısı GLT1/EAAT2’yi fosforiller ve PKC’ nin aktive olması GLT-1’in yüzey
ekspresyonunu azaltır.
• Ancak fosforilasyonla trafik arasındaki ilişki tam bilinmiyor.
• PKC aktivasyonu DAT’ı fosforile ederek
aktivitesini azaltır, ancak trafiğini etkilemez.
NT Taşıyıcıları ile İlişkili Proteinler
• 3 grup proteinle interaksiyonları tanımlanmış
– SNARE proteinleri (özellikle Syntaxin 1A) – PKC, PKG, CaMKII ve PP2A gibi kinazlar ve
fosfatazlar
– Hücre yüzeyi reseptörleri (D2 DA reseptörleri ve integrin beta3-içeren adezyon molekülleri)
