VİRÜSLERİN ÜRETİLMELERİ. Dr. Ali Osman ADIGÜZEL

(1)

VİRÜSLERİN ÜRETİLMELERİ

Dr. Ali Osman ADIGÜZEL

(2)

Bakteri ve hayvan hücrelerinin üretilmesinde farklılıklar bulunmaktadır.

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

Konak kaynaklı farklılıklar:

•h. Duvarı

•h. Membranı

•Hücresel organizasyon

Virüs kaynaklı farklılıklar:

•Olgunlaşma biçimi

Dr. Ali Osman ADIGÜZEL

(3)

Virüslerin üretilmesinde kullanılan 3 canlı sistem

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Dr. Ali Osman ADIGÜZEL

(4)

Deney Hayvanları

(5)

Deney Hayvanları

Konvansiyonel Hayvanlar

SpesificPathogenFree(SPF) hayvanlar

GermFree(GF) hayvanlar

(6)

Deney Hayvanlarına inokülasyon yolları

(7)

Embriyonik Yumurta

(8)

Embriyonik Yumurtanın geliştirilmesi

(9)

Canlılık kontrolü

(10)

Embriyonun gelişim günlerine göre yumurtaya 4 yolla ekim yapılır

Ssrı kese ekimi (6-7. gün)

Amniyotik kese ekimi (8-9. gün)

Karyoallontoik kese ekimi (9-11. gün)

Karyoallontoik membran ekimi (11-13. gün)

(11)

Sarı kese ekimi

(12)

Değerlendirme

(13)

Amniyotik kese ekimi

(14)

Değerlendirme

(15)

Karyoallontoik kese ekimi

(16)

Değerlendirme

(17)

Karyoallontoik membran ekimi

(18)

Değerlendirme

(19)

Video: Tavuk yumurtası ile Viral kültüvasyon 1

(20)

(21)

Video: Tavuk yumurtası ile Viral kültüvasyon

(22)

Pok oluşumu Fokus oluşumu

(23)

HÜCRE KÜLTÜRLERİ

(24)

Primer kültür

Maymun böbreği, insan amniyotik zarları gibi dokuların mekanik olarak parçalanmasından sonra tripsin gibi bir enzimle muamelesi sonucu hücrelerine ayrılmasıyla elde edilirler, genellikle fibroblastik veya epitelyaldirler.

Mekanik olarak ayırma

Hücrelerin yıkanması (%0.5’lik tuz çözeltisi) Tripsin (pH 7.6, 37 ° C)

Santrifüjle çöktürme

Tuz çözeltisi ile yıkama

Besiyerine aktarım

(25)

Tripsin, ilk etapta hücreler arası bağları proteolitik olarak parçalar, fakat hücreler uzun süre tripsinde

bekletilmemelidir.

Tripsinin hücreleri parçalayıcı etkisinin ortadan kaldırılması için

• mümkünse proses 4 °C’de gerçekleştirilmeli

• ortama %1-5 oranında fötal dana serumu eklenmelidir.

(26)

Alt kültür (diploid hücre kültürü)

Bir şişe primer hücreyi 3-5 şişeye bölerek daha fazla hücre elde etmek mümkündür.

Bu işleme pasaj adı verilir.

Primer kültürden sonra hücreler ortalama 50-70 pasaj süresince genotipik ve fenotipik özellikleri değişmeden sabit bir oranda

çoğaltılarak devam ettirilebilirler. Bu dönemdeki hücre kültürlerine diploid hücre kültürleri denir.

Sınırlı olmasının sebebi oluşan karyotipik değişikliklerdir.

MRC-5, WI38: insan embriyonik akciğer dokusu

İnsan yenidoğan sünnet dokusu: (human diploid fibroblast)

SIRC: Tavşan kornea

(27)

Devamlı (sürekli) hücre kültürü

Sınırsız olarak çoğalabilen ve subkültürleri yapılabilen hücre kültürleridir. Karyotipik olarak orijin aldıkları doku veya hücrelerden tamamen farklılaşmış hücrelerdir.

Kromozom sayılarında azalma vardır.

HeLa: insan serviks kanseri hücreleri (herpes simpleks, adenovirüs)

Hep-2: insan larinks kanseri hücreleri

MDCK: Afrika yeşil maymun böbrek hücreleri (influenza, adenovirüs)

BHK21: Bebek hamster böbrek hücreleri

(28)

Kültür ortamlarının hazırlanması

(29)

Kültür ortamlarının hazırlanması

(30)

Hücreler içinde bulundukları kabın yüzeyi ile olan ilişkilerine göre;

(31)

Süspanse kültür

(32)

Yerleşik kültür

(33)

Dr. Ali Osman ADIGÜZEL OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

(34)

Video: Hela hücrelerinin çoğaltılması, pasajlanması ve

korunması

(35)

Video: HL60 süspanse hücrelerinin çoğaltılması,

pasajlanması ve korunması

(36)

Video: Hücre kültüründe virüslerin üretilmeleri

(37)

Dr. Ali Osman ADIGÜZEL OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

(38)

Virüs ile enfekte hücrelerde saptanan üreme, hücre yüzeyi ve metabolik özelliklerin özeti

1. Mitoz inhibisyonu kaybolur ve buna bağlı hücreler kalın bir tabaka oluşturacak şekilde üst üste ürerler.

2. Hücre morfolojisisnde değişim. Örneğin fibroblastik hücre epitelyal morfoloji kazanabilir.

3. Transforme hücrelerin serum ve üreme faktörü gereksinimi azalır.

Normal hücreler üreme için %10 dana serumuna gereksinim duyarken transforme hücreler %1-2 seru7m konsantrasyonunda ürerler

4. Transforme hücrenin katı yüzeylere tutunma yeteneği azalır

5. Transforme hücreler agar süspansiyonu içerisinde (%0,65) üreme özelliği kazanır

6. Lektinlerle agglutine olma özelliği kazanır.

7. Yeni antijenler kazanır

8. Aerobik glikoliziste artış gözlemlenir.

(39)

Sitopatik etki (CPE)

Virüslerin hücre kültüründe üremeleri sonucunda hücrede oluşturdukları patolojik değişikliklerdir.

Sitopatik etkiye sebep olan faktörler

• hücre metabolizmasının yavaşlaması

• iyon hareketleri ve sekonder sinyallerin bozulması

• hücrenin transkripsiyonal aktivitesinin bozulması

• virüsün hücrede çoğalması

• viral ürünlerin toksik etkileri

(40)

Virüslerin hücre kültürlerinde oluşturdukları sitopatik etki şekilleri

Sitopatik etki Virüs

Piknozis Enterovirüsler, poksvirüsler, reovirüsler, rhinovirüsler togavirüsler

Aggregasyon Adenovirüsler, herpesvirüsler Sinsitya, Füzyon, dev hücre Paramiksovirüsler, herpesvirüsler Minimal etki Ortomiksovirüsler, kuduz virüsü,

coronovirüsler, retrovirüsler,

arenavirüsler

(41)

Piknozis

Virüs çoğalması sonunda;

• hücreler yuvarlaklaşır

• stoplazma daralır

• Çekirdek daha yoğun bir hale gelerek ışık gerçirgenliği azalır

• Hücrenin katı yüzeye tutunma özelliği kaybolur

• Hücreler parçalanır

(42)

Aggregasyon

Hücrelerin yuvarlaklaşması ve salkımlar oluşturacak şekilde biraraya toplanması.

Porsin lökosit kültüründe Pox virüsü enfeksiyonu sonucu oluşan aggregasyon

(Fachinger, V., Schlapp, T., Strube, W., Schmeer, N., & Saalmüller, A. (2000).

Poxvirus-induced immunostimulating effects on porcine leukocytes. Journal of virology, 74(17), 7943-7951)

Zebrabalığı blastula hücre hattı (ZEB2J)

(Xing, J. G., Lee, L. E., Fan, L., Collodi, P., Holt, S. E., & Bols, N. C. (2008).

Initiation of a zebrafish blastula cell line on rainbow trout stromal cells and

subsequent development under feeder-free conditions into a cell line,

ZEB2J. Zebrafish, 5(1), 49-63

(43)

Sinsitya-Hücre Füzyonu-Dev Hücreler

İki ve daha fazla hücrenin kaynaşması. Özellikle zarflı virüslerde füzyon proteinleri yardımıyla hücreler arasında stoplazmik köprülerin oluşumu meydana gelir.Bu köprülere sinsitya denir. İki hücre daha sonra kaynaşır.

Bu olaya füzyon denir. İkiden daha fazla hücrenin kaynaşması ile çok

çekirdekli dev hücreler meydana gelir.

(44)

Minimal Etki

Virüs hücrede üremesine rağmen mikrpskobik incelemede morfolojik değişiklikler saptanmaz.

Virüsün hücrede üremesi ancak indirekt testlerle belirlenebilir ( hemadsorbsiyon,

viral interferens

(45)

Hemadsorbsiyon: virüsün hücrede üremesi sonucunda virüs kaynaklı antijenlerin hücre yüzeyinde varlığının tespit edilmesi.

Ortama eritrositler eklenir ve virüs bulunan hücre yüzeyine

yapışması beklenir.

(46)

İnterferens: minimal etki oluşturan bir virüsün konak hücrede

üremiş olması halinde, bilinen CPE yapan başka bir virüsün hücreye girmesini önlemesi ve dolayısıyla ortama eklenen test virüsünün beklenen CPE’yi oluşturamama esasına dayanır.

Virüs içermeyen hücre Sitopatik etkisi bilinen

virüs

Hücre kültürrüne ilave edilir

Sitopatik etki görülmez

Hücreler minimal etki eden bir virüsle

enfekte olmuş anlamı çıkarılır

Virüs içermeyen hücre Sitopatik etkisi bilinen

virüs

Hücre kültürrüne ilave edilir

Sitopatik etki görülür

Hücreler minimal etki eden bir virüsle

enfekte olmamış

anlamı çıkarılır

(47)

Diğer Sitopatik etkiler (CPE)

İnklüzyon cisimciği: Hücre içerisinde farklılaşmış ve farklı boyalarla boyanabilen bölgelerin gözlemlenmesi. Sebep olan virüse bağlı olarak inklüzyonlar tek veya çoklu, büyük veya küçük, yuvarlak veya düzensiz şekilli, intranükleer veya intrasitoplazmik olabilir.

Genellikle viral nükleik asit ve proteinlerin sentezlendiği bölgede virionların birleşmesi ile oluşur.

Gimza boyama ile görüntüleme, hücre. Fetal dana dalak hücresi, virüs: herpesvirüs

(48)

Diğer Sitopatik etkiler (CPE)

Kromatin marjinasyon (Chromatin margination): Nükleusun kenarında ve çevresinde ince boyanmış halkaların oluşumu

Gimza boyama ile görüntüleme, hücre. Fetal dana dalak hücresi, virüs: herpesvirüs

(49)

Diğer Sitopatik etkiler (CPE)

Köpüksü dejenerasyon (vacuolization):

Geniş ve çok sayıda stoplazmik vakuollerin gözlemlenmesi.

Retroviruses, paramyxoviruses, and flaviviruses (pestiviruses) may cause vacuolization.

Vacuolization is difficult to visualize without staining.

Gimza boyama ile görüntüleme, hücre. Fetal dana dalak hücresi, virüs: Flavivirus

40X objective

(50)

Virüslerin Üreme Eğrisi

Tutunma ve giriş

Soyulma ve replikasyon

Biraraya gelme ve

olgunlaşma Çıkış

Hücre dışı virüs Hücre içi virüs

Zaman (saat)

En fe ksiy o z virüs / Hü cr e (Log10)

Eklips dönemi

Latent dönem

(51)