FİZİKİ HARİTALAMA
Dr. Ali Osman ADIGÜZEL
Genetik haritalamanın kısıtlamaları
• Genetik haritaların çözünürlüğü
değerlendirilmiş kross-over sayısına bağlıdır.
• Kross-over ların kromozom boyunca rastgele oluştuğu varsayımı kısmen doğru olduğu için genetik haritanın keskinliği sınırlıdır.
FİZİKİ HARİTALAMA TEKNİKLERİ
• Restriksiyon haritalama: DNA molekülü üzerindeki tanıma dizilerinin bağıl pozisyonlarını gösterir
• Floresan in-situ hibritleme (FISH): Bütün halindeki kromozomlara belirteci içeren probların hibritleştirilmesiyle belirtecin konumunun belirlenmesi
• Dizi etiketli bölge haritalaması (STS): DNA fragman koleksiyonlarının incelenmesiyle kısa dizilerin yerleşimlerinin haritalanması
Restriksiyon Haritalama
• RFLP ler polimorfik restriksiyon bölgelerinin yerleşimlerini belirleyebilir ama bir genomdaki restriksiyon bölgelerinin çok az kısmı polimorfiktir.
• Bundan dolayı daha detaylı bir haritalama için belirteç yoğunluğunun arttırılması adına restriksiyon bölgelerinin yerleşimleri belirlenmelidir.
Restriksiyon haritalama için temel metodoloji
• En basit yol farklı hedef dizileri tanıyan iki farklı restriksiyon enzimi ile bir DNA molekülü kesildiğinde oluşan parça
boyutlarını karşılaştırmaktır.
• Tek tek kesimler restriksiyon bölgelerinin sayısını belirler
• Restriksiyonların birbirine göre yerleşimleri ise çifte kesim ile belirlenir.
3,4’lük EcoRI
1,5’lik EcoRI
BamHI de boşta kalan BamHI + EcoRI de boşta kalan
SONUÇ: EcoRI 0,7 LİK BamHI’in ortasından kesiyor
3,4’lük EcoRI
1,5’lik EcoRI
Mevcut EcoRI kesimi 1,5’e tamamlanırsa
3,4’lük EcoRI
Mevcut EcoRI kesiminin 3,4’lük kısmı tamamlanırsa
1. olasılık
2. olasılık
İki olasılıktan hangisi doğru ?
Sorunun çözümü için kısmi kesim yapılmalıdır
Tam süreli reaksiyondaki durum
Kısmi kesimde durum
0,7 + 2
Bir çok kısmi kesim ürünü varsa çok sayıda parça analiz sırasında kirlilik yaratacaktır.
Bunun engellenmesi için bunun engellenmesi için kısmi kesim öncesinde DNA nın her iki ucuna radyoaktif ya da farklı tipte bir belirteç ilave edilir.
Böylelikle kısmi kesim sonrasında sadece işaretlenmiş uç bulunduranlar gözlemlenir.
Restriksiyon haritalamanın kısıtlamaları
6 ve daha kısa nükleotide sahip tanıma
bölgeleri ile restriksiyon haritalama bir DNA 50 kb’a yakın ya da daha kısa ise haritalama mümkündür fakat daha uzun ise çok fazla parçanın jelde ayırdedilmesi oldukça zordur.
OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü
Bu durum nasıl çözülür ?
Nadir kesiciler
Kimdir bu nadir kesiciler ?
• 7-8 nükleotidlik tanıma bölgesine sahip olan Rest. Endon. (SapI: 5’GCTCTTC-3’,
SgfI:GCGATCGC-3’)
• Tanıma dizileri nadir motif içeren Rest. End.
(Omurgalılarda 5’-CG-3’ nadirdir. Bunun yerine genellikle 5’-TG-3’ görülür. SmaI: 5’- CCCGGG-3’ , NotI: 5’-GCGGCCGC-3’
Nadir kesicilerin kısıtlamaları
• Çok büyük DNA parçalarının standart agaroz jel elektroforezinde ayrıştırılması zordur. Çünkü DNA
molekülünün boyu ve jelde ilerleme oranı arasında ilişki doğru orantılı olsa da bu orantı doğrusal değildir.
• Çözünürlük molekül büyüdükçe azalır.
• 50 kb den büyükler çok zor ayrıştırılır.
DNA moleküllerinin restriksiyon bölgelerinin doğrudan incelenmesi
• Optik haritalama ile incelenir: restriksiyon bölgeleri mikroskop altında kesilmiş DNA molekülüne bakılarak doğrudan incelenir.
• İnceleme için DNA nın kümelenmesi yerine iki ucu gerdirilmiş bir ip gibi olması gereklidir.
• DNA nın gerdirilmesi için iki farklı yöntem kullanılabilir:
• 1- Jel gerdirme
• 2- Moleküler tarama
Jel gerdirme
• Kromozomal DNA erimiş agarozda süspanse edilir.
• Restriksiyon enzimleri ile kaplı lam üzerine yerleştirilir.
• Agaroz katılaşır ve DNA gerilir
• Restriksiyon enzimlerinin aktivasyonu için Mg eklenir
• Mikroskop altında gözlemlenir.
Moleküler tarama
• Silikon kaplı bir lamel DNA çözeltisine batırılır
• Lamel saniyede 3 mm hızla sabit şekilde çekilir
• Çözeltiden çıkarıldıktan sonra lamel yüzeyi kurutulur.
• Restriksiyon kesimi yapılır
• DAPİ ile boyanır
FISH ile haritalama
• Bir kromozom ya da gerilmiş bir DNA molekülü üzerinde belirteçlerin doğrudan gözlemlenmesini sağlar.
• Belirteç bir DNA dizisidir ve floresan ışıma ile gözlemlenir.
Paradigma: Sentezlenen probun bağlanabilmesi için DNA nın tek zincirli hale gelmesi gerekir. Fakat kromozom
morfolojisi bozulmadan DNA nasıl denatüre edilir.
Kromozom denatürasyonu
• Bölünme aşamasındaki hücre bir mikroskop lamı üzerinde kurutulur.
• Formamid ile muamele
• Probun eklenmesi
• Sinyalin belirlenmesi
• Floresan sinyal sinyalin kısa kolunun ucuna olan uzaklığının ölçülmesi ile haritalanır (Flpter değeri)
Hücreler metafaz evresinde
görüntülenir
Dizi Etiketli Bölge Haritalaması (STS)
OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü
• 100-500 bç arasında uzunlukta
• Kolay tanınabilen
• Çalışılan kromozom yada genomda sadece tek bir kopyası olan kısa DNA dizileridir
• Bir DNA dizisinin STS olabilmesi için 2 özelliği bulunması gerekir
• 1. Dizisi bilinmeli
• 2. kromozom ya da genomun tamamında özgün bir yerde
STS haritalama için parça koleksiyonu oluşturma
Tüm parçalanma işlemlerinde 2 mavi belirteç hep yan yana olmuş
Yeşil belirteçler ise genellikle yanyana kalmış fakat bazı durumlarda ayrı parçalarda da gözlemlenmiş.
Parçalardaki STS’ler
• PCR analizleri ya da
• FISH ile tespit edilebilir.
• İfade edilen genler (EST, Cdna dan elde edilirler)
• SSLP (basit dizi uzunluk polimorfizmleriler
• Rastgele genomik diziler
STS’ler her bir kromozom için ayrı ayrı klon kütüphanesi oluşturularak taranabilir mi ?
AKIŞ SİTOMETRİSİ
• Hücreler bölünme aşamasında dikkatlice parçalanır
• Kromozomlar floresan bir boya ile boyanır
• Büyük kromozomlar daha fazla boya tutar, bundan dolayı daha fazla ışıma yapar ve daha ağır olurlar.
• Kromozom solüsyonu seyreltilir
• İnce bir diyaframdan geçirilerek damlacık akımı oluşturulur ve böylece her damla da bir kromozom olur.
• Sinyalin yoğunluğuna göre elektrik akımı uygulanarak ayrım gerçekleştirilebilir.
