DNA YI ÇALIŞMAK. Dr. Ali Osman ADIGÜZEL. OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

(1)

DNA’YI ÇALIŞMAK

Dr. Ali Osman ADIGÜZEL

OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

(2)

DNA çalışmalarının hızlanmasında başat rol üstlenen temel unsur nedir ?

1970’lerin başında enzimlerin deney tüpü içerisinde DNA moleküllerini işlemede kullanılabileceklerinin

belirlenmesi

(3)

Rekombinant DNA teknolojisini oluşturan

enzimlerin gerçekleştirebildiği işler nelerdir?

• DNA moleküllerini daha kısa parçalara ayırmak

• Bu kısa DNA parçalarını tekrar biraraya getirmek

• Farklı DNA parçalarını biraraya getirerek yeni kombinasyonlar yaratmak

• DNA moleküllerinin kopyalarını yapmak

(4)

DNA yada Gen Klonlama nedir?

• Genellikle tek gen içeren kısa DNA parçalarının plazmit yada virüs

kromozomu içerisine yerleştirip bir bakteri yada ökaryotik konakta çoğaltılması

(5)

DNA manipülasyonu aktivitesi bilinen ve kontrol edilebilen saflaştırılmış

enzimlerin varlığına bağlıdır

• Bu enzim grupları nelerdir ?

(6)

1- DNA POLİMERAZLAR

Mevcut bir DNA ya da RNA kalıbına

komplementer olan yeni polinükleotidleri sentezleyen enzimlerdir

(7)

2- NÜKLEAZLAR

İki nükleotidi birbirine bağlayan fosfodiester bağını kırarak DNA’yı parçalarlar

Nükleaz

(8)

3- LİGAZLAR

Tek bir molekülün iki ucundaki ya da iki farklı

molekülün uçlarındaki nükleotidler arasında

fosfodiester bağları sentezleyerek DNA moleküllerini

bir araya getirirler

(9)

4- UÇ DEĞİŞTİRME ENZİMLERİ

DNA moleküllerinin sonlarında değişiklik yaparak

bağlanma deneylerinin tasarlanmasına önemli bir

boyut katar ve DNA molekülünün radyoaktif ya da

diğer belirteçlerden uygun biriyle işaretlenmesini

sağlar

(10)

DNA POLİMERAZLAR

2

• DNA kopyalarının sentezlenmesine dayanan DNA çalışmalarında, PCR tekniğinde, DNA dizilemede ve DNA işaretlemede kullanılır.

• DNA’yı sentezleyen enzime DNA polimeraz ve

mevcut DNA ya da RNA molekülünü kopyalayan

enzime kalıba bağlı DNA polimeraz denir.

(11)

2

• Polimerazlar kalıp molekülden kopyalama işlemini baz eşleşmesi kuralına göre gerçekleştirirler.

• Yeni nükleotid her zaman 5’-3’ yönünde sentezlenir.

Doğada diğer doğrultuda sentez yapan bir DNA

polimeraz bilinmemektedir.

(12)

2

• DNA polimerazlar tek iplikli bir molekülü kalıp olarak tümüyle kullanamazlar.

• DNA sentezinin başlatılması için enzimin yeni nükleotid ekleyebileceği bir 3’ uç sağlayan çift iplikli kısa bir bölge olmalıdır.

• DNA kopyalanması reaksiyonu primer olarak görev alan ve genellikle 20 nükleotit uzunluğunda bir oligonükleotidin tek iplikli DNA ya bağlanmasıyla başlatılır

(13)

2

• DNA polimerazlar çok fonksiyonludurlar

• DNA’yı sentezleyebildikler gibi parçalayabilirler de, yani ekzonükleaz aktivitelerine de sahip olabilirler

• 3’-5’ ekzonükleaz akt: yeni sentezlenen DNA’nın 3’

ucundan nükleotidlerin çıkarılmasını sağlar. Buna hata okuma aktivitesi de denir.

• 5’-3’ ekzonükleaz akt: daha az yaygın olarak görülür. Sentez sonrasında DNA zincirinin 5’

kısmından nükl. uzaklaştırır

(14)

Araştırmalarda kullanılan DNA polimeraz çeşitleri

Kornberg polimeraz:

• E.coli DNA polimeraz I

• Hem 3’-5’ hem de 5’-3’ ekzonükleaz aktivitesi gösterir.

• DNA manüpülasyonunda kullanımı sınırlıdır (sıcaklık ve 5’- 3’ ekzonükleaz akt)

• Esas uygulama alanı DNA işaretlemedir.

Klenow polimeraz:

• Kornberg polimerazın değiştirilmiş bir çeşidi (proteaz ile 2 parçaya ayrıldı)

• 5’-3’ ekzonükleaz aktivitesinden mahrum bırakıldı

• Esas uygulama alanı DNA işaretlemedir.

(15)

Sekuenaz:

• T7 fajından elde edilmiş DNA polimeraz I’in modifiye halidir

• Dizileme çalışmalarında kullanılır Taq DNA polimeraz:

• Optimum çalışma sıcaklığı 72 °C’dir.

• Temel kullanım alanı PCR deneyleridir.

Revers transkriptaz:

• RNA bağımlı DNA polimerazdır.

• RNA dan DNA kopyaları üretirler (cDNA)

(16)

PCR ( P ol imer az Zi ncir R eak siy onu )

(17)

Video: PCR reaksiyonunun temeli

(18)

Video: PCR reaksiyonunun hazırlanması

(19)

Ticari Polimeraz Çeşitleri

(20)

(21)

(22)

Örnek: B. Mojavensis Asetil ksilan esteraz gen

dizisinin belirlenmesi

(23)

(24)

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

(30)

(31)

(32)

Örnek

İnsan hemoglobin subunit alpha 1 gen dizisinin

belirlenmesi

(33)

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

PCR tekniğinin en önemli sınırlaması nedir ?

Çoğaltılacak dizinin bir

kısmının bilinmesi gerekliliği.

(49)

Veri tabanlarında çoğaltılacak gen

ile ilgili doğrudan kullanabileceğiniz

bir veri yoksa

(50)

>BAO42836.1 cutinase [Saccharomonospora viridis]

MRIRRQAGTGARASMARAIGVMTTALAVLVGAVGGVAGAEVSTAQDNPYERGPDPTEDSIEAIRGPFSVATERVSSFASGFGGGTIYYPRE TDEGTFGAVAVAPGFTASQGSMSWYGERVASQGFIVFTIDTNTRLDQPGQRGRQLLAALDYLVERSDRKVRERLDPNRLAVMGHSMGG GGSLEATVMRPSLKASIPLTPWNLDKTWGQVQVPTFIIGAELDTIASVRTHAKPFYESLPSSLPKAYMELDGATHFAPNIPNTTIAKYVISWL KRFVDEDTRYSQFLCPNPTDRAIEEYRSTCPY

>BAI99230.2 esterase Est 119[Thermobifida alba AHK119]

MSVTTPRREASLLSRAVAVAAAAAATVALAAPAQAANPYERGPNPTESMLEARSGPFSVSEERASRLGADGFGGGTIYYPRENNTYGAIAI SPGYTGTQSSIAWLGERIASHGFVVIAIDTNTTLDQPDSRARQLNAALD

YMLTDASSSVRNRIDASRLAVMGHSMGGGGTLRLASQRPDLKAAIPLTPWHLNKSWRDITVPTLIIGADLDTIAPVSSHSEPFYNSIPSSTD KAYLELNNATHFAPNITNKTIGMYSVAWLKRFVDEDTRYTQFLCPGPR

TGLLSDVDEYRSTCPF

>pdb|4CG3|A TfCut2 T.fusca KW3 Chain A, CUTINASE

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMDIGINSDPXNPYERGPNPTDALLEARSGPFSVSEENVSRLSASGFGGGTIYYPRENNTYGAVAISPGYT GTEASIAWLGERIASHGFVVITIDTITTLDQPDSRAEQLNAALNHMIN

RASSTVRSRIDSSRLAVMGHSMGGGGSLRLASQRPDLKAAIPLTPWHLNKNWSSVTVPTLIIGADLDTIA PVATHAKPFYNSLPSSISKAYLELDGATHFAPNIPNKIIGKYSVAWLKRFVDNDTRYTQFLCPGPRDGLF GEVEEYRSTCPFYPNSSSVDKLAAALEHHHHHH

>ADV92527.1 cutinase 2, partial [Thermobifida cellulosilytica]

MANPYERGPNPTDALLEARSGPFSVSEERASRFGADGFGGGTIYYPRENNTYGAVAISPGYTGTQASVAWLGERIASHGFVVITIDTNTTLD QPDSRARQLNAALDYMINDASSAVRSRIDSSRLAVMGHSMGGGGTLRLASQRPDLKAAIPLTPWHLNKNWSSVRVPTLIIGADLDTIAPV LTHARPFYNSLPTSISKAYLELDGATHFAPNIPNKIIGKYSVAWLKRFVDNDTRYTQFLCPGPRDGLFGEVEEYRSTCPF

>AEV21261.1 LCC LC cutinase [uncultured bacterium]

MDGVLWRVRTAALMAALLALAAWALVWASPSVEAQSNPYQRGPNPTRSALTADGPFSVATYTVSRLSVSGFGGGVIYYPTGTSLTFGGIA MSPGYTADASSLAWLGRRLASHGFVVLVINTNSRFDYPDSRASQLSAALNYLRTSSPSAVRARLDANRLAVAGHSMGGGGTLRIAEQNPS LKAAVPLTPWHTDKTFNTSVPVLIVGAEADTVAPVSQHAIPFYQNLPSTTPKVYVELDNASHFAPNSNNAAISVYTISWMKLWVDNDTRY RQFLCNVNDPALSDFRTNNRHCQ

>sp|A0A0K8P6T7.1|PETH_IDESA RecName: Full=Poly(ethylene terephthalate) hydrolase; Short=PET hydrolase;

Short=PETase; AltName: Full=PET-digesting enzyme; Flags: Precursor

MNFPRASRLMQAAVLGGLMAVSAAATAQTNPYARGPNPTAASLEASAGPFTVRSFTVSRPSGYGAGTVYYPTNAGGTVGAIAIVPGYTAR QSSIKWWGPRLASHGFVVITIDTNSTLDQPSSRSSQQMAALRQVASLNGTSSSPIYGKVDTARMGVMGWSMGGGGSLISAANNPSLKA AAPQAPWDSSTNFSSVTVPTLIFACENDSIAPVNSSALPIYDSMSRNAKQFLEINGGSHSCANSGNSNQALIGKKGVAWMKRFMDNDTR YSTFACENPNSTRVSDFRTANCS

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

Primerler tasarlanırken kodon eğilimlerine ilişkin veri Codon Usage Database (https://www.kazusa.or.jp/codon/)’den elde edilebilir

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

NÜKLEAZLAR

2

• Endonükleazlar: DNA veya RNA moleküllerinin içindeki fosfodiester bağlarından kesim yapan nükleazlar

• Ekzonükleazlar: DNA veya RNA moleküllerinin uçlarından nükleotid uzaklaştıran nükleazlar

(66)

2

• Bazı nükleazlar RNA’ya özgün iken bazıları DNA’ya özgündürler

• Bazıları sadece tek iplikli DNA’da bazıları ise tek iplikli DNA’da iş görürler. Bazıları ise her ikisinde de çalışabilmektedir.

• En önemli nükleaz grubu restriksiyon endonükleazlar’dır.

• Restriksiyon endonükleazlar DNA moleküllerinin belirli konumlardan kesilmesini sağlar.

• Spesifik bir dizide DNA molekülüne bağlanan ve dizide veya yakınında çift iplikte kesim yapan enzimlerdir.

Nükleazların önemli özellikleri

(67)

2

Üç çeşit restriksiyon endonükleaz vardır

Tip I ve Tip III de kesim yapılan bölgelerde her zaman bir standartlık gözlemlenmez

Tip II restriksiyon endo- nükleazlar tanıma bölgesinden ya da ona çok yakın bir yerden her zaman aynı noktadan kesim yaparlar

(68)

Moleküler biyoloji çalışmalarında kullanılabilen 300 den fazla Tip II restriksiyon endonükleaz bulunmaktadır.

(69)

Bazı Tip II restriksiyon enzimleri dejenere tanıma bölgeleri içermektedir.

Bir çok enzim tanıma bölgeleri içerisinde kesim yaparken BsrBI gibi bazı enzimler ise tanıma bölgesi dışında kesim yapabilirler

(70)

Restriksiyon endonükleazlar DNA’yı iki farklı şekilde keserler

• Küt uçlar oluşturacak şekilde

• Yapışkan uçlar oluşturacak şekilde

(71)

Bazı yapışkan uç kesiciler 5’ çıkıntılar verirken bazıları ise 3’

çıkıntılar verir

(72)

Bazı yapışkan uç kesiciler 5’ çıkıntılar verirken bazıları ise 3’

çıkıntılar verir

(73)

Bazı restriksiyon enzimleri ise farklı tanıma bölgelerine sahip olsalar dahi aynı yapışkan uçları verebilirler

(74)

2

• Agaroz jel elektroforezi

Bir restriksiyon kesiminin sonuçlarının

incelenmesi

(75)

Video: Agarozun eritilmesi ve agaroz jellerin

hazırlanması

(76)

Video: Örneklerin yüklenmesi ve jelin

yürütülmesi

(77)

2

Bazı durumlarda ilgilenilen bir gen içindeki dizinin bir kısmı biliniyorsa o genin bulunduğu kesim parçası Southern hibritleme ile gözlemlenebilir

(78)

Video: Southern Blotlama

(79)

Video: Southern Blotlama deneyinin yapılışı

(80)

DNA LİGAZLAR

2

• Doğal görevi bir nükleotid zincirindeki bağlantısız nükleotidler arasında fosfodiester bağlarının kurulması

• Moleküler biyoloji çalışmalarındaki asıl kullanım amacı ise restriksiyon endonükleazlar ile kesilen DNA parçalarının birbirine bağlanmasıdır.

• Kullanılan ligaz türüne bağlı olarak reaksiyon karışımına ATP ya da NAD ilave edilmelidir.

• Sentez sadece birleştirilecek iki ucun şanseseri birbirine yeterince yaklaşmasıyla gerçekleşir.

(81)

DNA ligazın hücre içindeki rolü

(82)

DNA ligazın hücre dışı rolü

(83)

DNA ligaz ile bağlanma deneylerinde yapışkan

uçlu bağlanma daha etkindir

(84)

Küt uçlu DNA’ların bağlanması nasıl daha etkin hale getirilir

• Bağlayıcılar ya da adaptör olarak adlandırılan kısa çift iplikli moleküllerin DNA’ya eklenmesi

• Homopolimer kuyruk eklenmesi

(85)

UÇ DEĞİŞTİRME ENZİMLERİ

2

• Terminal deoksinükleotidil transferaz

• Alkalin fosfataz

• T4 polinükleotid kinaz

(86)

2

• Kalıba bağlı olmayan bir DNA polimerazdır.

• Baz eşleşmesi olmaksızın DNA polinükleotidi sentezleyebilir

• Homopolimer kuyruk eklenmesinde kullanılır.

Terminal deoksinükleotidil transferaz

(87)

2

• DNA molekülünün 5’ ucundan bulunan fosfat gruplarını uzaklaştırır.

• 5’ fosfat grubu taşıyan iki uç birbirine bağlanabilir

• Fosfatlı bir uç fosfatsız bir uca bağlanabilir

• Her ikisi de 5’ fosfatsız uçlar birbirine bağlanamazlar

Alkalin fosfataz

• Alkalin fosfatazın tam tersi etkinlik gösterir

• 5’ uçlara fosfat ekler

T4 polinükleotid kinaz

(88)

DNA YI ÇALIŞMAK. Dr. Ali Osman ADIGÜZEL. OMÜ I Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü