T.C.
ERCĐYES ÜNĐVERSĐTESĐ TIP FAKÜLTESĐ
BĐYOKĐMYA ANABĐLĐM DALI
DĐYABETĐK AYAK GELĐŞĐMĐNDE PERĐFERAL ĐSKEMĐ, OKSĐDATĐF STRES VE ENDOTEL DĐSFONKSĐYONUNUN
DEĞERLENDĐRĐLMESĐ
TIPTA UZMANLIK TEZĐ
Dr. DĐDEM BARLAK KETĐ
KAYSERĐ -2012
T.C.
ERCĐYES ÜNĐVERSĐTESĐ TIP FAKÜLTESĐ
BĐYOKĐMYA ANABĐLĐM DALI
DĐYABETĐK AYAK GELĐŞĐMĐNDE PERĐFERAL ĐSKEMĐ, OKSĐDATĐF STRES VE ENDOTEL DĐSFONKSĐYONUNUN
DEĞERLENDĐRĐLMESĐ
TIPTA UZMANLIK TEZĐ
Dr. DĐDEM BARLAK KETĐ
Bu Çalışma; Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Tarafından TST – 09 – 727 Kodlu Proje ile Desteklenmiştir
Danışman
Prof. Dr. SABAHATTĐN MUHTAROĞLU
KAYSERĐ -2012
ĐÇĐNDEKĐLER
KISALTMALAR ... i
ŞEKĐL LĐSTESĐ ... iii
TABLO LĐSTESĐ ... iv
ÖZET ... v
ABSTRACT ... vii
1. GĐRĐŞ VE AMAÇ ... 1
2. GENEL BĐLGĐLER ... 3
2.1. DĐYABET. ... 3
2.1.1. Diyabetin Etiyolojik Sınıflaması. ... 3
2.1.2. Diyabet Tanısı. ... 4
2.1.3. Diyabetin Kronik Komplikasyonları. ... 4
2.2. DĐYABETĐK AYAK. ... 5
2.2.1. Epidemiyoloji ... 5
2.2.2. Diyabetik Ayak Ülserlerinin Sınıflandırılması... 5
2.2.3. Etiyoloji ve Patogenez ... 5
2.3. OKSĐDATĐF STRES VE DĐYABETĐN KRONĐK KOMPLĐKASYONLARI ... 7
2.4. ANTĐOKSĐDAN SAVUNMA SĐSTEMLERĐ. ... 12
2.4.1. Süperoksit Dismutaz.. ... 12
2.4.1.1. Ekstraselüler Süperoksit Dismutaz.. ... 13
2.4.1.2. Diyabet ve Ekstraselüler Süperoksit Dismutaz.. ... 14
2.4.2. Paraoksonaz 1 ... 14
2.5. LĐPĐD PEROKSĐDASYONU. ... 17
2.5.1. Malondialdehit. ... 18
2.5.2. Okside LDL. ... 18
2.5.3. Küçük Yoğun LDL ... 20
2.6. DĐYABET VE ENDOTEL DĐSFONKSĐYONU... 22
2.6.1. Asimetrik Dimetilarjinin ... 23
2.6.2. Nitrik Oksit. ... 24
2.6.3. Endotelin-1.. ... 26
2.6.4. Đskemi Modifiye Albümin ... 27
3. GEREÇ VE YÖNTEM ... 29
4. BULGULAR ... 48
5. TARTIŞMA ... 58
6. SONUÇLAR ... 72
7. KAYNAKLAR ... 74
8. EKLER ... 85
9. TEZ ONAY SAYFASI ... 92
i
KISALTMALAR ADMA : Asimetrik dimetilarjinin AGE : Đleri glikasyon son ürünleri
Apo A1 : Apolipoprotein A1 BH4 : Tetrahidrobiopterin CE : Kolesterol esteri
CETP : Kolesterol ester transfer protein
CRP : C-reaktif protein
DDAH : Dimetilarjinin dimetilaminohidrolaz EC-SOD : Ekstraselüler süperoksit dismutaz
eNOS : Endotelyal nitrik oksit sentaz
ET-1 : Endotelin-1
ETZ : Elektron transport zinciri
FADH2 : Redükte flavin adenin dinükleotid G6PDH : Glukoz 6-fosfat dehidrogenaz GAPDH : Gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz GFAT : Glutamin: fruktoz 6-fosfat amidotransferaz HDL : Yüksek dansiteli lipoprotein
HL : Hepatik lipaz
HO˙ : Hidroksil radikali H2O2 : Hidrojen peroksit
ĐMA : Đskemi modifiye albümin
iNOS : Đndüklenebilir nitrik oksit sentaz LDL : Düşük dansiteli lipoprotein L-NMMA : NG-monometil L-arjinin LPL : Lipoprotein lipaz
MDA : Malondialdehit
NADH : Redükte nikotinamid adenin dinükleotid NADPH : Redükte nikotinamid adenin dinükleotid fosfat NF-KB : Nükleer faktör kappa beta
NO˙ : Nitrik oksit
NO2˙ : Nitrojen dioksit
NOS : Nitrik oksit sentaz
O2 : Moleküler oksijen
O2˙ : Süperoksit
ONOO¯ : Peroksinitrit oxLDL : Okside LDL
PAF-AH : Platelet aktive edici faktör asetil hidrolaz PAI-1 : Plazminojen aktivatör inhibitör-1
PARP : Poli (ADP-riboz) polimeraz
PKC : Protein kinaz-C
PON : Paraoksonaz
PRMT : Protein arjinin N-metiltransferaz
PVH : Periferik vasküler hastalık
R˙ : Lipid radikali
RH : Doymamış yağ asidi
RNS : Reaktif nitrojen türleri RO˙ : Alkoksil radikali
ii ROO˙ : Lipid peroksil radikali
ROOH : Lipid hidroperoksit
ROS : Reaktif oksijen türleri
SAA : Serum amiloid A
sdLDL : Küçük yoğun LDL sdLDL-C : Küçük yoğun LDL-C SDMA : Simetrik dimetilarjinin SOD : Süperoksit dismutaz TC : Total kolesterol
TG : Trigliserid
TGF-β1 : Transforming growth faktör-β1
VEGF : Vasküler endotelyal growth faktör VKĐ : Vücut kütle indeksi
VLDL-1 : Trigliseritten zengin çok düşük dansiteli lipoprotein
iii
ŞEKĐL LĐSTESĐ
Sayfa
Şekil 1: Etiyoloji ve Patogenez ... 6
Şekil 2: ETZ’de Hiperglisemi Aracılı Artmış Süperoksit Oluşumu ... 8
Şekil 3: Hiperglisemi Aracılı Oksidatif Stresin Mekanizması . ... 9
Şekil 4: AGE Oluşumuna Neden Olan Yollar ... 10
Şekil 5: PKC Aktivasyonu ve Sonuçları ... 11
Şekil 6: EC-SOD’un Yapısı ... 13
Şekil 7: Diyabette EC-SOD Glikasyonunun Sonuçları ... 14
Şekil 8: Paraoksonazın Yapısı ... 15
Şekil 9: Tip 2 Diyabette HDL’nin Antioksidan Fonksiyonunun Kaybı ... 16
Şekil 10: Lipid Peroksidasyonu Zincir Reaksiyonları ... 17
Şekil 11: LDL Oksidasyon Mekanizmaları ... 18
Şekil 12: Aterojenik Lipoprotein Fenotipin Metabolik Temeli ... 21
Şekil 13: ROS ve Endotel Disfonksiyonu... 23
Şekil 14: Metilarjininlerin Yapısı ve Metabolizması ... 24
Şekil 15: Endotelinlerin Moleküler Yapısı ... 26
Şekil 16: ĐMA Oluşumuna Yönelik Öne Sürülen Mekanizma ... 27
Şekil 17: Albümin Kobalt Bağlama Testi ... 28
Şekil 18: SOD Standart Grafiği ... 33
Şekil 19: MDA Standart Grafiği ... 36
Şekil 20: oxLDL Standart Grafiği ... 37
Şekil 21: Kontrol Grubuna Ait ADMA Kromatogram Örneği ... 40
Şekil 22: Diyabetik Ayak Grubuna Ait ADMA Kromatogram Örneği ... 40
Şekil 23: Griess Reaksiyonu ... 41
Şekil 24: Nitrat Standart Grafiği ... 42
Şekil 25: ET-1 Standart Grafiği ... 45
Şekil 26: Logaritmik ET-1 Standart Grafiği ... 45
Şekil 27: AÖ ve AS ĐMA Değerlerinin Karşılaştırılması ... 55
Şekil 28: Diyabetik Ayak Grubunda PON1 ile MDA Regresyon Eğrisi ... 55
Şekil 29: Diyabetik Ayak Grubunda HDL-C ile CRP Regresyon Eğrisi ... 56
Şekil 30: Diyabetik Ayak Grubunda ADMA ile eGFR Regresyon Eğrisi ... 56
Şekil 31: Diyabetik Ayak Grubunda MDA ile SOD Regresyon Eğrisi ... 56
iv
TABLO LĐSTESĐ
Sayfa
Tablo 1: Reaktif Oksijen Türleri ... 7
Tablo 2: Peroksinitrit, RNS ve LDL Oksidasyonu ... 19
Tablo 3: Çalışma Gruplarının Yaş, VKĐ Değerleri ve Cinsiyet Durumu ... 49
Tablo 4: Hasta Gruplarının Klinik Bulguları ... 49
Tablo 5: Diyabetik Ayak Grubunun Wagner Sınıflamasına Göre Dağılımı .. 50
Tablo 6: Çalışma Gruplarının Rutin Analiz Bulguları ... 51
Tablo 7: Ampute Olan ve Olmayan Grupların Rutin Analiz Bulguları ... 52
Tablo 8: Hasta ve Kontrol Gruplarının Biyokimyasal Çalışma Bulguları ... 53
Tablo 9: Ampute Olan ve Olmayan Grupların Biyokimyasal Çalışma Bulguları ... 54
v
DĐYABETĐK AYAK GELĐŞĐMĐNDE PERĐFERAL ĐSKEMĐ, OKSĐDATĐF STRES VE ENDOTEL DĐSFONKSĐYONUNUN
DEĞERLENDĐRĐLMESĐ ÖZET
Amaç: Diyabetin kronik komplikasyonlarıyla oksidatif stres arasındaki ilişki, aşırı miktarda üretilen reaktif oksijen türleri (ROS)’nin neden olduğu doku hasarının, diyabetik ayak patogenezinde de önemli rol oynadığı görüşünü desteklemektedir. Bu hastalarda oksidatif stresin ortaya konulması, patogenezle ilişkili bazı mekanizmaların aydınlatılmasına ve yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine öncülük edebilir.
Ateroskleroz ve iskemi, diyabetik ayak gelişimi ve amputasyon riskini artıran önemli faktörlerdir.
Bu çalışma, diyabetik ayak patogenezinde oksidatif stresin ortaya konulması, yeni risk faktörlerinin belirlenmesi, hastaların ateroskleroz ve iskemi yönünden takibinde yeni belirteçlerin kullanılabilirliğini değerlendirmek amacıyla planlandı.
Gereç ve Yöntem: Diyabetik ayak komplikasyonu bulunmayan 30 diyabetli ile diyabetik ayak tanısı alan 30 hasta ve kontrol grubu olarak da 30 sağlıklı gönüllü çalışmaya dahil edildi. Amputasyon uygulanan hastalardan amputasyon öncesi ve sonrası toplam iki, diğer diyabetli hastalardan ve kontrollerden sadece bir kez kan alındı. Serum örneklerinde süperoksit dismutaz (SOD), paraoksonaz 1 (PON1) aktiviteleri ile malondialdehit (MDA), okside LDL (oxLDL), küçük yoğun LDL-C (sdLDL-C), asimetrik dimetilarjinin (ADMA), nitrik oksit (NO), iskemi modifiye albümin (ĐMA) ve plazmada endotelin-1 (ET-1) düzeyleri ölçüldü.
Bulgular: Serum PON1 aktivitesinin diyabetli grupla karşılaştırıldığında, diyabetik ayak tanısı alan hastalarda azaldığı; ADMA, oxLDL, NO, % sdLDL-C, MDA ve ĐMA düzeylerinin arttığı belirlendi. Kontrole göre hasta gruplarında SOD aktivitesi azalırken, diyabetlilerde ET-1 düzeylerinin arttığı, ayrıca amputasyon uygulanan hastalarda amputasyon sonrası ĐMA düzeylerinde azalma olduğu görüldü.
Sonuç: Yüksek MDA, düşük PON1 ve SOD aktiviteleriyle yansıtıldığı gibi oksidatif
vi
stresin diyabetik ayak patogenezinde önemli rol oynadığı; yüksek ADMA, NO, oxLDL, % sdLDL-C düzeylerinin ilerlemiş aterosklerozla ilişkili olabileceği; artmış ĐMA değerlerinin periferal iskemiyi yansıtan önemli bir belirteç olarak kullanılabileceği söylenebilir. Bu hastaların ateroskleroz ve periferal iskemi yönünden takibi; diyabetik ayak ve amputasyonların önlenmesi açısından önemli olabilir. Bütün bu parametrelerin birlikte çalışılarak, aralarındaki ilişkinin değerlendirildiği bu ilk çalışmayla literatüre katkı sağlanacağı düşünülebilir.
Anahtar kelimeler: Diyabetik ayak, iskemi modifiye albümin, oksidatif stres, periferik arter hastalığı
vii
INVESTIGATION OF PERIPHERAL ISCHEMIA, OXIDATIVE STRESS AND ENDOTHELIAL DISFUNCTION DURING DIABETIC FOOT
DEVELOPMENT ABSTRACT
Aim: There is a clear relationship between chronic diabetic complication and oxidative stress and this process is valid in tissue damage by production excess reactive oxygen species (ROS) which plays an important role in pathogenesis of diabetic foot.
The recent findings of oxidative stress in these patients, illuminates some mechanism of pathogenesis and mediate the investigation of new treatment methods.
Atherosclerosis and ischemia are significant factors in diabetic foot investigation and increasing of amputation risk.
The aim of this study is putting the importance of oxidative stress in diabetic foot pathogenesis, determination of new risk factors and accordingly putting out of new markers for the atherosclerosis and ischemia.
Materials and methods: 30 diabetic patients without diabetic foot complication and 30 diabetic patients with diabetic foot and also 30 healthy volunteers as a control group have placed in this study. The blood was taken twice in amputation group before and after amputation and just once in diabetic and control groups. Only ET-1 was analysed in plasma specimen and rest of the parameters superoxide dismutase (SOD), paraoxonase 1 (PON1) activities, malondialdehyde (MDA), oxidized LDL (oxLDL), small dense LDL-C (sdLDL-C), asymmetric dimethylarginine (ADMA), nitric oxide (NO), ischemia modified albumin (IMA) were analysed in serum samples.
Results: When diabetic patients compared with patient also have diabetic foot, it was determined that serum PON1 decreased; however ADMA, oxLDL, NO, % sdLDL-C, MDA and IMA values increased. When the control group was compared with patient groups, SOD activity was decreased. However, plasma ET-1 levels were found to be increased in diabetics, in addition IMA levels were decresead in patients with diabetics foot after amputation.
Conclusion: As reflected by high levels of MDA, low activities of PON1 and SOD, oxidative stress may play significant role in diabetic foot pathogenesis. High levels of ADMA, NO, oxLDL and % sdLDL-C may have connection with advanced aherosclerosis and increased IMA levels can be used as a marker in peripheral
viii
ischemia. The follow up of patients with atherosclerosis and peripheral ischemia important to be both diabetic foot and in addition amputation.
It is important to say that this is the first research that analysis all of these parameter alltogether and evaluate the relationship between them and thus it provide new contribution to literature.
Key Words: Diabetic foot, ischemia modified albumin, oxidative stress, peripheral arterial disease
1
1. GĐRĐŞ VE AMAÇ
Diyabet; yaşam alışkanlıklarındaki değişiklikler nedeniyle görülme sıklığı giderek artan ve ciddi komplikasyonlarla seyreden, kronik hastalıklardan biri olarak değerlendirilmektedir (1). Diyabetli hastaların % 15’inin, yaşamlarının bir döneminde ayak ülseriyle karşılaştığı bildirilmektedir (2). Diyabetik ayak, travmatik olmayan alt ekstremite amputasyonlarının en sık nedenidir. Hospitalizasyon süresinin uzun ve tedavi maliyetinin yüksek oluşu, bu komplikasyonu önemli yapan diğer faktörlerdir (3,4).
Diyabetli hastalarda reaktif oksijen türleri (ROS)’nin ve lipid peroksidasyonunun önemli oranda arttığı, uzamış oksidatif stresin ve antioksidan kapasitede görülen değişikliklerin diyabetin kronik komplikasyonlarıyla ilişkili olduğu vurgulanmaktadır (5,6).
Büyüklük, dansite, metabolik davranış ve aterojenite yönünden farklılık gösteren düşük dansiteli lipoprotein (LDL) alt fraksiyonları içinde, küçük yoğun LDL (sdLDL)’nin kardiyovasküler hastalık riskini artırdığı bilinmektedir (7). Artmış trigliserid, azalmış yüksek dansiteli lipoprotein kolesterol (HDL-C) düzeyleri ve sdLDL baskınlığıyla karakterize dislipidemi, diyabette yaygın olarak görülmektedir (8). Diyabetli hastalarda lipid profilini, düşük dansiteli lipoprotein kolesterol (LDL- C) düzeyleri yerine LDL oksidasyonunu yansıtan okside LDL (oxLDL) üzerinden değerlendirmenin daha anlamlı olduğu belirtilmektedir (9).
2
Son yıllarda diyabetli hastalarda, nitrik oksit sentaz (NOS)’ın endojen yarışmalı inhibitörü olan asimetrik dimetilarjinin (ADMA) ve nitrik oksit (NO) ile ilgili çalışmalar dikkat çekmektedir (10,11). Kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde rol oynadığı yönünde giderek artan bilgiler ADMA’yı, yeni tedavi yaklaşımları için hedef noktası haline getirmiştir (12).
Diyabetin kronik komplikasyonlarıyla oksidatif stres arasındaki ilişkiyi gösteren çok sayıda çalışma olmasına rağmen, patogenezinde periferal iskemi ve periferik nöropatinin rol oynadığı (3) diyabetik ayak komplikasyonu olan hastalarda, oksidatif stresin değerlendirildiği çalışmalar sınırlı sayıdadır. Ayrıca yapılan literatür taramasına göre bu hastalarda lipid profilinin, sdLDL-C üzerinden değerlendirildiği hiçbir çalışma bulunmamaktadır.
Bu çalışmada diyabetik ayak patogenezinde; oksidatif stresin varlığı, lipid peroksidasyonu yıkım ürünlerinden biri olan malondialdehit (MDA) düzeyleri ile antioksidan enzimler olarak bilinen paraoksonaz 1 (PON1) ve süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi üzerinden değerlendirilecek; lipid profilindeki değişiklikleri belirlemek amacıyla sdLDL-C, oxLDL düzeyleri tayin edilecektir. Endotel disfonksiyonunun yeni bir belirteci olarak tanımlanan ADMA (12) ile birlikte NO ve endotelin-1 (ET-1) düzeyleri de ölçülecektir.
Bir iskemi belirteci olarak akut koroner sendromda önemi anlaşılan (13) iskemi modifiye albümin (ĐMA)’in, diyabetik ayak komplikasyonuyla ilişkisi sorgulanacak ve periferal iskemi açısından önemi değerlendirilecektir. Aynı zamanda diyabetli hastaların periferik ateroskleroz yönünden takibinde, biyokimyasal anlamda mevcut olan gereksinimin giderilmesinde, serum ADMA ve oxLDL düzeylerinin yeni bir belirteç olarak kullanılabilirliği araştırılacaktır.
Diyabetik ayak komplikasyonu olan hastalarda daha önce çalışılmayan sdLDL-C ile ĐMA düzeylerinin ve diğer tüm parametrelerin birlikte değerlendirildiği bu ilk çalışmayla patogenezde rol oynayan bazı mekanizmaların aydınlatılması ve yeni risk faktörlerinin belirlenmesi amaçlanmaktadır.
3
2. GENEL BĐLGĐLER
2.1. DĐYABET
Diyabet; insülin eksikliği ve/veya insülin etkisine cevabın bozulması sonucu oluşan, hiperglisemi ile karakterize; özellikle göz, böbrek, sinir, kalp ve damarlar olmak üzere birçok organda zamanla hasar, fonksiyon bozukluğu ve yetmezliğe neden olan metabolik bir hastalıktır (14).
Tüm dünyada sık görülen kronik hastalıklardan biri olup; diyabetli sayısının 2030 yılında 439 milyona ulaşacağı ve gelişmekte olan ülkelerde diyabetli sayısında 2010- 2030 yılları arasında % 69, gelişmiş ülkelerde ise % 20 artış olacağı tahmin edilmektedir (1).
2.1.1. Diyabetin Etiyolojik Sınıflaması (14)
1-Tip 1 diyabet: Pankreasın β hücrelerinin yıkımı sonucu mutlak insülin eksikliği ile kendini gösterir.
• Đmmün tip
• Đdiyopatik tip
2-Tip 2 diyabet: Đnsülin direnci zemininde gelişen ilerleyici insülin sekresyon bozukluğu ile karakterizedir.
3-Diğer özel tipler
• β hücre fonksiyonunun genetik bozuklukları
• Đnsülin etkisinin genetik bozuklukları
• Ekzokrin pankreas hastalıkları
• Endokrinopatiler
4
• Enfeksiyonlar
• Đmmün aracılı nadir diyabet formları
• Diyabetle ilişkili genetik sendromlar 4-Gestasyonel diyabet
2.1.2. Diyabet Tanısı (14)
• Hemoglobin A1C (HbA1C)’nin ≥ %6.5 olması
Bu test Uluslararası Glikohemoglobin Standardizasyon Proğramı tarafından sertifikalı ve Diyabet Kontrol ve Komplikasyon Çalışması ile standardize edilmiş metot kullanan laboratuvarlarda yapılmalıdır.
• Açlık plazma glukozunun ≥ 126 mg/dL olması
Açlık en az 8 saat kalori alımının olmaması olarak tanımlanır.
• Oral glukoz tolerans testi sırasında 2. saat plazma glukozunun ≥ 200 mg/dL olması
• Klasik hiperglisemi semptomları olan hastalarda, rastgele plazma glukozunun
≥ 200 mg/dL olması
Bu kriterlerden herhangi birinin varlığı diyabet tanısı koydurmaktadır.
2.1.3. Diyabetin Kronik Komplikasyonları (3) Mikrovasküler komplikasyonlar
• Diyabetik retinopati
• Diyabetik nefropati
• Diyabetik nöropati
Makrovasküler komplikasyonlar: Diyabetli hastalarda morbidite ve mortalitenin en önemli nedeni kardiyovasküler hastalıklardır.
• Koroner arter hastalığı
• Serebrovasküler hastalıklar
• Periferik arter hastalığı
5 2.2. DĐYABETĐK AYAK
Diyabetik ayak; yaşam kalitesinin bozulmasına, morbidite artışına, yüksek tedavi maliyetlerine ve alt ekstremite amputasyonlarına yol açması nedeniyle diyabetin önemli komplikasyonları arasında yer almaktadır (3).
2.2.1. Epidemiyoloji
Diyabetli hastaların % 15’i yaşamlarının bir döneminde diyabetik ayak ülseriyle karşılaşmakta olup; yıllık insidansın % 1-4, prevalansın ise % 5-10 arasında olduğu belirtilmektedir (2,15). Diyabetik ayak, travmatik olmayan alt ekstremite amputasyonlarının en sık nedenidir ve amputasyonu izleyen ilk yıl için mortalite oranının % 13-40, üç yıl için % 35-65, beş yıl için % 39-80 olduğu bildirilmektedir (4,15).
2.2.2. Diyabetik Ayak Ülserlerinin Sınıflandırılması
Diyabetik ayak ülserleri için günümüzde kullanılmakta olan sınıflandırmalardan biri de Wagner (16) tarafından tasarlanmıştır. Bu sınıflamaya ayak ülseri olmayan ancak risk faktörü taşıyan olgular da dahil edilmekte, mevcut ülserler enfeksiyon ve/veya gangrenin varlığına göre 1’den 5’e kadar derecelendirilmektedir.
0. derece: Yüksek riskli grup, ayakta ülser yok 1. derece: Epidermise sınırlı yüzeyel ülser varlığı
2. derece: Dermis, kas, tendon ve ligamentlere kadar ulaşabilen enfeksiyon mevcut, osteomyelit bulgusu yok
3. derece: Derin yumuşak doku enfeksiyonu ve osteomyelit varlığı 4. derece: Ayağın distalinde lokalize gangren
5. derece: Geniş gangren
2.2.3. Etiyoloji ve Patogenez (Şekil 1) (4)
Diyabetik ayak oluşumundan başlıca; periferik nöropati, periferik vasküler hastalık ve travmalar sorumlu tutulmaktadır (3).
Nöropati: Diyabette özellikle alt ekstremitelerde simetrik yerleşim gösteren duyusal nöropati, ayağı travmalara karşı koruyan duyuların kaybına neden olmakta ve tekrarlayan travmaların fark edilmesini engelleyerek ülser gelişimine zemin hazırlamaktadır (2).
Motor nöropati sonucu ayağın intrensek kaslarında oluşan zayıflık, fleksör ve ekstensör kaslar arasında dengesizlik oluşturmakta; bu değişiklikler ayak parmaklarında pençeleşme ve plantar metatars başlarında belirginleşmeyle
6
sonuçlanmaktadır (4). Vücut ağırlığının, anatomik özellikleri yük taşımaya uygun olmayan başta metatars başları olmak üzere bu yeni ağırlık noktalarına kayması, basınca maruz kalan bu bölgelerde kallus oluşumunu kolaylaştırmakta ve kallus tabakasının altında kalan sağlam dokuda bası sonucu nekroz gelişebilmektedir (2).
Alt ekstremitenin sempatik innervasyonunda bozukluk; terlemede azalma, deride kuruluk ve sonuçta ayakta fissür oluşumuna neden olarak mikroorganizmaların girişini ve enfeksiyon gelişimini kolaylaştırmaktadır (4).
Şekil 1. Etiyoloji ve Patogenez
Sempatik innervasyon bozukluğu sonucu oluşan arteriyovenöz şantlar, kan akımının kapiller yatağa ulaşmasını engelleyerek dokunun oksijen ve besin desteğini azaltmakta; ayrıca ayak kemiklerinde osteopeni gelişimini tetikleyerek hafif bir travma ile kolayca kırık gelişimine neden olmaktadır. Tekrarlayan kırıklar ayağın yapısını daha da bozarak tarsal kemiklerde destrüksiyon, eklemlerde sublüksasyon ve sonuçta ülser gelişimi için büyük risk taşıyan Charcot ayağı olarak da adlandırılan diyabetik nöroartropatinin gelişimi ile sonuçlanabilmektedir (2).
AMPUTASYON DĐYABETĐK AYAK ÜLSERĐ Bası
noktalarında değişiklik Deformite
OTONOM
Kallus oluşum Artmış plantar basınç
Koruyucu duyunun kaybı
NÖROPATĐ
MOTOR DUYUSAL
Kas atrofisi Terleme kaybı
Kuru deri
Sempatik tonus↓
Charcot
Yapısal deformite
VASKÜLER HASTALIK
Mikrovasküler Makrovasküler
DĐYABET
YAPISAL Kapiller bazal membran kalınlaşması
FONKSĐYONEL Arteriyovenöz şant
YAPISAL Ateroskleroz
Đskemi
Đskemi
Enfeksiyona bozulmuş cevap
Travma
7
Periferik vasküler hastalık (PVH): Hem makrovasküler (ateroskleroz) hem de mikrovasküler hastalık (bazal membran kalınlaşması, otonom nöropati) dokuda iskemiye neden olmaktadır (2).
Diyabetik hastalarda ateroskleroz daha sık gözlenmekte, daha genç yaşta ortaya çıkmakta ve daha hızlı progresyon göstermektedir (3). Daha ziyade diz altındaki damarlarda (tibial ve peroneal) segmental tutulum gösterirken, ayak damarları sıklıkla korunmaktadır (17). Ülser varlığında PVH; yara iyileşmesinde gecikmeye, enfeksiyonu tedavi etmeye yönelik girişimlerin başarısız olmasına ve amputasyon riskinde artışa neden olmaktadır (4).
2.3. OKSĐDATĐF STRES VE DĐYABETĐN KRONĐK KOMPLĐKASYONLARI Organizmada serbest radikallerin oluşum hızı ile ortadan kaldırılma hızı bir denge içerisindedir. Bu dengenin serbest radikal oluşumunda artma ve/veya ortadan kaldırılma hızında azalma sonucu bozulması oksidatif stres olarak tanımlanır (18).
Literatürde oksijen radikallerini ve radikal olmayan diğer türleri tanımlamak için farklı terminolojiler bulunmakla birlikte, reaktif oksijen türleri (ROS), sadece oksijen radikallerini değil aynı zamanda oksijenin radikal olmayan türevlerini de içeren ortak bir tanımlayıcı olması nedeniyle daha çok kullanılmaktadır (Tablo 1) (19).
Tablo 1. Reaktif Oksijen Türleri
Radikal türevler Radikal olmayan türevler Süperoksit (O2˙)
Hidroksil (HO˙) Hidroperoksil (HO2˙) Peroksil (ROO˙) Alkoksil (RO˙)
Singlet oksijen (1O2) Ozon (O3)
Hidrojen peroksit (H2O2) Lipid hidroperoksit (ROOH) Hipoklorik asit (HOCl) Peroksinitrit (ONOO¯)
Nitrik oksit (NO˙) ve nitrojen dioksit (NO2˙) ise reaktif nitrojen türleri (RNS) içinde yer almaktadır (19).
Hücrelerde üretilen O2˙ ve H2O2’den, Fe/Cu gibi metallerin varlığında Fenton ve Haber-Weiss reaksiyonlarıyla HO˙; O2˙ ve NO’dan, ONOO¯ gibi çok daha toksik oksidanlar oluşabilmektedir (20).
Oksidatif stres, diyabet ve diyabetle ilişkili komplikasyonların patogenezinde önemli rol oynamaktadır (21).
8
Đnsülin eksikliği ve/veya insülin direnci nedeniyle, yağ ve kas dokusu gibi insüline bağımlı dokular tarafından hücre içine glukoz girişinin sağlanamaması, kan glukoz düzeyinin yüksek kalmasına neden olur (22). Glukoz girişi insüline bağımlı olmayan hücrelerde, artmış glukoz oksidasyonu sonucu oluşan redükte nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) ve flavin adenin dinükleotid (FADH2), elektronlarını elektron transport zinciri (ETZ)’ne aktarır. Elektronların enerjisi, mitokondriyal matriksten membranlar arası boşluğa proton pompalamak ve böylece voltaj farkı oluşturmak için kullanılır. Voltaj farkı kritik bir düzeye ulaşıncaya kadar artmaya devam eder, ancak bir noktadan sonra artık kompleks III’e elektron transferi gerçekleşemez ve koenzim Q’ya geri dönen elektronlar, moleküler oksijen (O2)’e aktarılarak O2˙ ve takiben diğer ROS’ların oluşumunda artışa neden olur (Şekil 2) (23).
Şekil 2. ETZ’de Hiperglisemi Aracılı Artmış Süperoksit Oluşumu
Hipergliseminin neden olduğu artmış mitokondriyal ROS, DNA’da hasar oluşturarak poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP)’ı aktive eder. PARP, ADP-riboz polimerleri oluşturarak, gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH)’ın inhibisyonuna neden olur (24). Bu enzimin inhibisyonu; diyabetik komplikasyonların gelişiminden sorumlu olan; ileri glikasyon son ürünleri (advanced glycation end-products; AGE)’nin oluşumuna, polyol yol, protein kinaz-C (PKC) ve heksozamin yolun aktivasyonuna öncülük eder (Şekil 3) (22).
Hipergliseminin makrovasküler hastalık için temel belirleyici olmadığı, HbA1C’nin % 5.5’tan % 9.5’a çıkışının mikrovasküler hastalık riskini on kat artırırken, makrovasküler hastalık riskini sadece iki kat artırdığı; insülin direncinin, arteriyal endotelyal hücrelerde serbest yağ asitlerinin oksidasyonunda ve sonuçta mitokondriyal ROS üretimininde artışa neden olduğu gösterilmiştir (24).
O2 + O2H2
9
Şekil 3. Hiperglisemi Aracılı Oksidatif Stresin Mekanizması
Polyol yol: Bu yolda aldoz redüktaz, toksik aldehitlerin inaktif alkollere indirgenmesini katalizler. Normal şartlarda aldoz redüktazın glukoza ilgisi düşüktür (Km’i yüksek) ve glukozun çoğu hekzokinaz tarafından glukoz 6-fosfata fosforillenirken, çok az bir kısmı glukoz metabolizmasında alternatif bir yol olarak bilinen polyol yola girer (22,25). Fakat hücre içi glukoz konsantrasyonu arttığında, aldoz redüktaz, kofaktör olarak redükte nikotinamid adenin dinükletid fosfat (NADPH)’ı kullanarak glukozu sorbitole indirger. Sorbitol, sorbitol dehidrogenaz ile fruktoza okside olurken, nikotinamid adenin dinükleotid (NAD+) ise NADH’a indirgenir (22,24). Okside glutatyonun redükte glutatyona dönüşümü ve NO sentezi için NADPH gereklidir. Polyol yolun aktive olması ve sonuçta NADPH’ın tüketilmesi antioksidan kapasitenin sınırlanması anlamına gelmektedir. Diyabette göz, böbrek ve sinir gibi glukoz alımı için insüline gerek duymayan dokularda oluşan sorbitol, hücre membranından kolaylıkla diffüze olamaz ve hücre içinde birikir. Sorbitol birikimi hücrede sinir iletimi için önemli olan miyoinozitol düzeylerinde azalmayla sonuçlanır (22).
Đleri glikasyon son ürünleri: Hiperglisemi varlığında, glukoz ile proteinlerin N- terminal veya serbest amino grupları arasında enzimatik olmayan glikozilasyon
GAPDH
POLYOL YOL
HEXOZAMĐN YOL
AGE
Glukoz
Pentoz fosfat yolu Glukoz 6-P
Fruktoz 6-P
DHAP Gliseraldehit 3-P
PROTEĐN KĐNAZ –C
NADPH oksidaz Glikoliz
Krebs siklusu
ETZ
1,3 Bifosfogliserat Poli (ADP-riboz) polimeraz
SOD Metilglioksal
10
(glikasyon) reaksiyonları sonucu önce Schiff bazları, daha sonra yeniden düzenlenmeyle Amadori ürünleri oluşur. Amadori ürünleri daha ileri reaksiyonlarla irreversibl AGE (pentozidin ve karboksimetillizin)’ye dönüştürülür (26).
Glukozun otooksidasyonu sonucu oluşan glioksalın, proteinlerle reaksiyonu AGE oluşumuna neden olan diğer bir yoldur (22).
Reaktif dikarboniller (α-oxoaldehitler; metilglioksal, glioksal, 3-deoksiglutazon), sadece glukozun otooksidasyonundan değil, aynı zamanda GAPDH inhibisyonu sonucu artan gliseraldehit 3-fosfattan, polyol yolda oluşan fruktozdan ve lipid peroksidasyonundan kaynaklanabilir. Reaktif dikarboniller daha sonra enzimatik olmayan glikasyon reaksiyonlarına katılarak AGE oluşumuna katkıda bulunurlar (Şekil 4) (22).
Şekil 4. AGE Oluşumuna Neden Olan Yollar
Metilglioksal, esas olarak gliseraldehit 3-fosfat ve dihidroksi aseton fosfattan oluşur, redükte glutatyon varlığında glioksalaz I ve II ile detoksifiye edilir (26).
AGE, ekstraselüler matriks proteinlerinin yapısında değişikliklere, özellikle tip I kollajende anormal çapraz bağlanmaya neden olarak vasküler elastikiyeti azaltır ve vasküler tonusu bozar (25). Glomerüler bazal membranda, heparan sülfat proteoglikanlarının kaybına, dolayısıyla negatif yükün azalmasına ve sonuçta proteinüriye yol açar (27). Böbrek, hedef organ olarak gösterilmekle birlikte retina ve aterosklerotik plaklarda da AGE birikiminden söz edilmektedir. Böbrek aynı zamanda AGE’nin klirensinde önemli rol oynamakta ve diyabette artan AGE düzeylerine
Laktat + protein-NH2
Amadori ürünleri
Lipid peroksidasyonu Aldoz redüktaz
Sorbitol
Sorbitol dehidrogenaz
PKC
Trioz fosfatlar
Fruktoz
Fruktoz 6-P Glukoz 6-P
Glikoliz HK
+ protein-NH2
α-oxoaldehitler Glukoz
11
katkıda bulunmaktadır. Periferik arter hastalığı olanlarda pentozidin düzeylerinde artma gözlenmiştir (28).
Reseptör (RAGE)-AGE etkileşimi, PKC ve aynı zamanda proenflamatuvar nükleer faktör kappa beta (NF-KB)’yı aktive ederek ilgili genlerin (sitokinler, adezyon molekülleri, protrombotik ve vazokonstriktif maddeler) ekspresyonunda artışa neden olur (26,28).
Diğer etkileri ROS oluşumunu artırması, enzimleri inaktive etmesi, proteinlerin yapı ve fonksiyonlarını değiştirmesidir (21).
Protein kinaz-C aktivasyonu: Hiperglisemi sonucu artmış gliseraldehit 3-fosfattan sentezlenen diaçil gliserol, birçok vasküler fonksiyonu düzenleyen ve hücre içi sinyal molekül olan PKC’yi aktive eder (23,29). Bu aktivasyon vasküler kontraktilite ve permeabiliteyi artırarak retinal ve renal kan akımında değişikliklere neden olur (27).
PKC, ilgili genlerin ekspresyonunu etkileyerek; endotelin-1 (ET-1), transforming growth faktör-β1 (TGF-β1), plazminojen aktivatör inhibitör-1 (PAI-1) ve vasküler endotelyal growth faktör (VEGF)’ün artmasına, endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS)’ın ise azalmasına neden olur. Ayrıca mitokondriyal NAD(P)H oksidazın sentezini uyararak O2˙ oluşumunu artırır (Şekil 5) (24). Sadece yüksek glukoz düzeyleri değil aynı zamanda obezite ya da insülin direnci varlığında yüksek plazma yağ asit konsantrasyonları da, PKC yoluyla NAD(P)H oksidazı aktive ederek ROS üretiminde artışa neden olur (29).
Kan akımında Vasküler geçirgenlik Kapiller Vasküler Proenflamatuvar ROS anormallik Anjiogenez oklüzyon oklüzyon gen ekspresyonu
Şekil 5. PKC Aktivasyonu ve Sonuçları
Artmış heksozamin yol aktivitesi: Hiperglisemi bu yolu, hız kısıtlayıcı enzim olan glutamin: fruktoz 6-fosfat amidotransferaz (GFAT) için daha fazla fruktoz 6-fosfat
Hiperglisemi
DAG PKC
eNOS ET-1 VEGF TGF-β1
Kollajen Fibronektin
PAI-1 NF-KB NADPH oksidaz
Fibrinoliz
12
sağlayarak aktive eder. GFAT, fruktoz 6-fosfatı glukozamin 6-fosfata dönüştürür ve sonuçta UDP-N-asetil glukozamin oluşur (22). Transkripsiyon faktörlerinin serin ve treonin kalıntılarına, N-asetil glukozamin eklenmesiyle O-bağlı glikozilasyon artar.
Transkripsiyon faktör Sp 1’in modifikasyonu, TGF-β1 ve PAI-1’in ekspresyonunda artışa neden olur (24).
Bu yolda üretilen glukozamin 6-fosfat, glukoz 6-fosfat dehidrogenaz (G6PDH) aktivitesini inhibe eder. G6PDH aktivitesi NADP+’nin NADPH’a redüksiyonuyla eşlendiğinden, heksozamin yolun aktivasyonu NADPH/NADP+ oranını azaltır.
G6PDH’ın inhibisyonu ya da NADPH oksidazın stimülasyonu sonucu azalmış NADPH/NADP+ oranı oksidatif stresi artırır (22).
2.4. ANTĐOKSĐDAN SAVUNMA SĐSTEMLERĐ
Biyolojik sistemler, ROS oluşumunu ve ROS kaynaklı hasarı önlemek için
"antioksidan savunma sistemleri" olarak da bilinen bazı korunma mekanizmaları geliştirmişlerdir. Antioksidanlar endojen ve ekzojen kaynaklı olup, oksidan moleküllerin neden olduğu hasarı, hem hücre içi hem de hücre dışı savunmayla etkisiz hale getirirler (30).
2.4.1. Süperoksit Dismutaz (E.C.1.15.1.1)
Süperoksit dismutaz (SOD); iki O2˙ radikalinin, O2 ve H2O2’ye dismutasyonunu katalizleyen, O2˙ ve sekonder ROS oluşumuna karşı savunmada ilk ve en önemli basamakta fonksiyon gören antioksidan bir enzimdir (20,31).
O2 ˙+ O2˙ O2 + H2O2
2H+
Şimdiye kadar tanımlanmış üç izoenzimi bulunmaktadır (32).
• SOD 1 (CuZn-SOD): Katalitik merkezinde Cu ve Zn atomlarını içerir, hücrede sitozol ve nükleusta bulunur.
• SOD 2 (Mn-SOD): Kofaktör olarak manganezi kullanır ve mitokondride yer alır.
• SOD 3: Ekstraselüler süperoksit dismutaz (EC-SOD) olarak adlandırılır.
SOD
13 2.4.1.1. Ekstraselüler Süperoksit Dismutaz
Đlk olarak 1982’de tanımlanmış olup; plazma, lenf ve sinoviyal sıvılarda yüksek konsantrasyonda bulunduğu tespit edildiğinden, EC-SOD olarak adlandırılmıştır (33).
Biyokimyasal ve moleküler özellikleri: Çoğu türde, birbirine disülfit köprüsüyle bağlı iki dimerden oluşan bir tetramer olarak bulunur. Her alt ünitesinde enzimatik aktivite için gerekli bir Zn ve bir de Cu atomu içerir. Propeptid olarak sentezlenen 240 amino asit içeren her alt üniteden, 18 amino asit (sinyal peptid)’in ayrılmasıyla matür protein oluşur. Matür bir proteinin alt ünitesinde üç fonksiyonel bölge bulunmaktadır (Şekil 6) (31,34).
1-Glikozilasyon bölgesi: Enzimin çözünürlüğüne katkıda bulunur.
2-Aktif bölge
3-Heparin bağlayan bölge: C-terminalde üç lizin ve altı arjinin olmak üzere pozitif yüklü dokuz amino asit içerir.
NH2 Şekil 6. EC-SOD’un Yapısı
Doku dağılımı türler arasında farklılık göstermekle birlikte ekstraselüler sıvılar dışında genellikle vasküler duvar, akciğer ve böbrekte yüksek konsantrasyonda bulunur.
Dokularda esas olarak hücre yüzeyine ve ekstraselüler matriksteki heparan sülfat proteoglikanlarına bağlanır. Vasküler duvarda düz kas hücreleri tarafından üretilen EC-SOD’un, dolaşımdaki konsantrasyonu oldukça az olmakla birlikte, plazma ile doku düzeyi arasında bir denge söz konusudur (34). Enzim, heparin/heparan sülfat proteoglikanlarına bağlanma ilgisi yönünden farklılık gösterir. Tip A, B ve C olmak üzere tanımlanan üç tipten en yüksek bağlanma özelliğine sahip olan tip C’dir. Bu tipin tüm alt üniteleri heparin bağlama bölgesine sahiptir (31,32).
Heparinin intravenöz enjeksiyonunun, EC-SOD’un endotel hücrelerinden ayrılmasına ve plazma konsantrasyonunun artmasına neden olduğu belirtilmektedir (31).
EC-SOD polimorfizmi: Japon, Đsveç ve Avusturalya popülasyonunun % 3-6’sında plazma EC-SOD konsantrasyonunun yüksek olması, enzimin heparin bağlayan bölgesinin 213. pozisyonunda bulunan arjininin glisinle yer değiştirmesi sonucu oluşan polimorfizme bağlanmıştır (32). Bu polimorfizm, EC-SOD’un tripsin benzeri
COOH
N89
Heparin bağlayan bölge N-bağlı
glikozilasyon
Cu/Zn Aktif bölge
14
proteinazlara duyarlılığını azaltmakta ve endotel yüzeyine bağlanmasını bozmaktadır.
Bu polimorfizme sahip olup hemodiyalize giren diyabetik hastalarda, kardiyovasküler ve serebrovasküler hastalık riskinin arttığı gösterilmiştir (34).
2.4.1.2. Diyabet ve Ekstraselüler Süperoksit Dismutaz
Yüksek kan glukoz konsantrasyonu, EC-SOD’un heparin bağlayan bölgesinin glikasyonuna ve enzimin heparan sülfat proteoglikanlarına bağlanma yeteneğinin azalmasına neden olur. Bu durum arter duvarında, EC-SOD konsantrasyonunun azalması ve dolaşımda glike SOD düzeyinin artmasıyla sonuçlanır (Şekil 7) (31).
Şekil 7. Diyabette EC-SOD Glikasyonunun Sonuçları 2.4.2. Paraoksonaz 1
Đnsanlarda, 7. kromozomun uzun kolunda q 21.3 ile q 22.1 bölgesinde lokalize birbirine komşu üç ayrı paraoksonaz (PON) geni bulunmaktadır. PON proteinlerinin amino asit sekansları arasında % 60 benzerlik olduğu bildirilmektedir (35). Hem arilesteraz (E.C.3.1.1.2) hem de PON (arildialkil fosfataz; organofosfat hidrolaz;
paraokson hidrolaz; E.C.3.1.8.1) aktivitesine sahip bir ester hidrolaz olan PON1;
karaciğer, böbrek, kalp, ince bağırsak ve plazmada bulunmaktadır (35,36).
Kimyasal yapısı: PON1; 43 kDa ağırlığında, 354 amino asitten oluşan bir glikoproteindir. Ağırlığının % 15.8’ini oluşturan karbohidrat üniteleri 4 farklı konumda proteine bağlı olarak bulunur. Lösin içeriği yüksek olup; 42, 284 ve 353.
pozisyonlarda yer alan sistein artıkları PON1’in yapısal ve fonksiyonel özelliklerine katkıda bulunur (36,37). Protein yapısındaki tek disülfid bağı (Cys 42-353) polipeptid zincirinin siklik yapıda olmasını sağlar (Şekil 8) (37).
DĐYABET DĐYABET
Endotel
Düz kas hücreleri
15 Şekil 8. Paraoksonazın Yapısı
Karaciğerde sentezlenen ve dolaşıma verilen PON1’in yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) yapısında yer aldığı bilinmektedir. Hidrofobik N-terminal bölgesi aracılığıyla HDL lipidlerine kolayca bağlanabilmekte; PON1’i bağlayan HDL alt birimleri, apolipoprotein A1 (apo A1) ve apo J’yi içerdiğinden, bağlanmada bu apolipoproteinlerin de rol oynadığı düşünülmektedir (38).
Fonksiyonları: PON1’in en iyi bilinen fonksiyonu; insektisid olarak kullanılan organofosfatları, sinir gazlarını ve aromatik karboksilik asit esterlerini hidroliz etme yeteneğidir (39). Organofosfatlardan paratiyonun aktif metaboliti olan paraokson (o,o- dietil-o-p-nitrofenil fosfat), sinaps ve nöromüsküler kavşakta bulunan kolinesterazları (psödokolinesteraz, asetilkolinesteraz) irreversibl olarak inhibe eder. Dolaşıma giren organofosfatların nörotoksik etkisi, paraoksonun PON1 ile hidrolizi sonucu engellenebilmektedir (40). Enzime adını da veren paraokson, PON1 aktivite tayininde sıklıkla kullanılmaktadır (41).
PON1’in ikinci önemli fonksiyonu, HDL ve düşük dansiteli lipoprotein (LDL)’in oksidasyonunu engelleyerek antioksidan özellik göstermesidir. Bu etkisini lipoprotein yapılarında oluşan (fosfo)lipid peroksitleri ve kolesteril linoleat hidroperoksitleri hidroliz ederek gerçekleştirir. Ayrıca peroksidaz aktivitesine de sahip olduğu bilinmekte ve yapısında 284. pozisyonda bulunan sisteinin LDL’yi oksidasyona karşı korumada önemli olduğu ifade edilmektedir (40,42).
HDL’nin oksidasyonu; periferal dokulardan karaciğere kolesterol taşıma fonksiyonunda (ters kolesterol taşıma) bozulmaya neden olmaktadır. LDL’yi
Lizin
Metiyonin/ Lösin H2N
Arjinin/Glutamin
Sistein Sistein
Karbohidrat Karbohidrat
Karbohidrat Karbohidrat
Hidrofobik bölge
Apo A1
16
oksidasyona karşı koruyan PON1’in aynı zamanda HDL oksidasyonunu da önleyici etkisi, ters kolesterol taşıma fonksiyonunun devamı açısından önemlidir (42).
PON1, endotel fonksiyonları üzerine koruyucu etkiye sahiptir. Semptomatik periferal arter hastalığı olan olgularda, düşük PON1 aktivitesinin endotel disfonksiyonu ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Yine bu hastalarda düşük PON1 aktivitesinin, HDL’nin LDL oksidasyonunu önleme yeteneğini azalttığı ve sonuçta yüksek okside LDL (oxLDL) düzeylerinin, NO’yu azaltarak endotel bağımlı relaksasyonun bozulmasına neden olduğu belirtilmektedir (43).
Tip 2 diyabet ve metabolik sendromda, C-reaktif protein (CRP) ve serum amiloid A (SAA) gibi enflamatuvar belirteçlerin artışı, HDL yapısında değişikliklere neden olmaktadır (Şekil 9) (44). Bu akut faz reaktanları HDL’nin antioksidan enzimleri PON1 ve platelet aktive edici faktör asetil hidrolaz (PAF-AH ) ile yer değiştirmekte ve sonuçta HDL yapısında SAA içeriği artarken; apo A1, PON1, PAF-AH azalmaktadır.
HDL, LDL’yi oksidasyona karşı korumada yetersiz kalmakta ve ateroprotektif özelliğini kaybederek proenflamatuvar bir moleküle dönüşmektedir (44,45).
Şekil 9. Tip 2 Diyabette HDL’nin Antioksidan Fonksiyonunun Kaybı
HDL yapısında meydana gelen değişiklikler, PON1’in bu lipoproteine bağlanma afinitesi ve stabilitesini etkileyebilir (35). Akut enflamatuvar olay nedeniyle PON1 aktivitesinde görülen akut düşüş LDL oksidasyonunu şiddetlendirir (40).
PON1 polimorfizmi: mRNA yapısında 55. pozisyonda metiyonin (M) veya lösin (L);
192. pozisyonda ise glutamin (Q) veya arjinin (R) bulunması sık görülen iki polimorfizmin oluşmasına neden olur (40).
192. pozisyonda arjinin ya da glutaminin bulunmasına göre, enzimin R veya Q izozimleri oluşmaktadır (37).
Makrofajlar Endotelyalhücreler
Oksidatif stres Hiperglisemi
VLDL TG
Normal fonksiyonel HDL
Enflamasyon KC
Disfonksiyonel HDL
17
192. pozisyonda arjinin bulunan homozigot bireylerde paraoksona karşı hidrolitik aktivitenin yüksek, glutamin bulunan homozigotlarda ise bu aktivitenin düşük olduğu belirlenmiştir (39). LDL’yi oksidasyona karşı koruma (peroksidaz aktivitesi) yönünden PON1’in Q izoziminin R’ye göre daha etkin olduğu belirtilmektedir (40).
2.5. LĐPĐD PEROKSĐDASYONU
Lipid peroksidasyonu, doymamış yağ asitlerinin oksidasyonunu içeren; başlama, yayılma ve sonlanma olmak üzere üç aşamada gerçekleşen reaksiyonlar dizisidir.
Başlama aşamasında, HO˙baştaolmak üzere ROS, doymamış yağ asitlerinin metilen (-CH2) grubundan bir hidrojen atomu kopararak karbon merkezli lipid radikali (R˙) oluşturur. Bu lipid radikalinden moleküler yeniden düzenlenmeyle oluşan konjuge dien, O2 ile reaksiyona girerek lipid peroksil radikali (ROO˙)’ne dönüşür (46,47).
ROO˙, başka bir doymamış yağ asidinden H atomunu uzaklaştırarak yeni lipid radikallerinin oluşumuna yol açmak suretiyle zincirleme reaksiyonların yayılarak devam etmesine neden olur ve kendisi de açığa çıkan H atomlarını alarak lipid hidroperoksit (ROOH)’lere dönüşür (47). Bu zincir reaksiyonları, iki radikal üründen nonradikal bir ürün oluşuncaya (ROO˙+ ROO˙ ROOR + O2 / ROO˙+ R˙
ROOR gibi) veya bu radikaller antioksidanlarla ortadan kaldırılıncaya kadar devam eder (Şekil 10) (46,48).
Şekil 10. Lipid Peroksidasyonu Zincir Reaksiyonları
RO·
ROH R
R·
·
ROO·
R R· ROOH
R
R·
Çoklu doymamış yağ asidi H Hidrojen çıkışı
Siklik endoperoksit (ROOR)
Malondialdehit
Pentan Antioksidan
18 2.5.1. Malondialdehit
Üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonu sonucu oluşan malondialdehit (MDA), membran bileşenlerinin çapraz bağlanmasına ve polimerizasyonuna neden olarak; membranın iyon transportu, enzim aktivitesi, akışkanlık ve permeabilite gibi özelliklerini değiştirebilir; ayrıca nükleer membrandan geçerek DNA’nın yapısında oluşturduğu değişiklikler sonucu mutajenik, genotoksik ve karsinojenik etki gösterebilir (49).
2.5.2. Okside LDL
LDL’de bulunan yağ asitlerinin yaklaşık yarısı çoklu doymamış yağ asitleri olup, çoğunluğunu linoleik asit, az bir kısmını da araşidonik ve dokosahexaenoik asid oluşturur. Esas olarak α-tokoferol olmak üzere γ-tokoferol, karotenoidler ve ubikinol- 10 gibi antioksidanlar, çoklu doymamış yağ asitlerinin okside olmasını engellerler.
Antioksidan ve çoklu doymamış yağ asidi içeriğinin kişiler arasında farklılık göstermesi, LDL’nin oksidasyona karşı duyarlılığını etkileyebilir. Lipoksijenaz, miyeloperoksidaz, RNS ve metal iyonları; LDL oksidasyonuna neden olan mekanizmalardır (Şekil 11) (50).
Endotel ve düz kas hücreleri Aktif makrofajlar Redoks aktif metal iyonları (Cu+2, Fe+2) Lipoksijenaz Miyeloperoksidaz (metal iyon bağımlı) (metal iyon bağımsız)
NO NO
Çoklu doymamış
yağ asitleri Hidroperoksitler Nitrit LDL:
1-Endojen antioksidanların tüketimi Reaktif türler
2-LDL’de lipid peroksidasyonu -HOCl
3-Reaktif aldehitlerin oluşumu -Kloramin
-Tirozil radikalleri -NO2•
Aldehitlerin apo B 100’ün lizil LDL’de protein ve lipid kalıntılarıyla reaksiyonu oksidasyonu
oxLDL
Scavenger reseptörler
(endotel, düz kas hücreleri ve makrofajlar)
Şekil 11. LDL Oksidasyon Mekanizmaları
Metal iyonları: Metal iyonlarıyla (Cu+2) in vitro LDL oksidasyonu; başlangıç, yayılma ve ayrışma (malondialdehit, 4-hidroksinonenal gibi reaktif aldehitlerin
19
oluşumu) olmak üzere üç aşamada gerçekleşir (50). Aldehitler (malondialdehit), apo B’nin pozitif yüklü lizil kalıntılarının ε-amino gruplarıyla reaksiyona girerek, LDL’nin biyolojik özelliklerini ve elektroforetik mobilitesini değiştirirler. Apo B’nin MDA aracılı modifikasyonu, LDL’nin kendi reseptörü tarafından tanınma özelliğinde kayba neden olurken, scavenger reseptörlerine olan ilgiyi artırır. In vitro gerçekleşen metal iyonlarının aracı olduğu oksidasyonun, in vivo LDL oksidasyonu için temel mekanizma olmadığı belirtilmektedir (51).
Lipoksijenaz: Çoklu doymamış yağ asitlerini lipid hidroperoksitlere dönüştürerek LDL’yi okside eder (52).
Miyeloperoksidaz: Aktif fagositlerden salınan miyeloperoksidaz kaynaklı oksidanlar, LDL’de bulunan lipid ve proteinleri okside ederler (50,52).
Reaktif nitrojen türleri: Endotelyal hücrelerden salınan NO, LDL’nin miyeloperoksidaz ve metal aracılı oksidasyonunu inhibe eder, ayrıca alkoksil ve peroksil radikallerini tutabilen bir antioksidan gibi davranır. Oksidatif stres varlığında NO, peroksinitrit oluşturmak üzere O2˙ ile reaksiyona girer (50).
Peroksinitrit ve RNS, LDL’deki hedef yerlerinde modifikasyona neden olarak LDL’yi okside eder (Tablo 2) (52).
Tablo 2. Peroksinitrit, RNS ve LDL Oksidasyonu
Oksidan LDL’deki hedef Oluşan ürün
Peroksinitrit Aldehitler ONOO¯+ CO2 NO2˙
Nitril klorid (NO2Cl)
Doymamış yağ asidleri Lizil kalıntıları
Doymamış yağ asidleri Tirozil kalıntıları Doymamış yağ asidleri Tirozil kalıntıları Tirozil kalıntıları Doymamış yağ asidleri
Lipid hidroperoksit Schiff bazı
Lipid hidroperoksit 3-Nitrotirozin Lipid hidroperoksit 3-Nitrotirozin 3-Nitrotirozin 3-Klorotirozin Lipid hidroperoksit
In vitro LDL oksidasyonu; minimal modifiye LDL ve oxLDL olmak üzere birbirinden farklı iki formun bulunduğunu göstermiştir. Minimal modifiye LDL, LDL reseptörleriyle alınırken, oxLDL scavenger reseptörleri tarafından tanınır. Bu farklılığın nedeni oxLDL’ deki apo B’nin modifikasyonudur (51).
20 2.5.3. Küçük Yoğun LDL
LDL, dolaşımda kolesterol taşınmasından sorumlu temel lipoproteindir. Büyüklük ve dansite bakımından farklılık gösteren alt fraksiyonları olduğu ilk kez 1982’de gradiyent jel elektroforezi ile gösterilmiştir (53).
LDL;
• büyük LDL
• ara LDL
• küçük yoğun LDL (small, dense LDL; sdLDL, dansitesi 1.044-1.063 g/mL) olmak üzere üç alt fraksiyondan oluşur (54,55).
LDL’nin; büyüklük, dansite, metabolik davranış ve aterojenite yönünden farklılık gösteren alt fraksiyonlarının varlığı iki farklı fenotipin tanımlanmasına neden olmuştur. A fenotip, çapı 25.8 nm’den büyük olan partiküllerin; B fenotip ise çapı 25.8 nm’den daha küçük olan partiküllerin baskınlığıyla karakterizedir. LDL büyüklüğü, HDL-C düzeyleriyle pozitif, trigliserid (TG) düzeyleriyle negatif yönde korelasyon gösterir (7). LDL-C konsantrasyonundan bağımsız olarak sdLDL baskınlığı, koroner kalp hastalığı riskinde 3-7 kat artışla ilişkilidir (54).
B fenotip prevalansının; yetişkin erkeklerde % 30, 20 yaşından küçük erkekler ve premenopozal kadınlarda % 5-10, postmenopozal kadınlarda ise % 15-25 olduğu ifade edilmektedir. LDL partikül büyüklüğüne kalıtımın etkisi % 35-45 dolayındadır. Diyet gibi çevresel faktörler de önemlidir. Özellikle genetik yatkınlığı olan bireylerde yağ oranı düşük, karbohidrat oranı yüksek diyet, sdLDL artışına neden olmaktadır (7).
sdLDL baskınlığı, kardiyovasküler hastalıklar için risk faktörü olarak kabul edilmiştir (56).
Diyabetik dislipidemi: Dislipidemi, tip 2 diyabetle ilişkili mikrovasküler komplikasyonların gelişiminde ve ilerlemesinde önemli rol oynamaktadır. TG’den zengin çok düşük dansiteli lipoprotein (VLDL1) ve sdLDL artışı, diyabetik retinopati ve albüminüri gelişimiyle ilişkilidir (44).
Küçük yoğun LDL oluşumuna yol açan temel faktör, 120 mg/dL’yi aşan plazma TG konsantrasyonudur. Plazma TG düzeyinin yükseldiği durumlarda; insülin direncinin adipoz dokudan yağ asitlerinin mobilizasyonunu artırmasına ya da defektif klirense (lipoprotein lipaz (LPL) aktivitesinde azalma ve apo CIII artışı) bağlı olarak VLDL 1 düzeyi artar. Kolesterol ester transfer protein (CETP) aracılığıyla HDL ve LDL’den, VLDL 1’e kolesterol esteri (CE); VLDL1’den de LDL ve HDL’ye TG transfer edilir.
21
Böylece TG’den zengin hale gelen LDL, hepatik lipaz (HL) etkisiyle çekirdekteki TG ve yüzey fosfolipidlerini kaybederek, daha küçük ve yoğun LDL formuna dönüşür (8,54). CETP aracılığıyla TG’den zengin duruma gelen HDL ise HL etkisi ile küçük, yoğun HDL (small dense HDL) partiküllerini oluşturur (44).
Normal ya da hafif yüksek LDL-C değerlerine karşın, artmış VLDL1 ve azalmış plazma HDL-C düzeyleri ile sdLDL birlikteliği tip 2 diyabette görülen aterojenik lipoprotein fenotipini oluşturur (Şekil 12) (8).
Şekil 12. Aterojenik Lipoprotein Fenotipin Metabolik Temeli
Kadınlar, HL ekspresyonu üzerine östrojenin inhibitör etkisi nedeniyle daha düşük HL aktivitesine sahiptir. Bu özellik sdLDL prevalansında görülen cinsiyet farklılığını açıklamada önemlidir (54).
Esas olarak karaciğerden sekrete edilen ve plazmada çoğunlukla HDL’ye bağlı olarak bulunan bir glikoprotein olan CETP, CE’nin HDL’den KC’e transferine aracılık eder.
CETP’nin, lipoproteinler arasında gerçekleşen CE ve TG transferine etkisi normal ve yüksek TG düzeylerinde farklılık göstermektedir. Normal TG düzeylerinde HDL’den LDL’ye CE transferi ön plandayken; TG yüksekliğinde HDL’den TG’den zengin lipoproteinlere CE, TG’den zengin lipoproteinlerden de HDL ve LDL’ ye TG transferi söz konusudur (57).
sdLDL’nin aterojenitesi: (7,54,58) 1-LDL reseptörlerine daha az bağlanır.
2-Plazma yarı ömrü daha uzundur.
3-Büyük LDL partikülleriyle karşılaştırıldığında daha kolay endotelyal geçiş özelliği gösterir.
KC
22
4-Arteriyal duvar proteoglikanları ile güçlü etkileşim gösterir.
Bu özellik lipoproteinin, arteriyal duvarda kalış süresinin uzamasına ve aterojenik değişikliklere maruz kalma ihtimalinin artmasına neden olur. B fenotipli bireylerde LDL partiküllerinin siyalik asit içeriğinde azalma olduğu ve bu azalmanın proteoglikanlarla etkileşimde önemli rol oynadığı belirtilmiştir.
5-Oksidasyona daha duyarlıdır.
Azalmış serbest kolesterol ve artmış poliansatüre yağ asit içeriği nedeniyle değişmiş yüzey lipid tabakası, bu partikülü oksidasyona daha duyarlı yapar.
6-Proagregatör ve vazokonstriktör mediyatörlerde artışa neden olur.
Alt ekstremite aterosklerozu; artmış kardiyovasküler morbidite ve mortaliteyle karakterizedir (58). Diyabet varlığında ya da yokluğunda periferik vasküler hastalığı olanların daha küçük çaplı LDL partiküllerine sahip olduğu gösterilmiştir (59).
2.6. DĐYABET VE ENDOTEL DĐSFONKSĐYONU
Vasküler endotelin yapı ve fonksiyonunda bozukluk, vazokonstriksiyon ile vazodilatasyon arasındaki dengenin kaybına; endotelyal geçirgenlik, lökosit adezyonu, platelet agregasyonu ve sitokinlerin salınımında artışa neden olarak aterosklerozun gelişiminde ve ilerlemesinde önemli rol oynar (60).
Vasküler duvarda ROS; asimetrik dimetilarjinin (ADMA)’i metabolize eden dimetilarjinin dimetilaminohidrolaz (DDAH)’ı inhibe ederek, ONOO- oluşturarak ve eNOS’un kofaktörü olan tetrahidrobiopterin (BH4)’in oksidasyonuna neden olarak NO oluşumunuve biyoaktivitesini azaltır (Şekil 13) (60).
Peroksinitritin kendisi de BH4’ü, dihidrobiopterine okside eder. BH4 eksikliği eNOS’un redüktaz bölgesinden oksidaz bölgesine aktarılan elektronların, arjinin yerine O2’ye yönlendirilmesine ve sonuçta NO yerine O2˙ oluşumuna neden olur (60,61).
Peroksinitrit ayrıca proteinleri okside eder, lipid peroksidasyonunu başlatır ve DNA’da hasar oluşturarak PARP’yi aktive eder. Bütün bu süreçler ROS oluşumunu artırarak endotel disfonksiyonuna katkıda bulunur (61).
23
NO + O2•
ONOO-
Şekil 13. ROS ve Endotel Disfonksiyonu 2.6.1. Asimetrik Dimetilarjinin
ADMA, endojen NOS inhibitörü olarak ilk kez 1992’de Vallance ve ark (62) tarafından tanımlanmıştır.
Proteinlerin yapısında bulunan arjininin guanido azotuna, bir veya iki metil grubunun (simetrik/asimetrik) transferi sonucu posttranslasyonel modifikasyonla oluşurlar. Bu reaksiyonlar, protein arjinin N-metiltransferaz (PRMT)’lar aracılığıyla gerçekleştirilir ve metil grubu vericisi olarak S-adenozilmetiyonin kullanılır (63).
ADMA, NG-monometil L-arjinin (L-NMMA) ve simetrik dimetilarjinin (SDMA) başlıca metil arjinin türevleridir, metillenmiş proteinlerin hidrolizi sonucu serbest hale geçerler (63). Endotel hücrelerine y+ transporter (y taşıyıcı protein) olarak bilinen katyonik amino asit taşıyıcılarıyla aktarılırlar. ADMA ve L-NMMA endojen NOS inhibitörleridir. Ancak dolaşımdaki konsantrasyonu, L-NMMA’dan yaklaşık on kat daha fazla olması nedeniyle ADMA, insanda NO biyosentezinin majör inhibitörü olarak kabul edilmektedir (64).
Yüksek ADMA düzeyleri, aynı zamanda L-arjininin hücre içine transportunu da engelleyerek NO sentezini azaltır. SDMA’nın NOS üzerine inhibitör etkisi bulunmamaktadır (63).
ROS
DDAH aktivitesi
NO
inaktivasyonu
BH4
oksidasyonu
ADMA
eNOS aktivitesi
eNOS eşlenmesi
O2•
NO
O2• NO
Endotel disfonsiyonu DĐYABET
Ksantin oksidaz NADPH oksidaz
24
ADMA yüksekliğinin, ateroskleroz ve kardiyovasküler hastalıklarla ilişkili olduğu belirtilmektedir. Özellikle renal fonksiyon bozukluğu olan tip 2 diyabetli hastalarda, azalmış endotel bağımlı vazodilatasyonun ve artmış kardiyovasküler riskin önemli bir göstergesidir (64).
Metilarjininler arasında renal yolla atılım ve DDAH ile metabolize olma yönünden farklılıklar bulunmaktadır. Buna göre SDMA, sadece renal yolla atılmakta (DDAH ile metabolize olmamakta); ADMA ise esas olarak DDAH ile L-sitrüllin ve dimetilamine metabolize edilmekte ve daha az oranda renal yolla elimine edilmektedir (Şekil 14) (65).
DDAH’ın DDAH-1 ve DDAH-2 olmak üzere iki izoformu vardır. DDAH-1, tipik olarak nöronal NOS (nNOS); DDAH-2 ise eNOS ekspresse eden dokularda bulunmaktadır (12).
Şekil 14. Metilarjininlerin Yapısı ve Metabolizması 2.6.2. Nitrik Oksit
Dış yörüngesinde bulunan ortaklanmamış elektron nedeniyle serbest radikal özelliği gösteren, yarı ömrü çok kısa olan ve membranları kolayca geçebilen oldukça lipofilik bir moleküldür (20).
Proteoliz
Proteoliz
Proteoliz
dimetilamin L-sitrüllin
L-sitrüllin monometilamin
NOS
L-arjinin L-sitrüllin + NO
NOS
L-arjinin L-sitrüllin + NO
Üriner ekskresyon
