2. GENEL BĐLGĐLER
2.6. DĐYABET VE ENDOTEL DĐSFONKSĐYONU
2.6.3. Endotelin-1
düz kas hücrelerinde gevşemeye, trombosit adezyon ve agregasyonunun inhibisyonuna neden olur. NO’nun cGMP ile ilişkili olan bir diğer etkisi de nötrofil kemotaksisini önlemesidir (68).
2.6.3. Endotelin-1
Endotelin-1; endotelin-2 ve endotelin-3 ile birlikte, endotelin peptid ailesi içinde yer alan üç izoformdan biridir. 212 amino asit içeren preproendotelin-1 olarak sentezlenir.
Daha sonra preproendotelin-1, proendotelin-1 (big endotelin)’i oluşturmak üzere proteolitik yıkıma uğrar. Biyolojik olarak inaktif olan big endotelin, endotelin converting enzim (ECE) aracılığıyla 21 amino asit içeren ET-1’i oluşturur (Şekil 15) (69).
Şekil 15. Endotelinlerin Moleküler Yapısı
ET-1, başlıca endotelyal hücrelerden sentezlenen güçlü bir vazokonstriktördür.
Etkisini endotelin reseptör tip A (ETA)ve endotelin reseptör tip B (ETB) olmak üzere başlıca iki tip reseptör aracılığıyla gösterir. ET-1, ETA için yüksek affiniteye sahiptir, ancak ETB’ye affinite yönünden endotelinler arasında farklılık bulunmamaktadır. ET-1, vasküler düz kas hücrelerinde ETA ve ETB aracılığıyla vazokonstriksiyona neden olurken, endotelyal hücrelerde ETB’ye bağlanarak NO ve PGI2 salınımı yoluyla vazodilatasyon oluşturur. ET-1’in net etkisi düz kas ve endotelyal hücrelerde bulunan reseptörlerin birbirine göre yoğunluğuna bağlıdır. ETB’nin patolojik durumlarda vasküler düz kas hücrelerinde artarken, endotelyal hücrelerde azalması, ET-1 aracılı vazokonstriksiyona ve vasküler düz kas hücrelerinde proliferasyona neden olur (60).
27 2.6.4. Đskemi Modifiye Albümin
Albüminin N-terminal bölgesinde; kobalt (II), bakır (II) ve nikel (II) gibi geçiş metallerini bağlayan, Asp-Ala-His-Lys amino asit kalıntılarından oluşan spesifik bir sekansın bulunduğu gösterilmiştir (70).
Đskemi varlığında gelişen endotelyal ve ekstraselüler hipoksi, asidoz, serbest radikal hasarı, enerji bağımlı membran sodyum ve kalsiyum pompa bozukluğu sonucu N-terminalinde yapısal değişikliğe uğrayan ve geçiş metallerini bağlama kapasitesi azalan albümin, iskemi modifiye albümin (ĐMA) olarak adlandırılır. N-terminal bölgenin asetilasyonu ya da bir veya daha fazla amino asitin delesyonu albüminin kobalt bağlama yeteneğinde kayba neden olur (70, 71).
Albüminin N-terminalinde görülen yapısal değişikliğin ROS oluşumu ile ilişkili olduğu ifade edilmektedir (70). Đskemi sonucu görülen asidoz; Cu ve Fe gibi iyonların plazmada bağlı bulundukları proteinlerden ayrılmasına neden olmakta ve bu aktif redoks iyonları varlığında Fenton reaksiyonuyla oluşan HO˙, albüminde görülen değişikliklerden sorumlu tutulmaktadır (Şekil 16) (72).
Şekil 16. ĐMA Oluşumuna Yönelik Öne Sürülen Mekanizma
ĐMA, albümin kobalt bağlama (ACB) testiyle ölçülür. Bu test albüminin kobalt bağlama kapasitesinin indirek olarak belirlenmesi esasına dayanır. ĐMA düzeylerinde görülen artış; ortamdaki bağlı olmayan kobalt miktarıyla doğrudan ilişkilidir (Şekil 17) (73).
Anaerobik metabolizma
Aterosklerotik plak
IMA
Endotel
28
Şekil 17. Albümin Kobalt Bağlama Testi
bağlı olmayan kobalt
bağlı kobalt IMA
Normal örnek Đskemik örnek
29
3. GEREÇ VE YÖNTEM
Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenen (Proje no: TST-09-727) ve Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu tarafından onaylanan (06.01.2009 tarih, karar no: 09/25) bu çalışma, Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı’nda yapıldı.
3.1. GEREÇ
Biyokimyasal ölçümlerde, analitik saflıkta Sigma, Merck ve Amresco marka kimyasal maddeler kullanıldı.
Çalışma sırasında saf su cihazları (MINIpure, EASYpure RF), spektrofotometre (Shimadzu UV-1601), soğutmalı santrifüj (Sigma 3K 30), hassas terazi (AND GR-200), pHmetre (WTW-330Đ/SET), etüv (Dedeoğlu), su banyosu (Köttermann), derin dondurucu (Newbrunswick scientific), manyetik karıştırıcı (Labor Brand Hotplate Stirrer), vorteks (Velp scientifica 2x³), buzdolabı (Arçelik), kronometre, mikro ELISA okuyucu (BioTek ELx800), mikro ELISA yıkayıcı (BioTek ELx50), otomatik pipetler (Socorex, Nichipet EX, Genex Gamma), balon jojeler, polipropilen, cam ve ependorf tüpler, beher, mezür ve cam pipetler kullanıldı. Cam malzemeler ve polipropilen tüpler, kullanılmadan önce demineralize edildi.
3.2. ÇALIŞMA GRUBU
Hasta Grubu: Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Dahiliye Anabilim Dalı Endokrinoloji Bölümü’nde; Temmuz 2009-Ocak 2011 tarihleri arasında takip ve tedavileri sürdürülen, diyabetik ayak komplikasyonu bulunmayan ve hastalığı süresince bu komplikasyonla hiç karşılaşmamış olan 30 diyabetli hasta ile benzer yaş
30
ve cinsiyet dağılımına sahip diyabetik ayak komplikasyonu bulunan 30 diyabetli hasta çalışmaya dahil edildi.
Diyabetik ayak komplikasyonu olan hastalar, kendi içinde alt ekstremite amputasyonu uygulananlar ve uygulanmayanlar; ampute olanlar ise amputasyon öncesi (AÖ) ve sonrası (AS) olmak üzere iki gruba ayrıldı.
Çalışma öncesi; HbA1C , glukoz, TG, total kolesterol (TC), HDL-C, LDL-C, kreatinin, total protein, albümin, AST, ALT ve CRP düzeyleri ölçülerek hastalar kan glukoz regülasyonu, lipid profili, akut enfeksiyon, böbrek ve karaciğer fonksiyonları yönünden değerlendirildi. Son dönem böbrek yetmezliği, hepatit, tiroid ve malign hastalığı olanlar çalışma dışı bırakıldı.
Hastalık süresi (hastalık yaşı), Amerikan Diyabet Birliği (ADA) kriterlerine göre diyabet tanısı konulmasından itibarençalışma zamanına kadar geçen süre olarak kabul edildi. Hastaların boyları ve kiloları ölçülerek, kg/m2 formülünden vücut kütle indeksleri (VKĐ) hesaplandı. Hastalar muayene bulguları, nöroloji ve göz konsültasyonu sonucu kaydedilen notlar dikkate alınarak, diyabetik nöropati ve retinopati açısından değerlendirildi.
Antihipertansif tedavi alan hastalar hipertansif (HT) olarak kabul edildi. Dört değişkenli "Modification of Diet in Renal Disease Study" (MDRD) formülü kullanarak tahmini glomerüler filtrasyon hızı (eGFR) hesaplandı; eGFR (mL/dk/1.73 m2)=186 x (serum kreatinin)-1.154 x (yaş)-0.203 x 0.742 (kadın) x 1.212 (siyah ırk) (74).
Hastalar geçirilmiş myokard infarktüsü ve EKG bulgularına dayanarak, koroner arter hastalığı (KAH) açısından değerlendirildi.
Diyabetik ayak komplikasyonu olan hastalarda; mevcut ülserler Wagner (16) tarafından tasarlanan sınıflama dikkate alınarak, enfeksiyon ve/veya gangrenin varlığına göre 1’den 5’e kadar derecelendirildi. Ayak ülserlerinin sınıflandırılmasında;
muayene bulguları, kültür ve radyolojik tetkiklerden yararlanıldı.
Diyabetli hastalara, rutin tedavi protokolü gereği, insülin ihtiyaçlarının belirlenmesi amacıyla yoğun insülin tedavisi uygulandı. Bu tedavi devam ederken 3. günden sonra kan alındı.
Kontrol Grubu: Rutin laboratuvar sonuçları referans aralık içerisinde bulunan, sistemik hastalığı olmayan, herhangi bir ilaç kullanmayan, sigara içmeyen, hasta grubunun yaş ve cinsiyet dağılımına benzer şekilde seçilen 30 gönüllü (14 kadın, 16 erkek), kontrol grubu olarak çalışma kapsamına alındı.
31
Çalışma sırasında; kontrol grubundan ve diyabetik ayak komplikasyonu bulunmayan diyabetli hastalardan bir kez; diyabetik ayak komplikasyonu nedeniyle amputasyon uygulanan hastalardan, amputasyondan önce ve amputasyondan yaklaşık bir hafta sonra olmak üzere toplam iki kez kan alındı.
Kan örnekleri, biyokimyasal ölçümlere uygun şekilde, antikoagülanlı (EDTA) ve düz tüplerde toplandı. HbA1C ölçümünde tam kan (EDTA) kullanıldı. Antikoagülanlı ve antikoagülansız tüpler, 30 dk içerisinde, 4ºC’de 2000 g’de 10 dk santrifüj edildi.
Ayrılan plazma ve serum örneklerinin bir kısmı, aynı gün diğer rutin analizlerde kullanıldı; geri kalanı, alikotlara ayrılarak ependorf tüplerde -70ºC’de dondurularak saklandı.
3.3. YÖNTEM
Çalışma gruplarının tam kan, plazma ve serum örneklerinde; rutin analizler ve biyokimyasal çalışmalar yapıldı.
3.3.1. Rutin Analizler
Çalışma gruplarından alınan tam kan örneklerinde, aynı gün HbA1C; serum örneklerinde, CRP, glukoz, kreatinin, ALT, AST, total protein, albümin, TG, TC ve HDL-C ölçümleri yapıldı.
• HbA1C ölçümü için Agilent 1100 marka HPLC cihazı kullanıldı.
• CRP, Dade Behring marka nefelometre cihazında çalışıldı.
• Glukoz, kreatinin, ALT, AST, total protein, albümin, TG, TC ve HDL-C düzeyleri Architect C8000 marka otoanalizörde uygun ticari kitler kullanılarak analiz edildi.
Serum LDL-C düzeyleri, Friedewald formülü kullanılarak hesaplandı.
LDL-C= TC - [ HDL-C + TG/5 ]
Serum TG düzeyinin > 400 mg/dL olduğu hastalarda, LDL-C ölçümü direk LDL-C ölçüm kiti kullanılarak otoanalizörde yapıldı.
3.3.2. Biyokimyasal Çalışma
Alikotlar halinde dondurularak çalışma gününe kadar saklanan serum örneklerinde ĐMA (71), MDA (75), sdLDL-C (55) düzeyleri ile PON1 (41) aktivitesi spektrofotometrik yöntemlerle ölçüldü. oxLDL (ELISA), ET-1 (ELISA), NO düzeyleri ile SOD aktivitesinin tayininde ticari kitler kullanıldı. ADMA ölçümü, HPLC cihazında yapıldı.
Çalışmada kullanılan yöntemlerin tekrarlanabilirliğini belirlemek amacıyla; rutin biyokimya sonuçlarına göre, sağlıklı olduğu kabul edilen kişilerden kan örnekleri
32
alınarak serum havuzu oluşturuldu. Bu havuzlarda yönteme uygun ölçümler yapılarak, değişim katsayısı (CV) değerleri hesaplandı.
3.3.2.1. Süperoksit Dismutaz Aktivitesi Tayini
Serum SOD aktivitesi, Cayman marka kit (Katalog No: 706002) ile tayin edildi.
Metodun prensibi, hipoksantin varlığında reaksiyon ortamına eklenen ksantin oksidaz tarafından oluşturulan O2˙radikalinin, nitroblue tetrazoliumu redükte etmesi ve bu yolla oluşan formazonların renk şiddetinin 450 nm dalga boyunda ölçülmesi esasına dayanır.
SOD; O2˙radikallerini, O2 ve H2O2’ye dönüştürerek nitroblue tetrazoliumun redüksiyonunu ve formazon oluşumunu engeller. Artmış renk şiddeti, SOD aktivitesinin azaldığını gösterir.
Çözeltiler
• SOD standart seri (0; 0.025; 0.05; 0.1; 0.15 ve 0.25 U/mL)
• Ksantin oksidaz
• Radikal dedektör (Nitroblue tetrazolium; çalışma tamponuyla hazırlandı)
• Örnek tamponu (50 mM Tris-HCl, pH:8)
• Çalışma tamponu ( 50 mM Tris-HCl, pH:8; 0.1 mM dietilentriaminpentaasetik asit ve 0.1 mM hipoksantin)
Çalışma
Çalışma öncesi serum örnekleri tamponla 1/2 oranında dilüe edildi.
Numune Standart Seri (1-6)
Radikal dedektör 200 µL 200 µL
Serum 10 µL -
Standart çözeltileri - 10 µL
Ksantin oksidaz 20 µL 20 µL
Yapışkan folyo ile kaplanan plate, oda sıcaklığında ve orbital karıştırıcıda 20 dk inkübe edildi. Absorbanslar 450 nm dalga boyunda okundu.
SOD içermeyen kuyucuk kör olarak kabul edildi ve aşağıda verilen denklem kullanılarak, standart serinin lineer oran (LR) değerleri hesaplandı.
LR = kör OD / standart OD
33 Standart Serinin Hazırlanması
Stok SOD çözeltisi, örnek tamponu ile uygun oranlarda dilüe edilerek, 0; 0.025; 0.05;
0.1; 0.15 ve 0.25 U/mL aktiviteye sahip standartlar hazırlandı. Enzim aktivitelerine karşılık gelen LR değerleri kullanılarak, SOD standart grafiği çizildi (Şekil 18).
y = 10,889x + 0,9748
Standart grafiği yardımıyla, numunelerin LR değerlerine karşılık gelen, SOD aktiviteleri hesaplanarak, dilüsyon faktörüyle çarpıldı.
Bir ünite SOD, süperoksit radikalinin % 50’sinin dismutasyonu için gerekli olan enzim miktarı olarak tanımlandı. Serum SOD aktivitesi, U/mL olarak verildi.
SOD aktivite tayininde kullanılan metodun CV değeri, % 3.6 bulundu.
Ölçüm sayısı X ± SD CV (%)
SOD (U/mL) 12 0.272 ± 0.0098 3.6
3.3.2.2. Paraoksonaz Aktivitesi Tayini
Serum PON aktivitesi, Eckerson ve ark (41) tarafından geliştirilen metot ile tayin edildi.
Metodun prensibi, paraoksonun, 25ºC’de PON tarafından hidrolizi ile oluşan sarı renkli p-nitrofenolün neden olduğu absorbans artışının, spektrofometrede 412 nm dalga boyunda zamana bağlı olarak izlenmesi esasına dayanır (41).
Çözeltiler
• 0.5 M Paraokson (metanolde hazırlandı)
• 0.1 M Tris-HCl tampon, pH 8.0
• 1.0 mM CaCl2 (50 mM Tris-HCl tamponunda hazırlandı)
LR
SOD Aktivitesi (U/mL)
34 Çalışma
Deney ortamında 50 mM Tris-HCl tamponu, 1.0 mM CaCl2 ve 1.0 mM paraokson olacak şekilde reaksiyon karışımı hazırlandı.
Kör Numune
Reaksiyon karışımı 1 mL 1 mL
Serum - 10 µL
Tip I su 10 µL -
Pipetleme işleminden hemen sonra, numune ve kör tüplerindeki absorbans artışı, tip I su körüne karşı, 25ºC’ de ve 412 nm dalga boyunda, 5 dk izlendi.
Hesaplama
Numune ve kör tüpleri için, ∆OD/dk değerleri hesaplandı ve numune ∆OD/dk değerlerinden kör değeri çıkarılarak, net ∆OD/dk değerleri bulundu.
Bir ünite PON, standart deney şartlarında, dakikada bir mikromol p-nitrofenol oluşumunu katalizleyen enzim aktivitesi (U/L: µmol PNP/dk/L) olarak tanımlandı (41).
p-nitrofenolün molar ekstinksiyon katsayısı (ε=16.7×103 M-1cm-1) kullanılarak, serum örneklerinin net ∆OD/dk değerlerinden ünite birimine geçildi.
U/L= net ∆OD/dk x total hacim (mL) x 106 µmol ε serum hacmi (mL) mol U/L= net ∆OD/dk x 1.010 x 106
16.7x103 0.010 U/L=net ∆OD/dk x 6048
Serum bazal PON aktivitesi, U/L olarak verildi.
PON aktivite tayininde kullanılan metodun CV değeri, % 4.4 bulundu.
Ölçüm sayısı X ± SD CV (%)
PON (U/L) 12 141.96 ± 6.34 4.4
3.3.2.3. Malondialdehit Tayini
Serum MDA düzeyleri, Ohkawa ve ark (75) tarafından geliştirilen metoda göre tayin edildi.
35
Metodun prensibi, lipid peroksidasyonu yıkım ürünlerinden olan MDA’nın tiyobarbitürik asit (TBA) ile oluşturduğu pembe renkli kompleksin renk şiddetinin 532 nm dalga boyunda ölçülmesi esasına dayanır (75).
Çözeltiler
• % 8.1 Sodyum dodesil sülfat (SDS)
• % 0.8 TBA
• % 20 Asetik asit, pH 3.5
• n-Bütanol/Piridin karışımı (15/1, v/v)
• 5.848 M MDA (stok standart) Çalışma
Standart Serinin Hazırlanması
Stok MDA (5.848 M) çözeltisi, tip I su ile uygun oranda dilüe edilerek, 100 µM konsantrasyonda ara stok standart çözeltisi hazırlandı. Ara stok standart, 0.25; 0.5; 1;
2; 3; 6 ve 10 µM konsantrasyonlarda olacak şekilde yeniden dilüe edildi. Standartlar da numune gibi çalışıldı. Standart konsantrasyonlarına karşılık gelen OD değerleri kullanılarak, MDA standart grafiği çizildi (Şekil 19).
Standart grafiği yardımıyla, numunelerin OD değerlerine karşılık gelen konsantrasyonları hesaplandı.
Kör Numune
Serum - 0.1 mL
SDS 0.1 mL 0.1 mL
Tip I su 0.4 mL 0.3 mL
Asetik asit 0.75 mL 0.75 mL
TBA 0.75 mL 0.75 mL
100ºC’de 60 dk inkübe edildi ve soğutuldu.
Tip I su 0.5 mL 0.5 mL
n-Bütanol/Piridin 2.5 mL 2.5 mL
4ºC’de 2000 g’de 10 dk santrifüj edilerek, organik ve su fazlarının ayırımı sağlandı. Pembe renkli üst fazın absorbansı köre karşı 532 nm dalga boyunda okundu.
36
Şekil 19. MDA Standart Grafiği
Serum MDA düzeyleri, µM olarak verildi.
MDA ölçümünde kullanılan metodun CV değeri, % 5.7 bulundu.
Ölçüm sayısı X ± SD CV (%)
MDA (µM) 10 1.48 ± 0.084 5.7
3.3.2.4. Okside LDL Tayini
Serum oxLDL düzeyleri, Đmmün Diagnostik marka ELISA kiti (Katolog No: K7810) ile ölçüldü. Ölçümde MDA-modifiye apo B 100’ü tanıyan antikorlar kullanıldı.
Metodun prensibi, yarışmasız olarak antijen-antikor komplekslerinin oluşumuna dayanır. Serumda bulunan oxLDL (antijen), antikorla kaplı kuyucuklara bağlanır.
Bağlanmayan antijen yıkama işlemiyle ortamdan uzaklaştırılır. Enzimle işaretli antikor eklenmesiyle oluşan, antikor-antijen-işaretli antikor komplekslerinin (sandwich) enzim substratıyla inkübasyonunu takiben oluşan rengin şiddeti, serumda bulunan oxLDL konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Çözeltiler
• Standart seri ( 0; 9 ; 27; 80 ve 250 ng/mL)
• Kontrol 1 (9-28 ng/mL)
• Kontrol 2 (46-107 ng/mL)
• Enzim konjugatı (peroksidaz ile işaretli keçi-anti-oxLDL antikoru)
• TMB (3,3’5,5’-tetrametil benzidin dihidroklorid) substrat çözeltisi
• Stop çözeltisi
37 Çalışma
Çalışma öncesi, plate yıkama tamponu ile 5 kez yıkandı. Örnek dilüsyon tamponuyla 1/10 oranında dilüe edilen serumlar kuyucuklara tatbik edildi.
oxLDL içermeyen (konsantrasyonu 0 ng/mL olan standart) kuyucuğun OD değeri, numune, kontrol ve standartların absorbans değerlerinden çıkarıldı.
Standart konsantrasyonlarına karşılık gelen OD değerleri kullanılarak, oxLDL standart grafiği çizildi (Şekil 20).
Şekil 20. oxLDL Standart Grafiği
Numune Kontrol (1 ve 2) Standart Seri (1-5)
Serum 100 µL - -
Kontrol çözeltileri - 100 µL -
Standart çözeltileri - - 100 µL
Yapışkan folyo ile kaplanan plate, oda sıcaklığında ve orbital karıştırıcıda 60 dk inkübe edildi. Đnkübasyonu takiben, her kuyucuk 250 µL yıkama tamponu ile 5 kez yıkandı.
Enzim konjugatı 100 µL 100 µL 100 µL
Yapışkan folyo ile kaplanan plate, oda sıcaklığında ve orbital karıştırıcıda 60 dk inkübe edildi. Đnkübasyonu takiben, her kuyucuk 250 µL yıkama tamponu ile 5 kez yıkandı.
TMB substrat çözeltisi 100 µL 100 µL 100 µL
Yapışkan folyo ile kaplanan plate, oda sıcaklığında ve karanlıkta 20 dk inkübe edildi.
Stop çözeltisi 50 µL 50 µL 50 µL
Enzimatik reaksiyon sonucu, oluşan rengin şiddeti, 450 nm’de okundu.
OD
oxLDL (ng/mL) y = 0,0054x + 0,0447
r = 0,9999
38
Standart grafiği yardımıyla, hesaplanan oxLDL konsantrasyonları dilüsyon faktörüyle çarpıldı ve ng/mL olarak verildi. Kontrol 1: 16.5 ve kontrol 2: 77.8 ng/mL bulundu.
3.3.2.5. Küçük Yoğun LDL-C Tayini
Küçük yoğun LDL-C, Hirano ve ark (55) tarafından geliştirilen metoda göre tayin edildi.
Metodun prensibi, dansitesi <1.044 g/mL olan lipoproteinlerin (VLDL, IDL, büyük LDL) heparin-MgCl2 kombinasyonu kullanılarak çöktürülmesinden sonra, HDL-C ve sdLDL-C içeren süpernatanda, homojenöz yöntem ile otoanalizörde, direkt LDL-C ölçülmesi esasına dayanır (55).
Çözeltiler
• 150 U/mL Heparin-sodyum tuzu
• 90 mM MgCl2
• Direk LDL-C ölçüm kiti Çalışma
Heparin-MgCl2 kombinasyonu, eşit miktarda serum ile karıştırıldı ve karışım 37ºC’de, 10 dk inkübe edildi. Đnkübasyon sonrası buz banyosunda 15 dk bekletilen numuneler, 4ºC’de, 10000 g’de, 15 dk santrifüj edildi. Elde edilen süpernatanda, direkt homojenöz metot ile LDL-C ölçümü yapıldı.
Aşağıda verilen denklem kullanılarak % sdLDL-C değerleri hesaplandı.
% sdLDL-C = sdLDL-C x 100
LDL-C
sdLDL-C ölçümünde kullanılan metodun CV değeri, % 5.8 bulundu.
3.3.2.6. ADMA Tayini
ADMA ölçümü, Eureka marka kitle HPLC cihazında (Shimadzu prominence) yapıldı.
Metodun prensibi, saflaştırma ve derivatizasyon işlemleri sonrası HPLC sisteminde ADMA’nın oluşturduğu fluoresansın, fluorometrik detektörle 420 nm (eksitasyon) ve 483 nm (emisyon) dalga boyunda ölçülmesi esasına dayanır.
Çözeltiler
39
• Tampon 1
• Tampon 2
• Başlatıcı solüsyon
• Derivatizasyon solüsyonu
• Stabilize edici solüsyon HPLC sisteminin özellikleri
Analitik kolon Spherisorb 250mmx4.6mm, 5µm Akış hızı 1 mL/dk
Uygulama süresi 4 dk Örnek hacmi 20 µL
Dalga boyu Emisyon / Eksitasyon: 483/420 nm Sensitivite 0.01 µM
Recovery >%98
Linearite 16 µM
Çalışma
Numune
Dilüsyon solüsyonu 1000µL
Serum 400µL
Tüpler vorteksle karıştırıldıktan sonra, numunelerden 1 mL alınarak kolonlara uygulandı. Yıkama ve elüsyon işlemlerini takiben toplanan süzüntü (elüat) vorteksle karıştırıldı.
Süzüntü 200µL
Tampon 1 200µL
Tampon 2 200µL
Başlatıcı solüsyon 30µL
Derivatizasyon solüsyonu 30µL
Tüpler vorteksle karıştırıldıktan sonra 20ºC’de 20 dk inkübe edildi.
Stabilize edici solüsyon 100µL
Tüpler vorteksle karıştırıldı. Karışımdan 100µL alınarak HPLC sistemine enjekte edildi.
40 Standart da numune gibi çalışıldı.
Şekil 21. Kontrol Grubuna Ait ADMA Kromatogram Örneği
Şekil 22. Diyabetik Ayak Grubuna Ait ADMA Kromatogram Örneği Serum ADMA düzeyleri, µM olarak verildi.
3.3.2.7. Nitrik Oksit Tayini
Serum NO ölçümü, Cayman marka kit (Katalog No: 780001) kullanılarak yapıldı.
Metodun prensibi, yarı ömrü çok kısa olan NO düzeylerinin, dayanıklı son ürünler olan nitrit (NO2¯) ve nitrat (NO3¯) konsantrasyonları üzerinden iki basamakta ölçülmesi esasına dayanır. Đlk basamakta, nitrat redüktaz kullanılarak NO3¯, NO2¯’ye dönüştürülür. Đkinci basamakta NO2¯, primer bir aromatik aminle (sülfanilamid) diazotizasyonun ardından N-(1-naftil) etilendiamin hidroklorid ile mor renkli azo bileşikleri oluşturur ve oluşan rengin şiddeti 540 nm’de ölçülür (Şekil 23) (76).
ADMA
ADMA
41 Şekil 23. Griess Reaksiyonu
Çözeltiler
• Çalışma tamponu
• Nitrat redüktaz
• Nitrat redüktaz kofaktörleri
• Nitrat standart seri (0; 5; 10; 15; 20; 25; 30 ve 35 µM)
• Griess 1 reaktifi (Sülfanilamid)
• Griess 2 reaktifi [N-(1-naftil) etilendiamin hidroklorid]
Çalışma
Çalışma öncesi serum örneklerine, Sartorius marka (25mm, 0.22µm) filtrelerle ultrafiltrasyon işlemi uygulandı. Bu işlem sonrasında örnekler, çalışma tamponuyla 1/2 oranında dilüe edildi.
Nitrat Redüktaz
Sülfanilamid Griess 1 reaktifi
N-(1-Naftil) etilendiamid hidroklorid
Griess 2 reaktifi
Diazonyum iyonu
Azo ürünü
Nitrat Nitrit
42
Kör Numune Standart Seri (1-8)
Çalışma tamponu 200 µL - -
Serum - 80 µL -
Standart çözeltileri - - 80 µL
Kofaktörler - 10 µL 10 µL
Nitrat redüktaz - 10 µL 10 µL
Oda sıcaklığında 3 saat inkübe edildi
Griess 1 reaktifi - 50 µL 50 µL
Griess 2 reaktifi - 50 µL 50 µL
Oda sıcaklığında 10 dk inkübasyon sonrası kuyucuklarda oluşan rengin şiddeti, 540 nm’de okundu.
Numune ve standartların OD değerlerinden, kör değeri çıkarıldı.
Standart Serinin Hazırlanması
Stok nitrat standart (200 µM) çözeltisi, çalışma tamponu ile uygun oranlarda dilüe edilerek, 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30 ve 35 µM konsantrasyonlarında standart seri hazırlandı. Standart konsantrasyonlarına karşılık gelen OD değerleri kullanılarak nitrat standart grafiği çizildi (Şekil 24).
Şekil 24. Nitrat Standart Grafiği
Standart grafiği yardımıyla, numunelerin OD değerlerine karşılık gelen konsantrasyonları hesaplanarak, dilüsyon faktörüyle çarpıldı.
OD
Nitrat (µM) y = 0,0267x + 0,0125
r = 0,9997
43 Serum NO düzeyleri, µM olarak verildi.
3.3.2.8. Endotelin-1 Tayini
Plazma ET-1 düzeyleri, Bachem marka ELISA kiti (Katalog No: S-1156) ile ölçüldü.
Metodun prensibi, ardışık yarışmalı immünokimyasal ölçüm esasına dayanır. Plate kuyucuklarına ilave edilen antikor, önce plazmada bulunan ET-1 (işaretsiz antijen) ile daha sonra ortama ardışık olarak eklenen işaretli antijen ile immün kompleksler oluşturur. Đnkübasyon sonrası bağlanmayan antijenler yıkama işlemiyle uzaklaştırılır.
Reaksiyon ortamına ilave edilen enzim, işaretli antijen-antikor komplekslerine bağlanır. Enzim substratıyla inkübasyonu takiben oluşan rengin şiddeti, plazmada bulunan ET-1 konsantrasyonu ile ters orantılıdır.
Çözeltiler
• Çalışma tamponu
• Standart dilüsyon tamponu
• Antikor
• ET-1 standart seri (0.05; 0.1; 0.39; 1.56; 6.25 ve 10 ng/mL)
• Biotinle işaretli peptid
• Streptavidin-Horseradish peroksidaz (SA-HRP)
• TMB (3,3’5,5’-tetrametil benzidin dihidroklorid) substrat çözeltisi ve H2O2
içerir.
• Stop çözeltisi (2N HCl)
44 Çalışma
Kör Numune Standart Seri (1-6)
Çalışma tamponu 25 µL - -
Antikor - 25 µL 25 µL
Oda sıcaklığında 60 dk inkübe edildi.
Standart dilüsyon tamponu 50 µL - -
Plazma - 50 µL -
Standart çözeltileri - - 50 µL
Oda sıcaklığında 120 dk inkübe edildi.
Biyotinle işaretli peptid 25 µL 25 µL 25 µL
4ºC’ de bir gece inkübe edildi. Đnkübasyonu takiben, her kuyucuk 300 µL çalışma tamponu ile 5 kere yıkandı.
SA-HRP 100 µL 100 µL 100 µL
Oda sıcaklığında 60 dk inkübe edildi. Đnkübasyonu takiben, her kuyucuk 300 µL çalışma tamponu ile 5 kere yıkandı.
TMB substrat çözeltisi 100 µL 100 µL 100 µL Oda sıcaklığında 30 dk inkübe edildi.
Stop çözeltisi 100 µL 100 µL 100 µL
Enzimatik reaksiyon sonucu, kuyucuklarda oluşan rengin şiddeti, 10 dk içinde 450 nm’de okundu.
Numune ve standardın OD değerlerinden kör değeri çıkarıldı.
Standart Serinin Hazırlanması
Stok ET-1 (1000 ng/mL) çözeltisi, standart dilüsyon tamponuyla uygun oranlarda dilüe edilerek, 0.05; 0.1; 0.39; 1.56; 6.25 ve 10 ng/mL konsantrasyonlarında standart seri hazırlandı. Standart konsantrasyonlarına karşılık gelen OD değerleri kullanılarak, ET-1 standart grafiği çizildi (Şekil 25).
45
Standart seriyi oluşturan konsantrasyonların logaritmik değerleri kullanılarak, grafik doğrusal hale getirildi (Şekil 26). Şekil 26. Logaritmik ET-1 Standart Grafiği
Logaritmik ET-1 standart grafiği yardımıyla, numunelerin absorbans değerlerine karşılık gelen logaritmik konsantrasyonlar hesaplanarak, antilogaritmaları alındı.
Plazma ET-1 düzeyleri, ng/mL olarak verildi.
3.3.2.9. Đskemi Modifiye Albümin Tayini
Serum ĐMA düzeyleri, Bar-Or ve ark (71) tarafından geliştirilen metoda göre tayin edildi.
Metodun prensibi, belli miktar ekzojen Co (II) iyonları ile inkübe edilen serum örneklerinde; albümine bağlanamayan serbest kobaltın, ditiyotireitol (DTT) ile oluşturduğu kırmızı-kahve renkli kompleksin renk şiddetinin 470 nm dalga boyunda
ET-1 (ng/mL)
Log ET-1 (ng/mL)
46
spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanır. Artmış renk şiddeti, albüminin kobalt iyonlarını bağlama kapasitesinin azaldığını gösterir (71).
Çözeltiler
• 9.72 mM DTT
• 4.2 mM Kobalt klorür (CoCl2 6H2O)
• 0.154 M NaCl
• 50 mM Tris-barbital tamponu, pH 8.6 Çalışma
Numune Numune körü
Serum 200 µL 200 µL
4.2 mM CoCl2 6H2O 50 µL 50 µL
50 mM Tris-barbital tamponu 200 µL 200 µL Tüpler, nazikçe karıştırılıp oda sıcaklığında 10 dk inkübe edildi.
9.72 mM DTT 50 µL -
Tip I su - 50 µL
Vorteks ile karıştırılan tüpler, oda sıcaklığında 2 dk inkübe edildi.
0.154 M NaCl 0.8 mL 0.8 mL
Numune ve numune körlerinin OD’leri, tip I su körüne karşı, 470 nm’de okundu.
Numune ve numune körlerinin absorbansları kullanılarak ∆OD değerleri bulundu.
ĐMA birimi, absorbans ünitesi olarak tanımlandı (ABS U) (71).
Çalışma gruplarında ölçülen ĐMA, serum örneklerinin OD değerleri (ABS U) şeklinde verildi.
ĐMA tayininde kullanılan metodun CV değeri, % 4.1 bulundu.
ĐMA tayininde kullanılan metodun CV değeri, % 4.1 bulundu.