T.C.
AYDIN ADNAN MENDERES ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ MĠKROBĠYOLOJĠ DOKTORA PROGRAMI
MARMARA BÖLGESĠNDE RUMĠNANT
ABORTLARINDA CHLAMYDİA ABORTUS’UN REAL TĠME
PCR ĠLE TEġHĠSĠ VE MULTĠLOKUS VNTR ANALĠZĠ ĠLE
GENOTĠPLENDĠRĠLMESĠ
MEHMET ENGĠN MALAL DOKTORA TEZĠ
DANIġMAN
Prof. Dr. Süheyla TÜRKYILMAZ
Bu tez Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Birimi tarafından VTF-18032 proje numarası ile desteklenmiĢtir.
AYDIN–2020
i
KABUL VE ONAY SAYFASI
T.C. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Doktora Programı çerçevesinde Mehmet Engin MALAL tarafından hazırlanan
“Marmara Bölgesinde Ruminant Abortlarında Chlamydia abortus‟un Real Time PCR ile TeĢhisi ve Multilokus VNTR Analizi ile Genotiplendirilmesi” baĢlıklı tez, aĢağıdaki jüri tarafından Doktora Tezi olarak kabul edilmiĢtir.
Tez Savunma Tarihi: 21/07/2020
Prof. Dr. Süleyman AYPAK Enstitü Müdür V.
Üye : Prof. Dr. ġükrü KIRKAN Aydın Adnan Menderes Üniversitesi ……
Üye : Prof. Dr. Mehmet AKAN Ankara Üniversitesi ……
Üye(T.D.): Prof. Dr. Süheyla TÜRKYILMAZ Aydın Adnan Menderes Üniversitesi ……
Üye : Doç. Dr. Özlem BÜYÜKTANIR YAġ Ġstanbul Ġstinye Üniversitesi ……
Üye : Doç Dr. Nural EROL Aydın Adnan Menderes Üniversitesi ……
ii
TEġEKKÜR
Doktora tez çalıĢmamda ilgi, yardım ve hoĢgörüsünü esirgemeyen danıĢmanım Prof. Dr.
Süheyla TÜRKYILMAZ‟a çok teĢekkür ederim. Ayrıca bana her konuda yardımcı olan ve desteğini esirgemeyen Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı BaĢkanı Prof. Dr. ġükrü KIRKAN, ve diğer öğretim üyelerine ve çalıĢmamdaki yardımlarından dolayı Ġstanbul Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü çalıĢanlarından Dr. Gülseren YILDIZ ÖZ, Dr. Belinda AYDIN, Dr. Mustafa Sencer KARAGÜL, Dr. Esra SATIR, Demet AYDOĞAN, Dr. Eray ATIL, Orbay SAYI, Gürkan ġĠMġEK ve desteğini esirgemeyen kurum müdürüm Dr. Fahriye SARAÇ ve teknik koordinatör Dr. AyĢe ATEġOĞLU‟na teĢekkürü bir borç bilirim.
Tez çalıĢmam süresince gösterdiği sabır, özveri ve destekleri için değerli eĢim Nuray MALAL ve biricik oğlum Engin Ege MALAL‟a ayrıca teĢekkür ederim.
iii
ĠÇĠNDEKĠLER
KABUL VE ONAY SAYFASI ………..……….……… i
TEġEKKÜR ……….……… ii
ĠÇĠNDEKĠLER .……….………...………….…. iii
SĠMGELER VE KISALTMALAR DĠZĠNĠ ..……….……….…. vi
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ .………….………...……… vii
RESĠMLER DĠZĠNĠ .………….………...……… viii
TABLOLAR DĠZĠNĠ .………….………...……….. ix
ÖZET ……… x
ABSTRACT ………. xi
1. GĠRĠġ ……….………...……….….. . 1
2. GENEL BĠLGĠLER ………..………...……... 3
2.1. Tarihçe ve Sınıflandırma………..…… 4
2.2. Morfoloji ve YaĢam Döngüsü…… .……….….…… ………... 6
2.3. Antijenik Yapısı………...……….………... 7
2.3.1. Lipopolisakkarit ...….…………...……… 7
2.3.2. Major DıĢ Membran Proteini ……….…………... 7
2.3.3. Polimorfik DıĢ Membran Proteinleri………..…………... 8
2.3.4. Kazaince Zengin DıĢ Zarf Proteinleri…… …………..……… 8
2.3.5. Isı ġok Proteinleri……… ………. 8
2.3.6. Glikolipid Antijenleri………….………... 9
2.4. Epidemiyolojisi………... 10
2.4.1. Konakçı Dağılımı……….. 10
2.4.2. Etkenin Dayanıklılığı……… 10
2.4.3. Hastalığın Dünyadaki Durumu……… 10
2.4.4. Hastalığın Türkiye‟deki Durumu……… 11
2.4.5. Enfeksiyon ve BulaĢma………. 12
2.5. Patogenez………. 14
2.6. Klinik Belirtiler……… 15
2.7. AĢılar ve BağıĢıklık……….. 16
2.8. Zoonotik Önemi………... 18
iv
2.9. TeĢhis……… 19
2.9.1. Serolojik Testler………. 19
2.9.2. Boyama Yöntemleri……….. 20
2.9.3. Antijen Tespiti………... 22
2.9.4. Moleküler Yöntemler……… 22
2.9.5. Ġzolasyon……… 25
2.10. Tedavi ve Kontrol...……… 25
3. GEREÇ VE YÖNTEM ……...……….……….. 27
3.1. Gereç ………....…..…………... 27
3.1.1. Örneklerin Toplanması………..…...………... 27
3.1.2. Kullanılan Cihazlar….….………..………..…..….………….. 28
3.1.3. DNA Ekstraksiyon Kiti………. 28
3.1.4. Mastermiks Kitleri………. 28
3.1.5. Agar Jel Elektroforez………. 29
3.1.6. Çözelti ve Tamponlar……… 29
3.1.6.1. Fosfat Tamponlu Tuz………. 29
3.1.6.2. TAE……… 29
3.1.7. Primer ve Problar……….. 29
3.1.8. Referans Kontroller………. 31
3.2. Yöntem ……… 32
3.2.1. DNA Ekstraksiyonu…… ………. 32
3.2.2. Real Time PCR ………....………...………..…………...…………. 33
3.2.2.1. Tespit Limitinin Belirlenmesi……… 33
3.2.2.2. Örneklerin Real Time PCR Ġncelenmesi……… 33
3.2.3. MLVA……….….………...….………. 35
3.2.3.1. PCR……… 36
3.2.3.2. Agaroz Jel Elektroforez……….. 37
3.2.3.3. Kapiller Elektroforez……….. 38
3.2.4. Sekans Analizi……….…….………. 38
3.2.5. Ġstatistiksel Analiz………. 39
4. BULGULAR ………... 40
4.1. Real Time PCR ………….………….……….………. 40
4.1.1. Analizin Tespit Limitinin Belirlenmesi .……… 40
v
4.1.2. Örneklerin Ġncelenmesi……..……… 41
4.2. Ġstatistiksel Analiz……….……… 43
4.3. MLVA……….……..………... 43
4.4. Sekans Analizi………...……….. 45
5. TARTIġMA …………...……….………...……...….………...…... 47
6. SONUÇ VE ÖNERĠLER ………..…………..……….…….. 53
KAYNAKLAR ..………...……...……… 55
Ek 1 (PEV-HADYEK Kararı) ………..………...………. 69
ÖZGEÇMĠġ ………...……… 70
vi
SĠMGELER VE KISALTMALAR DĠZĠNĠ
BGM : Buffalo green monkey BHK : Baby hamster kidney CFT : Komplement fikzasyon testi
CPAF : Proteaz / proteozom benzeri aktivite faktörü
CT : Cycle threshold
EB : Elementer cisimcik
FAT : Floresan antikor testi
Ġfu : Ġnkluzyon Ģekillendiren ünite
IgG : Ġmmunglobulin G
IgM : Ġmmunglobulin M
LPS : Lipopolisakkarit
MHC : Major histokompotabilite kompleks MLVA : Multilokus VNTR Analizi
MOMP : Major dıĢ membran proteini OIE : Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü Omp : DıĢ membran proteini
PBS : Fosfat Tamponlu Tuz
POMP : Polimorfik dıĢ membran proteini PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu RB : Retiküler cisimcik
RFLP : Restriction fragment length polimorfizm
rRNA : Ribozomal RNA
Snp : Tek nükleotit polimorfizmi VNTR : Variable number tandem repeat
vii
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
ġekil 1. C. abortus‟un yaĢam döngüsü………... 7 ġekil 2. Enfeksiyon ve bulaĢma yolları……….. 13 ġekil 3. C. abortus S26/3 DNA‟sının dilusyonlarının amplifikasyon eğrileri.……. 40 ġekil 4. Standart suĢun dilusyonlarının CT değerleri………. 41
viii
RESĠMLER DĠZĠNĠ
Resim 1. Enfekte hücrede inkluzyon cisimciği içerisinde elementer ve retiküler
cisimcikler………... 21
Resim 2. C. abortus enfeksiyonunda histopatolojik görünümler……….. 22 Resim 3. Alu 1 restriksiyon enzimi kullanılarak yapılmıĢ RFLP analizi………….. 23 Resim 4. C. abortus S26/3 suĢunun MLVA profilinin agaroz jel
görünümü……… 44
Resim 5. CAB267 gen bölgesi 212 bp büyüklükte bulunan bir suĢun sekans
analizi……… 46
ix
TABLOLAR DĠZĠNĠ
Tablo 1. ÇalıĢma örneklerinin illere ve hayvan türlerine göre dağılımı………….. 27
Tablo 2. Real Time PCR Analizi primer ve prob özellikleri……… 30
Tablo 3. MLVA primer özellikleri……….. 30
Tablo 4. Sekans analizleri için primer özellikleri………. 31
Tablo 5. Real Time PCR mastermiks karıĢımı………. 34
Tablo 6. Real Time PCR amplifikasyon koĢulları……… 34
Tablo 7. Multilokus VNTR analizinde C. abortus S26/3 için primer bağlanma bölgeleri ve amplikon büyüklükleri……….. 35
Tablo 8. MLVA için gen bölgeleri, tekrar üniteleri ve olası amplikon büyüklükleri……… 36
Tablo 9. Konvansiyonel PCR amplifikasyon koĢulları……… 37
Tablo 10. Tekrar sayılarına göre genotipik sınıflandırma………. 38
Tablo 11. Hayvan türlerine ve illere göre Real Time PCR sonuçları……… 42
Tablo 12. Küçük ruminantlardaki Real Time PCR analizi sonuçları……… 43
Tablo 13. Real Time PCR sonuçlarındaki farkılıkların istatistiki değerlendirmesi… 43 Tablo 14. C. abortus genotiplerinin hayvan türlerine göre dağılımı……….. 44
Tablo 15. Hayvan türlerine göre genotipik sınıflandırma……….. 45
Tablo 16. C. abortus S26/3 suĢunun MLVA gen bölgelerinin sekans dizinleri……. 45
x
ÖZET
MARMARA BÖLGESĠNDE RUMĠNANT ABORTLARINDA CHLAMYDİA ABORTUS’UN REAL TĠME PCR ĠLE TEġHĠSĠ VE MULTĠLOKUS VNTR ANALĠZĠ
ĠLE GENOTĠPLENDĠRĠLMESĠ
Malal, ME. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Mikrobiyoloji Programı, Doktora Tezi, Aydın, 2020.
Chlamydia abortus insanlarda ve birçok hayvan türünde hastalığa sebep olan Gram negatif, zorunlu hücre içi, zoonoz bir bakteridir. C. abortus’un ruminantlarda sebep olduğu enzootik abort hastalığı hemen hemen tüm dünyada yaygın olarak görülmektedir. Ülkemizde C.
abortus’un, abortif etkenler içerisindeki yerini gösterecek geniĢ çapta bir çalıĢma yapılmamıĢ olmakla birlikte; etkenin genotipleriyle ilgili yayınlanmıĢ herhangi bir veri de bulunmamaktadır. Bu çalıĢmanın amacı, Marmara Bölgesi‟ndeki ruminant abortlarında C.
abortus‟un teĢhisini yapmak ve etkenin genotiplerini belirleyerek bu anlamda ulusal ilk epidemiyolojik veriyi elde etmektir. Bu amaçla 12 ilden 267‟si sığır, 380‟i koyun, 70‟i keçi, 13‟ü mandaya ait toplam 730 abort materyali (fötal iç organlar, cenin mide sıvısı, plasenta, kotiledon, vaginal sıvap) C. abortus yönünden incelendi. ÇalıĢmada, abort materyalinden, düĢük tespit limitine sahip, tür spesifik Real Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) metodu ile etken DNA‟sı araĢtırıldı. Pozitif sonuçlara ait DNA‟lar Multilocus Variable Number Tandem Repeat (VNTR) Analysis (MLVA) yöntemi ile genotiplendirildi. 730 materyalden 87 (%11.9) tanesi C. abortus yönünden pozitif bulundu. Pozitiflik oranları keçilerde %21.4, koyunlarda %16.6, mandalarda %7.7 ve sığırlarda %3 olarak tespit edildi.
Genotiplendirme sonucunda hâkim genotip MLVA genotip 2 (%93.1) olarak bulundu ve genotip 3, 4, ve 5 ile birlikte toplam 4 farklı genotipin enfeksiyonlarda rol aldığı görüldü. Bu çalıĢma ile ülkemizde ilk kez C. abortus‟un genotiplendirilmesi yapılırken; bir manda fetusunda C. abortus tespit edildi. Ayrıca Marmara Bölgesi‟nde C. abortus‟un özellikle küçük ruminant abortlarının önemli bir kısmından sorumlu olduğu belirlendi. Etkenin zoonotik olması ve yaygın görülmesi sebebi ile ulusal strateji planı hazırlanmasının gerekliliği ve yurdumuzda diğer bölgelerde yapılacak benzer çalıĢmaların da etkenin yaygınlığının ve genotiplerinin ulusal çapta belirlenmesine katkı sağlayacağı sonucuna varıldı.
Anahtar kelimeler: Chlamydia abortus, genotyping, MLVA, Real Time PCR, VNTR.
xi
ABSTRACT
DIAGNOSIS OF CHLAMYDIA ABORTUS BY REAL TIME PCR IN RUMINANT ABORTIONS IN THE MARMARA REGION AND GENOTYPING
WITH MULTILOCUS VNTR ANALYSIS
Malal ME. Aydın Adnan Menderes University Health Sciences Institute of Microbiology Program, PhD Thesis, Aydın, 2020.
Chlamydia abortus is a Gram negative, obligate intracellular, zoonotic bacteria that causes disease in many animal species and humans. Enzootic abortion caused by C. abortus in ruminants is common almost all over the world. There is no extensive studies to show the place of C. abortus in abortive agents and no published data about the genotypes of the agent in our country. The aim of this study is to diagnose C. abortus in ruminant abortions in the Marmara Region and to determine the genotypes of the agent and obtain the first national epidemiological data in this sense. For this purpose, a total of 730 abortion materials (fetal tissues, fetal stomach contents, placentas, cotyledons, vaginal swabs) of 267 cattle, 380 sheep, 70 goats, 13 buffaloes were examined for C. abortus. In this study, DNA of the agent was investigated from abort materials by species specific Real Time Polimerase Chain Reaction (PCR) with low detection limit. DNAs of positive results were genotyped by Multilocus Variable Number Tandem Repeat (VNTR) Analysis (MLVA) method. From 730 materials, 87 (11.9%) were found positive for C. abortus. Positivity rates were 21.4% in goats, 16.6% in sheep, 7.7% in buffaloes and 3% in cattle. As a result of genotyping, the dominant genotype was found as MLVA genotype 2 (93.1%), and a total of 4 different genotypes with genotypes 3, 4, and 5 were involved in infections. With this study, genotyping of C. abortus and detection of the agent in a buffalo was done for the first time in our country. It was also determined that C. abortus was responsible for a significant part of small ruminant abortions in the Marmara Region. As the agent is zoonotic and widespread, it was concluded that the necessity of preparing a national strategy plan and similar studies in other regions of our country will contribute to the determination of the prevalence and genotypes on a national scale.
Keywords: Chlamydia abortus, genotyping, MLVA, Real Time PCR, VNTR.
1
1. GĠRĠġ
Chlamydia abortus ruminantlarda özellikle de koyun ve keçilerde abortla seyreden,
“Klamidiyozis” veya “Enzootik Abortus” olarak adlandırılan hastalığa neden olur (Szeredi ve Bacsadi 2002; Givens ve Morally, 2008). Hastalık; koyun ve keçilerde gebeliğin genellikle son 2-3 haftasında görülen abort, prematüre doğum, düĢük canlı ağırlıkta, zayıf yavru doğumu ve canlı olarak dünyaya gelen yavrunun 48 saat içerisinde ölmesi ile karakterizedir (Givens ve Morally, 2008).
Hastalık sürü içerisinde periyodik aralıklarla tekrarlar ve enzootik seyirli olan bu hastalığı kontrol altına almak oldukça zordur. Hastalık nedeniyle görülen kuzu ve oğlak kayıpları, hasta hayvanların tedavi giderleri ve süt verimindeki azalma gibi faktörler dikkate alındığında çok önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır (Longbottom ve ark, 2002; Carter ve Wise, 2004). Etken koyun ve keçilerden baĢka, sığırlarda, domuzlarda da abortlara neden olur. Ayrıca insanların da hastalığa duyarlı olması ve düĢüklere sebep olması açısından halk sağlığı riski oluĢturmaktadır (Ward, 2006).
Etken dünyanın birçok bölgesinde koyun ve keçi abortlarının en önemli sebebidir ve endemik seyir gösterir (Essig ve Longbottom, 2015). Durum ülkemizin sınır komĢuları için de benzerdir. Yapılan moleküler çalıĢmalarda; Bulgaristan‟da görülen küçük ruminant abortlarının %35.8 gibi çok yüksek bir oranının C. abortus‟tan kaynaklandığı ortaya konulmuĢtur (Simeonov ve Chilingirova, 2018). Ġran‟da yapılan çalıĢmalarda küçük ruminant abortlarında %11.0 ile %38.0 arasında değiĢen oranlarda C. abortus tespiti yapılmıĢtır (Ebadi ve ark, 2015; Barati ve ark, 2017; Heidari ve ark, 2017). Yunanistan‟da yapılan serolojik çalıĢmada koyunlarda %14.9, keçilerde %21.2 oranında pozitiflik belirlenirken (Bisias ve ark, 2010), genotipik olarak tüm dünyadan ayrıĢan 2 farklı suĢ tespit edilmiĢtir (Siarkau ve ark, 2002; Laroucau ve ark, 2009).
C. abortus genetik açıdan çok homojen bir türdür. C. abortus‟un genotiplendirilmesinde en çok tercih edilen yöntemler Multilokus Sekans Tiplendirme (MLST) ve MLVA‟dır. Bu yöntemlerden MLST yöntemi C. abortus‟u 5 farklı genotipe ayırabilirken, MLVA ile 7 farklı genotip elde edilebilmektedir (Siarkou ve ark, 2015). Ayrıca MLVA yöntemi abort materyalinden direkt tiplendirme yapmaya müsaittir (Laroucau ve ark, 2009). Bu yöntem bakteri genomundaki ardıĢık tekrar polimorfizmleri belirlemeye dayalıdır (Vergnaud ve Pourcel, 2006).
2 Türkiye‟de genellikle etkenle ilgili serolojik çalıĢmalar yapılmıĢ; koyunlarda ELISA ile Düzce‟de %20.8 (Karagül ve ark, 2019) ve Burdur‟da %32.0 (Öztürk ve ark, 2016) gibi nispeten yüksek seropozitiflik oranları bildirilmiĢtir. Yurdumuzda moleküler çalıĢmalar ve izolasyon çalıĢmaları ile etkenin varlığı ortaya konulmuĢ olmakla birlikte, bu çalıĢmalar ulusal anlamda hastalığın yaygınlığı ile ilgili yeterli veriyi sunmaktan uzaktır. Türkiye‟de C.
abotus‟un izolasyonu ile ilgili ilk çalıĢma Türütoğlu ve ErganiĢ tarafından 1996 yılında gerçekleĢtirilmiĢ ve koyun abort materyalinden %16.6 oranında izolasyon yapıldığı bildirilmiĢtir. Daha sonra, Güler ve ark (2006) ve Kalender ve ark (2013) koyun abortlarından konvansiyonel PCR yöntemiyle sırasıyla %7.4 ve %9.8 pozitiflik elde etmiĢlerdir. Türkiye‟nin sınır komĢusu Yunanistan‟da iki varyant suĢu tespit edilmiĢtir (Siarkou ve ark, 2002). Ancak, Türkiye‟de etkenin genotipleriyle ilgili herhangi bir veri bulunmamakla birlikte; Türkiye‟de de coğrafi konumu gereği farklı tiplerde suĢların bulunabileceği düĢünülmektedir ve Ģimdiki bilgilerimize göre yurdumuzda seçicilik ve duyarlılığı en yüksek yöntemlerden biri olan Real Time PCR ile yapılmıĢ bir çalıĢmaya rastlanılmamıĢtır. Bu yönüyle çalıĢmamız hem bütün bir coğrafi bölgeyi kapsaması, hem de Real Time PCR yöntemi ile yapılması sebebiyle ulusal anlamda bir ilktir. Bu çalıĢmada, Marmara Bölgesi‟nde görülen ruminant abortlarında C. abortus‟un Real Time PCR ile teĢhisinin yapılarak MLVA ile genotiplendirilmesi amaçlanmıĢtır. Böylece, hastalığın Marmara Bölgesi‟nde görülen abort vakaları içerisindeki önemi belirlenerek, hayvan sağlığı ve halk sağlığı açısından daha iyi anlaĢılmasına ve hastalıkla mücadele stratejisinin oluĢturulmasına katkı sağlanacaktır. Ayrıca Marmara Bölgesi‟nde mevcut olan etkenin genotiplerinin belirlenerek bu alanda Türkiye‟deki ilk epidemiyolojik verinin elde edilemesinin, diğer coğrafik bölgelerde yapılacak benzer çalıĢmalara öncü olacağı ve dolayısıyla, ulusal olarak C. abortus‟un genotipik çeĢitliliğinin belirlenmesinin ilk adımı olacağı değerlendirilmektedir.
3
2. GENEL BĠLGĠLER
Klamidya türleri kanatlılar, memeliler ve insanlarda çok farklı hastalıklara yol açan obligat intrasellüler bakterilerdir. Son zamanlarda kabul gören sınflandırmaya göre, Chlamydiaceae familyası içerisinde Chlamydia tek cins olarak kabul edilmektedir. Chlamydia abortus ve Chlamydia pecorum türleri ruminantlarda hastalık oluĢturan türlerdir. Sığırlarda klamidyaların sebep olduğu enfeksiyonlar çoğunlukla reprodüktif bozukluklar olup abort, endometritis, vaginitis gibi klinik belirtilere neden olmaktadır (Longbottom ve Coulter, 2003).
Yavru atan hayvanlarda infeksiyöz elementer cisimcikler her türlü vücut salgıları ile (vajinal akıntılar, süt, dıĢkı, nasal ve oküler akıntılar) çevreye bulaĢmaktadır. C. abortus infertiliteye ve embriyonik ölüme sebep olmakla birlikte semen ile de nakledildiği de bilinmektedir.
Yabani hayvanlar da bu mikroorganizmanın rezervuarı olarak hastalığın yayılmasına sebep olurlar. Gebe olmayan hayvanlarda mikroorganizma gebeliğin baĢlangıcına kadar lenfoid dokularda latent formda bulunur. Bununla birlikte, abortus meydana gelinceye kadar enfeksiyon serolojik olarak ya da patojenin direk tespiti yoluyla saptanamamaktadır (Longbottom ve Coulter, 2003).
C. abortus laboratuvar ortamında oldukça zor (doku kültürü, embriyolu tavuk yumurtası, laboratuvar hayvanlarında) üretilebilmektedir. C. abortus‟u üretebilmek için plasenta, fetal organlar, vaginal akıntı ve semen gibi biyolojik örnekler sıklıkla kullanılmaktadır. En çok kullanılan yöntemler embriyolu tavuk yumurtası, sürekli hücre kültürü, protein tespiti ve nükleik asit tespiti gibi tekniklerdir. En çok kullanılan serolojik yöntemler ELISA ve komplement fikzasyon testidir (CFT) (Longbottom ve Coulter, 2003).
CFT uzun yıllar boyunca hastalık teĢhisinde kullanılmıĢ olsa da klamidyal antijenin büyük oranda tüm Chlamydiaceae için ortak olan LPS içermesi sebebiyle hatalı pozitifliklere sebep olmaktadır. ELISA yöntemleri ise tarama amaçlı kullanımda faydalı görülmektedir (WEB_2).
Son zamanlarda etkenin abort materyalinden doğrudan teĢhisini yapabilmesi, hızlı ve güvenilir sonuçlar vermesi sebebiyle moleküler yöntemler tercih edilmektedir. Bu yöntemlerden tür düzeyinde teĢhis yapabilen, düĢük tespit limitine sahip, validasyon çalıĢmaları yapılmıĢ ve dünya hayvan sağlığı örgütü (OĠE) tarafından önerilen yöntemlerden biri olan Real Time PCR yöntemi (Sachse ve ark, 2009) çalıĢmanın teĢhis basamağında kullanılmıĢtır. Fenotipik ve moleküler araĢtırmalar C. abortus‟un genetik heterojenitesinin düĢük olduğunu göstermiĢtir. Ancak C. abortus, genomundaki ardıĢık tekrar polimorfizmlere
4 göre sınıflandırma yöntemi olan MLVA ile farklı genotiplere ayrılabilmiĢtir (Laroucau ve ark, 2009; Siarkou ve ark, 2015).
2.1. Tarihçe ve Sınıflandırma
C. abortus, Chlamydiaceae ailesinin bir üyesidir. Bu ailede yer alan bakteriler, bir çok hayvan türünü ve insanı etkileyen çok çeĢitli hastalıklara yol açar. Bunlardan bazıları abort, ensefalomiyelit, pnömoni, konjuktivit, artrit, mastit, gastroenterit, solunum sistemi enfeksyionları, trahoma, psittakoz, metrit ve cinsel yolla bulaĢan hastalıklardır (Longbottom ve Coulter, 2003).
Klamidya‟nın tanımı 1907 yılına dayanmaktadır. Halberstaedter ve Von Prowazek (1907) bir trahoma vakasına ait konjuktival kazıntıda Giemsa boyamada intrastoplazmik vakuoller içerisinde etkeni görmüĢler ve protozoon olduğunu değerlendirerek etkene Chlamydozoa ismini vermiĢlerdir. Bu isimlendirmeyi Yunanca örtülü anlamına gelen Chlamys/khlamus‟tan esinlenerek yapmıĢlardır. Daha sonra aynı etkeni üretrit, servisit, yeni doğan konjuktiviti, lenfogranuloma venereum vakalarından tespit edilmiĢtir (Lindner, 1910;
Durand ve ark, 1913). 1929-1930 yıllarında dünya çapında pandemiyle seyreden , psitasin kuĢlarla temas halindeki insanlarda görülen akut ve atipik pnömoni vakalarında hem kuĢlarda, hem insanlarda bulunan etkenin psitakoz etkeni de olduğu ortaya çıkmıĢtır (Bedson ve ark, 1930). Hastalık etkeni, bakteriyel filtrelerden geçebildiği ve besiyerinde üremediği için virüs olarak nitelendirilmiĢtir (Miyagawa ve ark, 1935). Rake ve Jones (1942) bir komplement fikzasyon antijeni identifiye etmiĢler ve bunun hastalığa neden olan etken olabileceğini bildirmiĢtir. 1966‟da elektron mikroskopla etkenin yapısı incelendiğinde Gram negatif bakterilerin hücre duvarı yapısının olduğu, DNA, RNA ve ribozom içerdiği görülmüĢ ve bakteri olarak sınıflandırılmıĢtır (Moulder, 1966). Chlamydiae ilk olarak embriyolu yumurtanın korioallontoik zarında kültüre edilmiĢtir. Daha sonra T‟ang ve ark (1957) trahoma suĢunu embriyolu tavuk yumurtasının sarı kesesinde kültüre etmiĢlerdir. O zamandan beri mikrobiyologlar etkenin daha derin morfolojik özelliklerini incelemek için bu yöntemi kullanmaktadırlar. ġu anda Chlamydiaceae bir çok monolayer hücre hattında üretilebilmektedir(Omsland ve ark, 2012). Chlamydia trachomatis için hücre içermeyen saf üretim çalıĢmaları da yapılmaktadır.(Nunes ve Gomes, 2014).
5 Önceleri Chlamydiaceae ailesinin sadece Chlamydia isminde tek bir cinsinin olduğu kabul edilirdi. Bu cinse ait 4 tür tanımlanırdı. Bunlar C. trachomatis, C. pcittaci, Chlamydia pneumoniae ve C. pecorum‟du (Borel, 2008). Daha sonra Everett ve Andersen (1999) 16S ve 23S rRNA sekans analizleri ile Chlamydiaceae ailesini, Chlamydia ve Chlamydophila olarak iki cins Ģeklinde tanımladılar (Everett, 2000). Bu tanımlamadan sonra yapılan çalıĢmalarda, sekans datalarının yetersiz olduğu ve tek cins olması gerektiği savunulmuĢtur (Schachter ve ark, 2001). Bunun üzerine 2009 yılında yine tek cins olarak sınıflandırılmıĢtır. Bu cinsin içinde Chlamydia muridarum, Chlamydia. pneumoniae, Chlamydia pecorum, Chlamydia suis, Chlamydia abortus, Chlamydia felis, Chlamydia caviae, Chlamydia psittaci ve Chlamydia trachomatis olmak üzere 9 tür bulunmaktadır. (Stephens ve ark, 2009).
C. trachomatis: Ġnsanlarda hastalık etkenidir. Nadiren koalalarda hastalık yapar. ÇeĢitli hastalıklara yol açan çok sayıda serovarı bulunmaktadır. Neden olduğu hasatlıklar; trahoma, pnömoni, artrit, yenidoğanlarda konjuktivit, lenfogranuloma venereum, prostit ve diğer ürogenital yol enfeksiyonlarıdır.
C. suis: Önceden domuzların C. trachomatis‟i olarak adlandırılırdı. Domuzlarda enterit, konjuktivit ve pnömoniye sebep olur.
C. muridarum: Farelerin C. trachomatis‟i olarak adlandırılır. Fare, gine domuzu ve hamsterlarda solunum sistemi enfeksiyonuna yol açar.
C. psittaci: Ġnsan psittakozuna ve kanatlı klamidyozisine sebep olur.
C. abortus: Daha önce yapılan çalıĢmalarda C. psittaci serotip I olarak adlandırılırdı.
Koyunlarda enzootik aborta, sığır, domuz ve keçilerde klamidyal aborta sebep olur.
C. caviae: Eski çalıĢmalarda Chlamydia psittaci’nin gine domuzu suĢu olarak bilinirdi. Gine domuzlarında konjuktivite sebep olur.
C. felis: Chlamydia psittaci’nin kedi suĢu olarak bilinirdi. Kedilerde konjuktivite ve pnömoniye sebep olur.
C. pneumonia: Ġnsanlarda, sürüngenlerde, amfibilerde, koalalarda ve atlarda solunum sistemi enfeksiyonuna yol açar.
C. pecorum: Koyun, keçi, sığır ve domuzlarda pnömoni, enterit, artrit, poliartrit, konjuktivit, abort ve sporadik bovine ensefalitise sebep olur (WEB_1, 2017).
2014 yılında bu türlere 2 tane daha eklenerek tür sayısı 11‟e çıkmıĢtır. Chlamydia avium güvercinlerde hastalığa sebep olurken, Chlamydia gallinacea tavuk, hindi ve beç tavuklarında enfeksiyona yol açtığı tespit edilmiĢtir (Sachse ve ark, 2014).
Ayrıca mısır turnasından izole edilen Chlamydia ibidis (Vorimore ve ark, 2013), Ģahinlerden izole edilen Chlamydia buteonis (Laroucau ve ark, 2019), yılanlardan tespit edilen
6 Chlamydia sanzinia, Chlamydia serpentis ve Chlamydia poikilothermis (Taylor-Brown ve ark, 2016; Staub ve ark, 2018) yeni aday türlerdir.
2.2. Morfoloji ve YaĢam Döngüsü
C. abortus; Gram negatif, pleomorfik, hareketsiz, zorunlu hücre içi bir bakteridir.
Etkenin kendisine özgü bir yaĢam döngüsü vardır. Etken konakçı hücrelerinde retiküler cisimcik (RB) ve elementer cisimcik (EB) olmak üzere 2 farklı formda bulunur (Litwin, 1959). EB metabolik olarak inaktif, infeksiyöz ve çevresel etkenlere karĢı dirençli, RB ise metabolik olarak aktif, çoğalan ancak infeksiyöz olmayan formudur. Elementer cisimcikler yaklaĢık 0,3 µm boyutunda, küçük, oval Ģekillidir. Merkezi ve yoğunluğu yüksek bir çekirdek içerir. Sert hücre duvarıyla spor benzeri bir formdur. Çevresel Ģartlara çok dayanıklıdır.
Retiküler cisimcik ise elementer cisimciğe göre daha büyüktür. YaklaĢık 1 µm boyutundadır.
Yapısal olarak esnektir. RNA açısından daha zengindir ve yoğun DNA içerir. Yapısal özellikleri intraselüler çoğalma, nutrisyonel faktörleri alma, atıkları uzaklaĢtırma gibi metabolik aktiviteleri yapmasına olanak sağlar (Moulder, 1991).
Enfeksiyonu takiben 0.25 µm büyüklüğünde, küre biçimli ve hayli enfeksiyöz olan elementer cisimcikler giriĢ yoluna bağlı olmak üzere konakçının solunum, gastroenterik veya genital kanalındaki fagositik hücrelere veya mukoza epiteline lokalize olurlar. Daha sonra bakteri, 4 fazda konakçı hücresindeki geliĢimini tamamlar (Carter ve Wise, 2004).
Faz 1: Uyuyan faz olarak bilinir. Bu fazda metabolik aktivite çok düĢüktür. Elementer cisimciğin konakçı hücrelerce, özellikle trofoblast hücrelerince fagosite edilmeden önce hücreye bağlandığı fazı tarif eder.
Faz 2: Bu fazda elementer cisimcikler fagosite edilerek, inklüzyon denilen endozomal vakuoller oluĢur. Bu inklüzyonlar lizozomlarla parçalanamaz. Metabolik aktivite 12 – 24 saat içerisinde baĢlar.
Faz 3: Metabolik aktivitenin baĢlamasında 24 – 48 saat sonra elementer cisimciğin çekirdeği dağılmaya baĢlar ve bu dağılma sonucunda retiküler cisimcik oluĢur. Bu adımı retiküler cisimciklerin inkluzyon içerisinde ikiye bölünerek çoğalması izler.
Faz 4: Çoğalma tamamlandığında olgun retiküler cisimcikler son bölünmeden 20 – 30 saat sonra tekrar elementer cisimciklere dönüĢürler. Daha sonra hücre lize olarak yüksek infektivitedeki elementer cisimcikler, yeni bir konakçıya tutunup yeni bir döngüyü baĢlatır (Moulder, 1991; Carter ve Wise, 2004).
7 Dördüncü fazı tamamlayan elementer cisimciklerin sayısı milyonları bulur ve bunlar uterus akıntıları, süt, idrar, dıĢkı yoluyla tekrar saçılırlar.
ġekil 1. Chlamydia abortus‟un yaĢam döngüsü (Samkange, 2008).
2.3. Antijenik Yapısı
2.3.1. Lipopolisakkarit (LPS)
Bakterinin antijenik yapısında yer alan lipopolisakkaritler ısıya dayanıklıdır.
Chlamydiaceae ailesinin tüm üyelerinde ortak olarak bulunur. Hücre duvarının bileĢenlerinden biridir. Chlamydiaceae için CFT ve ELISA gibi serolojik testlerde kullanılır (Everett, 2000).
2.3.2. Major DıĢ Membran Proteini (MOMP)
Patojen – konakçı etkileĢiminde, bakterinin korunma mekanizmasında ve immunopatolojide önemli rol oynar (Lampe ve ark, 1993). LPS ile birleĢerek kompleks
8 moleküler form oluĢturur. Enfeksiyöz elementer cisimciklerin yüzeyindeki baskın antijenik yapıdır. MOMP, ompA genleri tarafından kodlanır. Bu genler VS1 - VS4 olarak adlandırılan farklı segmentler içerirler. Bu segmentler C. abortus ve C. pecorum‟da farklıdır. Bu bölgelere spesifik monoklonal antikorlar kullanılarak tür bazında tespit yapılabilir (Everett, 2000).
2.3.3. Polimorfik DıĢ Membran Proteinleri (POMP)
Bir tür MOMP olarak görülür. Özellikle C. abortus S26/3 suĢunun hücre zarında olduğu düĢünülmektedir. 4 tane gen tarafından kodlanır. POMP90 isimli 90 kda ağırlığındaki POMP‟un Chlamydia abortus‟un serolojik teĢhisinde kullanılabileceği düĢünülmüĢtür (Longbottom ve ark, 1998).
2.3.4. Kazeince Zengin DıĢ Zarf Proteinleri
Sırasıyla omp3 ve omp2 genleriyle kodlanan A ve B zarflarıdır. RB olarak sentezlenip EB‟ye dönüĢürler. Her iki zarf da ozmotik stabiliteyi artıran kompleks yapı oluĢumunu sağlarlar (Everett ve Hatch, 1995).
2.3.5. Isı ġok Proteinleri
DıĢ membran kompleksinde bulunan ısı Ģok proteinleri prokaryot ve ökaryot hücrelerde yaygın olarak bulunur ve yapısı oldukça iyi Ģekilde korunmuĢtur. Isı Ģoku yanıtı hücrelerin veya bakterilerin değiĢen çevresel koĢullarda hayatta kalmasındaki en önemli mekanizmalardan biridir. Isı Ģoku yanıtı stres koĢulları altında transkripsiyonu tetikleyerek bakterilerin kısa süreler içerisinde yeni proteinler sentezlemesini sağlar. Klamidya kültürleri 42-45 °C ısıda tutulduklarında birkaç dakika içerisinde transkripsiyon seviyesinde düzenlenmiĢ ısı Ģok yanıtı geliĢtirmektedir. Escherichia coli groEL'in ve dnaK genlerinin ilgili homologları olduğu tespit edilen genler, 10, 60 ve 70 kD olan ısı Ģok preoteinlerini klonlar ve dizer. Bu klamidyal genler, klamidyal yaĢam döngüsü boyunca temel olarak eksprese edilir. Isı stresi sırasındaki regülasyonlarda da novo protein sentezi gerektirir.
Klamidya' daki groEL ve groES genleri, polististronik haberci RNA transkriptlerine sahip bir
9 kalıtım bölgesi oluĢturur. Klamidya genom dizilemesinden elde edilen veriler hepsinin bakterinin tüm yaĢam döngüsü sırasında iĢlevsel olup olmadığı belli olmayan üç groEL kopyası olduğunu göstermiĢtir. dnaK geninin ekspresyonu, ısı Ģokuna maruz kaldıktan sonraki 10 dakika içinde en az 10 kat artar ve oluĢan transkriptler yaklaĢık 5 dakikalık yarı ömüre sahiptir. Her üç ısı Ģok proteinleri temel dıĢ membran kompleksinde ve kısımlarında yer alır. Ayrıca bu ısı Ģok proteinleri Klamidya türlerinde çok iyi korunmuĢtur. Protein düzeyinde benzerlikleri % 95 „den fazladır. Klamidyanın immünobiyolojisi için önemli olan bu ısı Ģok proteinlerinin, diğer bakteri türleriyle amino asit açısından % 60 ve insan ısı Ģok proteinleri ile yaklaĢık % 50 homolojiyi paylaĢır. DnaK (hsp70) protein ailesi, hücre içi taĢınmada polipeptitlerin bağlanması, katlanması ve translokasyonunda yer almaktadır.
Hsp60' ın klamidya içindeki fonksiyonu tam olarak bilinmemektedir. Ancak Escherichia coli'nin yüzeyinde eksprese edilen rekombinant hsp70'in, bakterilerin insan endometrial epitel hücrelerine bağlanmasına neden olduğu ve bu nedenle bir ligand fonksiyonuna sahip olduğu gösterilmiĢtir. Bu proteine karĢı oluĢan antikor klamidya enfektivitesini in vitro olarak nötralize eder. GroEL ve GroES (hspl0 ve hsp60) protein ailelerinin, yeni sentezlenmiĢ oligomerik peptitlere refaket ettiği ayrıca katlanma ve translokasyonda rolleri olduğu bildirilmiĢtir. Klamidyal hsp 60 bakterinin tüm yaĢam döngüsü boyunca görülür. Isı Ģok proteinlerinin hücre içi transport mekanizmalarında, büyük moleküllerin oluĢturulması ve ayrıĢtırılmasında ve anormal veya fonksiyonunu kaybetmiĢ moleküllerin parçalanmasında rol aldığı da düĢünülmektedir. Hücresel immun aktivasyona yanıt olarak, protein katlanması ve degredasyonunda rol alırlar (Raulston, 1995; Peeling ve Mabey, 1999; Lund, 2001).
2.3.6. Glikolipid Antijenleri
Klamidyalar cins spesifik glikolipid antijeni sentezlerler. Bu antijenler enfeksiyon sonrası hücre kültürlerinde 48 – 72 saat sonra ve embriyolu tavuk yumurtalarında Elementer cisimciklerde tespit edilmiĢlerdir. Lipopolisakkaritin iç yapısında bulunur (Stuart ve ark, 1994).
10 2.4. Epidemiyolojisi
2.4.1. Konakçı Dağılımı
C. abortus esas olarak koyun ve keçilerin hastalığıdır. Bununla beraber, daha az sıklıkla sığırlarda, mandalarda, domuzlarda, atlarda, geyiklerde, lamalarda ve insanlarda enfeksiyona yol açar (Wang ve ark, 2001; Borel, 2008). Etken ayrıca Gine domuzu, tavĢan, fare, yeĢil deniz kaplumbağası, yılanlar ve kurbağadan izole edilmiĢ olsa da, hastalıkla direkt iliĢkisi henüz ispatlanmıĢ değildir (WEB_1, 2017). Çin‟de kürkü için yetiĢtirilen tilki, rakun ve vizonlarda etken tespiti yapılmıĢ ve bu hayvanların taĢıyıcı olduğu ve halk sağlığı açısından risk oluĢturabileceği değerlendirilmiĢtir (Li ve ark, 2018).
2.4.2. Etkenin Dayanıklığı
Elementer cisimcikler çevrede, ılıman mevsimlerde günlerce, donma ısısına yakın ısılarda ise aylarca canlı ve enfeksiyöz olarak kalabilir (Borel, 2008). Elementer cisimcikler toprak ve dıĢkıda ise uzun süreler canlı kalır (Carter ve Wise, 2003).
Diğer bir çok bakteri gibi otoklavda 1210C‟de 15 dakikada, 1600C – 1700C kuru sıcakta 1 saatte ölür. Bir çalıĢmada Chlamydia trachomatis‟in %0.25- 2.5 sodyum hipoklorit,
%70 etanol, %2 glutaraldehit, ortofitalaldehit, %7.5 hidrojen peroksit ve %0.2 perasetik asite duyarlı olduğu bulunmuĢtur. Kuaterner amonyum bileĢiklerinin etkili olduğu düĢünülmektedir. C. pcittaci‟nin asit ve alkali dezenfektanlara dirençli olduğu raporlanmıĢtır (Smith ve ark, 2005; Coulon ve ark, 2012).
2.4.3. Hastalığın Dünyadaki Durumu
Hastalık ilk kez Almanya‟da raporlanmıĢtır. Hastalık etkeni dünyada aborta neden olan ana etkenlerden biri olarak kabul edilir; yapılan sıralamada aborta sebep olan etkenler arasında ikinci sıradadır. Birinci sırada olan Bruselloz ise etkin mücadeleyle bir çok ülkede kontrol altına alınmıĢtır (Rodolakis, 2001). Yeni Zelenda ve Avustralya hastalıktan aridir.
Kuzey Avrupa‟da en önemli enfeksiyöz abort etkenidir. BirleĢik Krallık‟ta 1995-2008 yılları arasında görülen ve teĢhisi yapılan enfeksiyöz abort etkenleri arasında C. abortus‟un oranı
11
%44 olarak bulunmuĢtur (Stuen ve Longbottom, 2011). Ġspanya‟da ise küçük ruminant abortlarında C. abortus‟un oranı %56‟ya kadar çıkmaktadır. Borel ve ark (2004) Ġsviçre‟de C.
abortus‟un seroprevalansını %19 olarak belirlemiĢlerdir. Tunus yine Klamidyal abortların yüksek olarak görüldüğü bir ülkedir. Tunus‟ta C. abortus kaynaklı abort oranı %58 seviyesinde bulunmuĢtur (Rekiki ve ark, 2002). Enfeksiyonun yüksek oranda görüldüğü ülkelerden bir diğeri Ürdün‟dür. Al-Qudah ve ark (2004) yaptıkları bir çalıĢmada, abortların görüldüğü aĢılanmamıĢ 56 sürüyü komplement fikzasyon testi (CFT) ile kontrol etmiĢler ve sürülerin tamamının C. abortus yönünden pozitif olduğunu bildirmiĢlerdir. Amerika BirleĢik Devletleri‟nde ilk doğumunda abort yapan keçilerden en çok izole edilen etkendir (Aiello ve Mays, 1998). Hastalığın Meksika‟daki varlığı serolojik ve moleküler olarak gösterilmiĢtir (Campos-Hernández ve ark, 2014). Çin‟de yapılan çalıĢmada keçilerde seroprevalans %8.5 olarak tespit edilmiĢtir (Hu ve ark, 2018). Yunanistan‟ ın güneyinde yapılan serolojik çalıĢmada C. abortus’a karĢı antikor yanıtları koyunlarda %14.9, keçilerde %21.2 oranında pozitif olarak bulunmuĢtur (Bisias ve ark, 2010).
2.4.4. Hastalığın Türkiye’deki Durumu
Türkiye‟de ilk olarak Ataman ve Hakioğlu (1955), EskiĢehir‟in Beylikahır ilçesi ve civar köylerindeki koyunlarda hastalığı teĢhis etmiĢlerdir. Yılmaz (1962) Bandırma Merinos Çiftliği ile Tahirova Türk-Alman Çiftliği‟ndeki yavru atan koyunlarda enzootik abortusu serolojik olarak saptamıĢtır.
Etkenin seroprevalansı bölgelere göre farklılık gösterir. Gökçe ve ark (2007) Kars‟ta yaptıkları bir çalıĢmada, abort görülen koyunlarda seropozitiflik oranını %13.9, sığırlarda ise
%8.33 olarak bulmuĢlardır.Yine Kars‟ta Otlu ve ark (2007) abort yapan koyun serumlarında
%5.4 seropozitiflik belirlemiĢlerdir. Çaya ve ark (2006) C. abortus seropozitiflik oranlarını KahramanmaraĢ‟ta %30, Hatay‟da %27, Mersin‟de %23.5, Kilis‟te %20, Gaziantep‟te % 16.8, ġanlıurfa‟da %16.7, Osmaniye‟de %9.5, Adıyaman‟da %5, Adana‟da %2.5 olarak tespit etmiĢlerdir. Küçükayan ve ark (2007) 2003 – 2007 yılları arasında Etlik Merkez Veteriner Kontrol Enstitüsüne gönderilen atık fetüs ve kan serumlarından yaptıkları çalıĢmada koyun kan serumlarından 2635‟inden 395‟inde (%15) Bruselloz‟a 1746‟sının 130‟unda (%7,4) Kampilobakterioz‟a, 1296‟sının 3‟ünde (%0.23) Salmonelloz‟a, ve 2376‟sının 43‟ünde (% 1.8) ise Klamidyoz‟a karĢı antikor saptamıĢlardır. Duman ve Durak (1998) Konya bölgesinde görülen atıklardan CFT ile %20 seropozitiflik ve %12.5 Ģüpheli sonuç tespit
12 etmiĢlerdir. Türütoğlu ve ErganiĢ (1996) 80 koyun abort örneğinin 13‟ünden (%16.3) etkeni izole etmiĢlerdir. Güler ve ark (2006) 94 adet koyuna ait vaginal sıvap örneğinin 7‟sinde (%
7.5) Klamidyal DNA tespit etmiĢlerdir. Kalender ve ark (2013) Kuzey Anadolu‟da görülen abortlardan temin edilen 64 koyun abort materyalinde, kültür ve polimeraz zincir reaksiyonu yöntemleri ile %9.8 oranında etken DNA‟ sını belirlemiĢlerdir. Kılıç ve ark, (2010) Elazığ yöresinde sığırlara ait 47 abort materyalinden hem kültürel olarak hem de PCR ile 3 pozitiflik bulmuĢlardır. Öztürk ve ark (2016) ELISA yöntemini kullanarak Burdur‟ da koyunlarda hastalığın seroprevalansının %32 olduğunu bildirmiĢlerdir. Düzce‟de 72 koyun kan serumu örneğiyle yapılan serolojik çalıĢmada C. abortus seroprevalansı %20.8 olarak bulunurken, seropozitif sürülerin oranı % 42.8 olarak belirlenmiĢtir (Karagül ve ark, 2019).
2.4.5. Enfeksyion ve BulaĢma
Yavrulama esnasında kontamine olan çevre, kuzu ve oğlaklar için enfeksiyonun en büyük sebebini oluĢturmaktadır. Abort esnasında saçılan C. abortus‟un elementer cisimcikleri enfeksiyonun ana kaynağıdır. Üst solunum yolları, göz ve ağız mukozası ana giriĢ yolları olarak görülmektedir. Gebe ve gebe olmayan koyunlarla yapılan çalıĢmalarda, enfeksiyondan sonra bakterinin kan yolu ile tüm vücuda dağıldığı gösterilmiĢtir. Etkenin plasenta ve uterusta tespit edilebildiği geç gebelik dönemine kadar, dıĢkı saçılımı haricinde enfeksiyon görünmez kalır (Dawson, 1988).
Enfekte anneler, yavrulama sırasında plasenta ve fötal sıvılar ile birlikte yüksek miktarda elementer cisimcik yayarlar. Enfeksiyondan aborta kadar geçen süre koyunlarda 6 haftaya ve keçilerde 2 haftaya kadar düĢebilir (Dawson, 1988). Koyunlarda etkenin saçılımı aborttan bir gün önce vaginal akıntılarla baĢlar ve 2-3 hafta devam eder. Ovulasyondan 2-3 gün öncesi ve sonrasında da etken saçılımı olmaktadır (WEB_1, 2017). Keçiler koyunlardan farklı olarak aborttan 2 hafta öncesinden 2 hafta sonrasına kadar elementer cisimcikleri yayabilirler (Dawson, 1988; Rodolakis, 2001). Bazı hayvanlarda vaginal akıntılarla etkenin saçılımı 2-3 yıl sürebilir (WEB_1, 2017). Ġnkubasyon süresinin daha kısa olması ve vaginal sekresyonların erken baĢlaması, salgının baĢlangıcında fazla sayıda hayvanın etkilenmesine sebep olabilmektedir (Dawson, 1988). Keçilerin fizyolojik durumuna göre enfeksiyona duyarlılıkları değiĢmektedir. Gebeliği 100. günden az olanlar, gebeliğin geç döneminde olanlara ve gebe olmayanlara göre enfeksiyona daha duyarlıdır. Abort sonrasında süt, idrar ve dıĢkıyla düĢük miktarlarda etken uzun süre saçılabilir (Rodolakis, 2001).
13 Enfeksiyon, anneden yavruya iki Ģekilde geçer; birincisi enfeksiyonun doğum esnasında doğum kanalından bulaĢması ile olur. Bu durumda enfekte yavru ikinci gebeliğinde yavru atar (Pelzer, 2012). Diğer yol enfeksiyonun uterusta kongenital yolla yavruya geçmesidir. Bu durumda enfekte yavru ilk gebeliğinde abort yapar (Aiello ve Mays, 2005).
Abort görülmediği durumlarda ise yavru, persiste enfekte olarak etkeni sürü içerisinde veya sürüler arasında saçmaya devam eder (Rodolakis, 2001; Kadra ve Balla, 2006).
Teankum ve ark, (2007) koç ve boğaların genital organları ve semenlerinde C.
abortus‟ un varlığını araĢtırmıĢlardır. AraĢtırma sonucunda tüm genital organları etken yönünden negatif bulurken, 304 boğa semeninin 20 tanesinde etkeni PCR ile teĢhis etmiĢlerdir. Ġncelenen tüm koç semenleri ise etken yönünden negatif bulunmuĢtur.
Etken, sığırların testis ve epididimisinden izole edilmiĢtir. Ayrıca etkenin suni tohumlama için hazırlanmıĢ ve dondurulmuĢ semende canlı kalabildiği gösterilmiĢtir. (Storz ve ark, 1966). Etken koçlar için de epididimitis etkenidir (Lozano, 1986).
Enfeksiyon kaynakları ve bulaĢma yolları aĢağıda özetlenmiĢtir (ġekil 2).
ġekil 2. Enfeksiyon ve bulaĢma yolları (Manasrah, 2013).
C. abortus, abort yapmıĢ annenin dıĢkısında, idrarında, uterus akıntısında ve daha az olmakla birlikte sütünde bulunur. Asemptopmatik hayvanlar kronik taĢıyıcı olabilir (WEB_1, 2017).
14
Abort materyali, dıĢkı, uterus sıvıları gibi etkenin bulunduğu sekret ve ekstrektler ile kontamine yem veya suyun sindirim yoluyla alınmasıyla (Aiello ve Mays, 2005)
Kontamine toz, aerosol ve damlacıkların inhalasyonuyla (Carter ve Wise, 2003)
ÇiftleĢme sırasında venereal veya mekanik olarak (Livingstone ve ark, 2009)
Anneden yavruya vertikal yolla (Aitken, 2007) ve
Karga, tilki gibi vahĢi vektörlerin etkeni sürüler arasında taĢımasıyla bulaĢır (Dawson, 1988).
2.5. Patogenez
Ġnkubasyon periyodları farklı olmakla birlikte abort genellikle enfeksiyondan 5 – 6 hafta sonra gerçekleĢir. Koyun ve keçiler C. abortus ile gebelik öncesi ve sonrası enfekte olabilirler. Enfeksiyonun zamanı, abortun hangi gebelik döneminde olacağı ile ilgili önem arz etmektedir. Eğer hayvan gebeliğin 30 – 120. günlerindeyse hayvan abort yapar. Eğer enfeksiyon gebelik öncesi veya gebeliğin 120. gününden sonra oluĢmuĢsa bir sonraki gebeliğinde abort görülür (Aitken, 2007).
C. abortus konakçıda hematogenesis yoluyla yayılır (Givens ve Maraly, 2008). Etken plasentada, özellikle de fötal korionik epitelyumun trofoblast hücrelerinde lokalize olmayı tercih eder. Daha sonra çevredeki interkotiledonar membranlara yayılır ve karakteristik nekrotik plasentite sebep olur (Buxton ve ark, 2002).
Etken elementer cisimciklerin çoğalmasıyla en erken gebeliğin 90 – 95. günlerinde plasental dokulardan PCR ile tespit edilebilir (Buxton ve ark, 1990). Enfeksiyon latent hale de geçebilir. Ancak stres veya baĢka enfeksiyonlar sebebiyle immun sistem zayıfladığında tekrar aktive olur. Antijenik uyarımın yüksek olması interlöykin 1 tarafından oluĢturulan ve LPS tarafından uyarılan kronik inflamasyon ve skarizasyon ile sonuçlanır (Carter ve Wise, 2003).
C. abortus‟un patogenezinde rol alan 3 ana virülens faktörü bulunmaktadır.
Cins spesifik lipopolisakkarit antijen veya komplement fikzasyon antijeni konakçı savunma hücrelerinden saklanmanın yanısıra inflamasyonu da uyarmaktadır.
Proteaz / proteozom benzeri aktivite faktörü (CPAF), konakçının major histokompatabilite kompleks (MHC) üretimi ile ilgili transkripsiyon faktörlerini azaltarak etkenin T hücrelerince tanınmasını engeller ve MHC tarafından oluĢturulan immun sistem hücreleri arasındaki iliĢkiyi bozar.
15 Tip 3 sekresyon aparatı, vakuol membranında bir kanal açarak patojenik ürünlerin konakçı hücre sitozolüne bırakılmasını sağlar. Örnek olarak CPAF bu yöntemle transfer edilir (Aitken, 2007).
2.6. Klinik Belirtiler
C. abortus ruminantlarda poliartrit, konjuktivit, pnömoni ve abortu içeren çeĢitli klinik belirtilere neden olur (WEB_2, 2018).
AĢağıda sayılan faktörler varsa Klamidyal enfeksiyondan Ģüphelenilebilir.
Sürüdeki hayvanlar ağır stres koĢullarında yaĢıyorlarsa (Transport, sıcak vb)
Sürü geçmiĢinde C. abortus veya diğer abort etkenleri kaynaklı abort vakaları varsa
Sürü çeĢitli kaynaklardan yeni toplanmıĢsa.
Damızlık erkekler baĢka sürülerce de kullanılıyorsa
Yem ve su hijyeni iyi değilse
Hayvan etleri veya aborte fetus ile beslenen evcil hayvanlar bulunuyorsa
Suni tohumlamada kontamine materyal kullanılıyorsa
Sürü ortak merada baĢka sürülerle birlikte otluyorsa
Abortlar gebeliğin 3. Tremesterinde Ģekilleniyorsa
Doğan kuzular 24 saat içerisinde ölüyorsa
Çevre çiftliklerde de abortlar görülüyorsa
Sürüye dıĢarıdan yeni diĢi hayvan alınmıĢsa
Sürüye oranla yüksek abort oranları görülüyorsa
Daha önce sürüye C. abortus‟un canlı aĢısı yapılmıĢsa.
Hastalık gebeliğin son aylarında görülen abort ile karakterizedir. Prematüre doğumlar, yaĢama gücünden yoksun yavru doğumları ve düĢük canlı ağırlıkta yavru doğumları da görülebilir. Abort önceden hiçbir belirti vermeksizin görülebilir. Abort oranı %25-90 arasında değiĢebilir. Abort yapan diĢilerde daha sonra metrit veya solunum sistemi enfeksiyonu görülebilir (Aitken, 2007). Aborttan sonra hızlıca iyileĢme gözlenebilir. Bazı keçilerde kahverengi vaginal akıntı görülebilir. Dispne belirtileri görülmeksizin devam eden süreğen öksürük, artritis ve keratokonjuktivitis geliĢen diğer komplikasyonlardır (Rodolakis, 2001).
C. abortus enfeksiyonlarında en yüksek abort insidensi enfeksiyon sürüye girdikten sonraki 2. yavrulama sezonunda ortaya çıkar (Kadra ve Balla, 2006). Enfeksiyonun yeni
16 girdiği bir sürüde ilkine gebelerin %90‟ı hastalıktan etkilenebilir. Süt üretiminde azalma görülür. Yüksek abort oranı hastalık siklik döngüye girene kadar 3 yıl süreyle devam eder.
Daha sonraları her sene yeni eklenen diĢilerle abort oranı %10‟ lar seviyesinde sabit kalır.
Hayvanlar genellikle hızlıca iyileĢir ve genellikle daha sonraki gebelikler sorunsuzdur. Ġki kez aborta nadir olarak rastlanmaktadır (Rodalakis 2001, Kadra ve Balla, 2006).
Aborte fetüslerin üzerinde kırmızı-kahverengi bir akıntı bulunabilir. Renksiz veya kırmızı renkli difüz ödem, retensiyo sekundinarum, abdominal ve pleyral boĢluklarda kanlı sıvı birikimi, dil ve ağız boĢluğunda peteĢiyel kanamalar görülen diğer değiĢikliklerdir (Rodolakis, 2001).
2.7. AĢılar ve BağıĢıklık
C. abortus enfeksiyonlarında immunite Immunglobulin G (IgG) ve Immunglobulin M (IgM) ile iliĢkilidir. Enfekte hayvanın dolaĢımında bu immunglobulinlerden birinin veya ikisinin birlikte bulunması enfeksiyonun zamanı hakkında bilgi verir. Antijene karĢı verilen ilk yanıt IgM‟ dir. IgM, antijenin tanınması ve dolayısıyla daha uzun ve güçlü immun yanıt oluĢturulmasında rol alır. Eğer IgM seviyesi yüksekse enfeksiyon yeni baĢlamıĢ olarak kabul edilir. Eğer neonatal dönemdeyse intrauterin enfeksiyon varlığını gösterir. IgG yanıtı IgM yanıtından daha sonra geliĢir ve uzun sürelidir. BağıĢıklığın temeli IgG‟dir. Ayrıca hastalığın evresi hakkında bilgi verir ve serolojik testlerde IgG spesifitesi daha yüksek olduğu için tercih edilir (Manasrah, 2013).
Klamidyoza karĢı immunite hastalığı geçirerek ve aĢılama yolu ile oluĢur. Hastalığı geçiren hayvanlarda bağıĢıklık yıllarca sürer. Keçilerde bu süre 3 yıl kadardır. Ancak bu hayvanlar asemptomatik taĢıyıcılardır ve enfeksiyonu yaymaya devam ederler (WEB_1, 2017).
AĢılamada en çok canlı ve inaktif aĢılar kullanılmaktadır. Ġnaktif aĢılar genellikle embriyolu tavuk yumurtasında veya hücre kültürlerinde üretilmiĢ bütün halde elementer cisimcikleri içeren adjuvanlı aĢılardır. Hastalığı kontrol altına almada etkili olmalarına rağmen tam bir koruma sağlamazlar. Rodalakis ve Soirau (1983) inaktif bir aĢının %50 oranında abort miktarını azalttığını ancak vajinal saçılıma etkisi olmadığını ortaya koymuĢlardır. Garcia ve ark (2004) ticari 2 inaktif aĢıyı deneysel 2 aĢıyla karĢılaĢtırmıĢ ve özellikle deneysel M7 aĢısının diğerlerine göre keçileri aborttan korumada ve bakteri saçılımını azaltmada etkili olduğunu belirtmiĢtir. Atenüe aĢılar ise enjeksiyon bölgesinde
17 lokal yangısal reaksiyonlara yol açmasının yanında uygulayıcının enjektörü kendine batırması açısından risklidir (Aitken, 2007). Canlı aĢılarda ısıya duyarlı mutant C. abortus 1B suĢu kullanılmaktadır. Bu suĢ patojenik saha suĢu olan AB7 nin nitrosoguanidin ile indüklenmiĢ ısıya duyarlı mutantıdır. 380 C‟ de ürerken, koyunların vücut ısısı olan 39.50C‟ de üremesi sınırlıdır (Rodolakis ve Souriau, 1983). ÇiftleĢmeden 4 hafta önce uygulanır ve güçlü ve uzun süreli bir immun yanıt oluĢturur ve doğum esnasında bakteri saçılımını azaltır. Hem canlı hem inaktif aĢılar çiftleĢmeden 4 hafta önce uygulanabilir. Ġnaktif aĢılar gebelik döneminde de uygulanabilir, canlı aĢılar da gebelik döneminde uygulanabilse de çiftleĢme sonrası en az 4 hafta beklenmelidir. AĢılama 3 yıl sonra veya gerekli görülürse daha önce tekrarlanır (Aitken, 2007). Canlı C. abortus aĢılarının baĢka abort etkenlerini içeren aĢılarla kombine edilerek kullanımına yönelik çalıĢmalar vardır. Canlı Brucella melitensis, Salmonella Abortusovis ve C. abortus 1B aĢılarının birlikte uygulanması fare modeli üzerinde denenmiĢ ve oluĢan bağıĢıklığın aĢının tek uygulanmasına göre farklı olmadığı belirtilmiĢtir (Plommet ve ark, 1987). Benzer bir çalıĢmada aynı aĢılar bu kez hedef hayvan olan koyunlar üzerinde denendiğinde yine benzer sonuçlar elde edilmiĢtir (Souriau ve ark, 1988). C. abortus 1B canlı aĢısının canlı toxoplasma aĢısı ile aynı zamanda farklı enjeksiyon yerlerinden uygulanabileceği ortaya konulmuĢtur (Chalmers ve 1997).
Günümüzde en yaygın olarak kullanılan aĢılar ısı ile atenüe edilmiĢ C. abortus 1B suĢunu içeren canlı aĢılardır. Ancak son yıllarda yapılan çalıĢmalar canlı aĢılarla ilgili bazı soru iĢaretlerini ortaya çıkarmıĢtır. Sargison ve ark (2015) hastalığın daha önce görülmediği ve düzenli olarak canlı C. abortus 1B aĢısının uygulandığı bir çiftlikte 2012 yılında meydana gelen abort vakalarını incelemiĢlerdir. Bu vakalarda C. abortus kaynaklı abortlarda olduğu gibi plasentada multifokal kalınlaĢmalar, grimsi beyaz akıntılar bulunmaktadır. Mikroskobik boyamalarda aside dirençli hücre içi inkluzyon cisimcikleri görülmüĢtür.
Immunohistokimyasal boyamalarda klamidya spesifik lipopolisakkaritler belirlenmiĢtir. Abort materyalleri moleküler yöntemlerle incelendiğinde C. abortus DNA‟sı tespit edilmiĢ ve restriction fragment length polymorphism (RFLP) analizleriyle bu DNA‟nın C. abortus 1B aĢı suĢuna ait olduğu anlaĢılmıĢtır. Daha sonrasında sürüden toplanan kan serumları CFT ile incelendiğinde sadece hastalık durumlarında oluĢabilecek kadar yüksek titrelerle karĢılaĢılmıĢtır. Tüm bu bulgular aĢı suĢunun hastalığa neden olduğunu düĢündürmektedir.
Virülent saha suĢları ve aĢı güvenlik çalıĢmaları sırasında meydana gelen abortlardan izole edilen suĢların, tüm genomlarının incelenmesi sonucu aĢı suĢu 1B‟nin atenüe olmamıĢ olabileceği, bağıĢıklığın çok yüksek dozlarda elementer cisimciklerin koruyucu bağıĢıklığı uyarmasıyla oluĢmuĢ olabileceği ortaya konulmuĢtur. Ayrıca daha önce aĢı uygulanmamıĢ ve
18 abort yapmıĢ bir hayvandan da aĢı suĢu 1B‟nin tespit edilmesi, aĢı suĢunun hayvandan hayvana bulaĢıp hastalık oluĢturabileceğini göstermektedir (Longbottom ve ark, 2018).
Deneysel koĢullarda subünit aĢılar baĢarılı sonuçlar vermesinin yanında hazırlaması zor ve pahalıdır. Rekombinant protein ve DNA aĢıları ise Ģu ana kadar çok etkili sonuç vermemiĢtir (Aitken, 2007).
2.8. Zoonotik Önemi
C. abortus zoonotik bir bakteridir. Gebe kadınlarda hayati tehlikeye kadar varan ciddi enfeksiyona ve aborta yol açar (Jorgensen, 1997). Enfeksiyon özellikle yavrulama mevsimindeki enfekte hayvanla temas edilmesi ve abort materyaliyle kontamine gıdaların sindirim yoluyla alınmasıyla Ģekillenir. Etkenin inhalasyon yoluyla alınması ciddi pnömoniye yol açabilir (Ward, 2006).
Pastörize edilmemiĢ süt de insanlar için bir risk faktörü olarak değerlendirilir (Dawson 1988). Mezbaha çalıĢanları, hayvan bakıcıları, aĢı üretiminde çalıĢanlar ve laboratuvar çalıĢanlarında hastalık bildirilmiĢtir (Ward, 2006).
Kadınlarda C. abortus Ģüpheli spontane abortların geçmiĢi 1950‟lere kadar dayanmaktadır. Ancak bu konuda ilk dökümantasyon 1967 yılına aittir. 1987-2000 yılları arasında ise C. abortus etkeni tespit edilmiĢ 20 insan abort vakası bulunmaktadır. (Pospischil ve ark, 2002).
Fransa‟da hamile bir kadında gebeliğinin 23. haftasında kuru öksürük, yüksek ateĢ, baĢ ağırısı gibi grip benzeri belirtiler gösteren akut solunum yolu hastalığı ile birlikte düĢük gerçekleĢmiĢtir (Pichon ve ark, 2020). Benzer olarak Ġtalya‟da hayvan abort materyalleriyle temas geçmiĢi olan 32 haftalık hamile bir kadında septisemiyi takiben çoklu organ yetmezliği görülmüĢ ardından abort gerçekleĢmiĢtir (Walder ve ark, 2005). Her iki vakada da hastalık anne için çok ciddi seyretmiĢ ve antibiyotik tedavisi ile iyileĢme sağlanmıĢtır.
Kadınlar gebeliğin her döneminde enfeksiyona duyarlıdır. Abort gebeliğin 14-32.
haftaları arasında oluĢur. Tedavi edilmeyen vakalarda aborta ek olarak septisemi, yorgunluk, ateĢ, pelvik enflamasyon, pnömoni, böbrek yetmezliği, hepatit, ve yaygın damar içi koagülasyon ile birlikte trombositopeni görülür.
Diğer insanlar için hastalık non-spesifik semptomlarla seyreder. Bu semptomlar baĢ ağrısı, baĢ dönmesi, ateĢ, kusma gibi grip benzeri semptomlardır. Ġnsandan insana bulaĢma bilinmemektedir.
19 Gebe kadınlar Ģüpheli hayvanlarla, özellikle de abort yapmıĢ hayvanlarla yakın temasta bulunmamalıdır. Hayvanlara temas gerekliyse koruyucu önlemler alınmalı, hijyene dikkat edilmeli ve dezenfeksiyon tedbirleri alınmalıdır (Kadra ve Balla, 2006; WEB_1, 2017).
Laboratuvar çalıĢanları da risk altındadır. Etkenle çalıĢılırken en az Biyogüvenlik düzeyi II laboratuvara ihtiyaç vardır (WEB_2, 2018).
2.9. TeĢhis
C. abortus‟un teĢhisi etkenin izolasyon ve identifikasyonuna, etkenin kendisinin veya nükleik asidinin tespit edilmesine dayanır. Abort sırası ve sonrasında humoral immun yanıt tespit edilebilir. TeĢhis için koyun ve keçilerde gebeliğin son döneminde abort hikayesi, nekrotik plasentit ve etkenin yoğun olarak bulunduğu plasenta bölümlerinden yapılan boyamalarda etkenin görülmesi çok önemlidir. Yeni doğanın üzerinden annesi tarafından temizlenmeden alınan sıvaplar, abort yapan anneden alınan vaginal sıvaplar teĢhis amaçlı kullanılır. Kotiledonlardaki lezyonlar Toxoplasma gondii ile benzerlik gösterir. Boyamalar ise Coxiella burnetii ile karıĢabileceği için dikkatli olunmalıdır.
Klamidyal antijen ELISA, immunhistokimya ve floresan antikor testi ile tespit edilir.
Etkenin DNA‟sı PCR veya mikroarray ile saptanır. Bunlardan bazıları ticari kit olarak bulunmaktadır.
Etkenin izolasyonu için canlı hücreye ihtiyaç vardır. Bu amaçla embriyolu tavuk yumurtası ve çeĢitli hücre kültürleri kullanılır (WEB_2, 2018).
TeĢhiste kültür altın standart olsa da, klinik örneğin taĢınmasında özel besiyerlerine ihtiyaç duyulması, kontaminasyon nedeniyle izolasyon yapılamaması ve izolasyon Ģansının az olması gibi dezavantajları vardır. Moleküler yöntemler ise diğer yöntemlere göre çok daha duyarlıdır (Ward, 2006).
2.9.1. Serolojik Testler
Erken doğum veya abort sonrası antikor yükseliĢi CFT ile tespit edilebilse de bu durum her koĢulda geçerli değildir. CFT‟nin duyarlılık ve özgüllüğü düĢüktür. C. pecorum‟da da bulunan lipopolisakkarit antijeni kullanılır. C. pecorum çoğu ruminantın bağırsaklarında
20 bulunur. Bu iki tür arasındaki ve bazı diğer Gram negatif bakterilerle oluĢan çapraz reaksiyonlar sonuçların yanıltıcı çıkmasına sebep olabilir. CFT için abort sonrası antikor yanıtın en yüksek seviyelere çıktığı üçüncü ve altınca haftalar arasında testin yapılması önerilir (Rodolakis, 2001). CFT ayrıca aĢılı ve doğal enfekte hayvanların ayrımını yapamaz.
Eğer bireysel hayvanlarda veya abort geçmiĢi olmayan sürülerde düĢük titrelerle karĢılaĢılırsa sonuçlar dikkatle değerlendirilmelidir. 1/32‟ den düĢük titreler C.abortus için non-spesifik kabul edilmelidir. Bu titrelere düĢük oranda enfeksiyon da sebep olur. ġüpheli sonuçlarda Wester-Blot ile doğrulama yapılmalıdır (WEB_2, 2018).
C. abortus ve C. pecorum arasındaki antikor yanıtı indirekt mikroimmunofloresans yöntemiyle ayırt edilebilse de bu yöntem rutin teĢhiste kullanılamayacak kadar zaman alıcıdır.
ELISA CFT‟ye göre daha duyarlı ve seçicidir. Monoklonal antikor teknolojisiyle üretilen kompetatif ELISA ve rekombinant antijen teknolojisi içeren indirekt ELISA yöntemleri CFT‟ye göre daha duyarlı ve seçici bulunmuĢtur (Salti-Montesanto ve ark, 1997;
Longbottom ve ark, 2002). Hiçbir serolojik yöntem aĢılı ve doğal enfekte hayvanları ayırt edememektedir. (Gerber ve ark, 2007).
2.9.2. Boyama Yöntemleri
C. abortus, doku veya sıvaplardan yapılan boyalamalarla ve etkilenen dokuların incelenmesiyle teĢhis edilebilir (Rodolakis, 2001). Eğer plasental materyal bulunamıyorsa abort sonrası annesi tarafından temzilenmemiĢ fetusun yüzeyinden ve abomasum içeriğinden ve vajenden alınan sıvaplar faydalıdır. Ancak bu sıvaplar plasental sıvaplara göre daha az sayıda etkeni içerir (WEB_2, 2018).
Bir çok farklı boyama yöntemi kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları Machiavello, Giemza, Ziehl-Neelsen, Stamp, Gimenez, Streptavidin- biotin boyama yöntemleridir (Szeredi ve Bacsadi 2002). Boyamalarda elementer cisimcikler kümeler halinde kırmızı renkli görülür.
Coxiella burnetii‟nin boyamalardaki görünümü çok benzerdir. Bu yüzden hastalığın geçmiĢi iyi araĢtırılmalı, plasental lezyonlar da incelenmelidir. Serolojik testlerden ayrımda yararlanılır. Ayrıca Floresan antikor testi (FAT) de bu amaçla kullanılır (WEB_2, 2018).
Dokulardan hazırlanan ince kesitlerin boyanmasıyla intrastoplazmik inkluzyon cisimleri görülür. Ancak daha iyi sonuçlara immunolojik boyamalar ile ulaĢılır.
Ġmmunperoksidaz yöntemi streptovilin- biotin boyamaya göre daha hızlı ve kolaydır (Szeredi
21 ve Bacsadi, 2002). Elektron mikroskobi, negatif kontrastla etkeni Coxiella burnetii‟den ayırmada kullanılır (WEB_2, 2018)
Szeredi ve Bacsadi (2002) immunohistokimyasal, immunositokimyasal ve stamp boyamayı karĢılaĢtırdığı çalıĢmada en doğru sonuçların immunohistokimyasal yöntemle alındığını, en az tespitin ise stamp boyama ile yapıldığını bildirmiĢtir.
Resim 1. Enfekte hücrede inklüzyon cisimciği içerisinde elementer (koyu ve küçük) ve retiküler (soluk ve büyük) cisimcikler (Aitken, 2007).
22 Resim 2. C. abortus enfeksiyonunda histopatolojik görünümler. A: Etkilenen plasental membranda nekroz, epitelinde dökülme, mezenĢimde inflamasyon. (Hematoksilen eosin boyama) B ve C: Plasentada Klamidyal antijenin immunhistokimyasal görünümü. D:
Plasentomda karankular septum (s) ve plasental vilinin (v) birbirine geçmiĢ görünümü.
Villusun büyümesi ve nekrozu, septal dokuda Klamidyal antijen. E: Fötal önbeyinde periventriküler lökomalazi (pl) F: Fötal karaciğerin heamatoksilen-eosin boyaması, fokal nekroz (n) ve periportal inflamasyon (ok) (Longbottom ve ark, 2013).
2.9.3. Antijen Tespiti
Antijen tespiti için kullanılan çeĢitli ticari kitler vardır. Bunların içerisinde ELISA FAT‟a göre daha duyarlıdır. Ancak her iki yöntem de grup bazında tespit yapabilir. Çünkü Klamidyaların ortak antijeni olan LPS‟ yi tespit eder. Histopatolojik olarak Klamidya LPS veya MOMP antijenine karĢı antikorları kullanılarak antijen tespiti yapılır (WEB_2, 2018).
2.9.4. Moleküler Yöntemler
Konvansiyonel ve Real Time PCR, etkenin izolasyonuna gerek kalmadan doğrudan materyalden tespitini yapması açısından çok faydalıdır. Ancak sahada materyal ve çevre arasındaki çapraz bulaĢma hatalı pozitifliklerin alınmasına sebep olabilir. Bir diğer sorun ise inhibitör faktörlerin etkisiyle hatalı negatifliklerin elde edilmesidir (WEB_2, 2018).
Konvansiyonel PCR yöntemleri etkenin 16S-23S rRNA bölgelerini (Everett ve Andersen, 1999) veya POMP genlerini hedef alır (Laroucau ve ark, 2001). Bu yöntemler RFLP analizi ile kombine edilerek C. abortus, C. pcittaci ve C. pecorum ayrımı ve aĢı,
23 enfeksiyon ayrımı yapılabilmektedir (Laroucau ve ark, 2010; Wheelhouse ve ark, 2010;
WEB_2, 2018).
Resim 3. Alu 1 restriksiyon enzimi kullanılarak yapılmıĢ RFLP analizi. M.100 bp Ladder 1.
C. abortus S26/3. 2. Negatif kontrol. 3. C. psittaci 6BC 4-10. Pozitif örnekler (Kalender ve ark, 2013).
Real Time PCR yöntemi DNA‟nın çoğaltılmasını eĢ zamanlı olarak izleme imkanı verir.
Jel elektroforez gibi ikincil bir iĢleme gerek yoktur. Bu sebeple tüm analiz kısa sürede tamamlanır. Real Time PCR konvansiyonel yönteme göre çok daha az manipülasyon gerektirir ve uygulaması daha kolaydır. Reaksiyon cihazın ekranından izlenebildiği için analiz tamamlanmasa bile pozitif sonuçlar çok daha kısa bir sürede elde edilebilmektedir. Real Time PCR tespit yöntemlerinden biri SYBR Green yöntemidir. Bu yöntemde ıĢıma herhangi bir çift iplikçik oluĢumuna bağlı olarak elde edilebilir. Örneğin primerlerin birleĢip dimer oluĢturması da ıĢımaya sebep olur. Bu sebeple SYBR green yönteminin duyarlılığı yüksekken özgüllüğü düĢüktür. Yüksek duyarlılık ve özgüllük için floresan prob bazlı yöntemler kullanılmaktadır.
Klinik mikrobiyolojide en çok 3 prob bazlı yöntem kullanılmaktadır. Bunlar 5´ Nükleaz (Taqman) problar, moleküler iĢaretçiler ve FRET hibridizasyon problarıdır. Bu tespit yöntemlerinin tümü, floresan rezonans enerji transferi olarak adlandırılan bir iĢlem olan iki bitiĢik boya molekülü arasındaki ıĢık enerjisinin transferine dayanır. GeliĢtirilen ilk Real Time floresan probları Taqman problarıdır. Bu problar 5´ ucunda alıcı boya, 3´ ucunda baskılayıcı boya olan kısa oligonükleotitlerdir. Bir ıĢık sinyali oluĢturmak için 2 reaksiyon meydana gelmelidir. Öncelikle prob uygun DNA zincirine bağlanır. Ardından taq polimeraz enzimi primer uzaması sırasında probun 5´ ucunu parçalayarak alıcı boyanın baskılayıcı boyadan kurtularak serbest kalmasını sağlar. Serbest kalan boyanın yaptığı ıĢıma cihaz tarafından okunur (Espy ve ark, 2006).
