T.C
ERCĠYES ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ Veteriner Parazitoloji Anabilim Dalı
KAYSERĠ YÖRESĠNDE CULEX PIPIENS BĠYOTĠPLERĠ VE CULEX TORRENTIUM’UN REAL TIME PCR ĠLE
ARAġTIRILMASI VE MOLEKÜLER KARAKTERĠZASYONU
Hazırlayan
Gözde ġAHĠNGÖZ DEMĠRPOLAT
DanıĢman
Prof. Dr. Abdullah ĠNCĠ
Yüksek Lisans Tezi
Nisan 2016
KAYSERĠ
T.C
ERCĠYES ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
VETERĠNER PARAZĠTOLOJĠ ANABĠLĠM DALI
KAYSERĠ YÖRESĠNDE CULEX PIPIENS BĠYOTĠPLERĠ VE CULEX TORRENTIUM’UN REAL TIME PCR ĠLE
ARAġTIRILMASI VE MOLEKÜLER KARAKTERĠZASYONU
Hazırlayan
Gözde ġAHĠNGÖZ DEMĠRPOLAT
DanıĢman
Prof. Dr. Abdullah ĠNCĠ
Yüksek Lisans Tezi
Bu çalıĢma Erciyes Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Birimi tarafından TYL-2014-5509 nolu proje ile desteklenmiĢtir.
Nisan 2016
KAYSERĠ
TEġEKKÜR
Yüksek lisans çalıĢmalarımın her aĢamasında bilgi birikimiyle bana her zaman yol gösteren, ilgi ve tecrübesini hiçbir zaman esirgemeyen danıĢman hocam Prof. Dr.
Abdullah ĠNCĠ‟ye, her türlü bilgi birikimlerinden yararlandığım hocalarım Prof. Dr.
Alparslan YILDIRIM‟a ve Doç. Dr. Önder DÜZLÜ‟ye ve laboratuvar çalıĢmalarında desteğini aldığım Öğr. Gör. Dr. Zuhal ÖNDER, AraĢ. Gör. Arif ÇĠLOĞLU, Veteriner Hekim Gamze YETĠġMĠġ‟e, maddi ve manevi yönden desteklerini her zaman hissettiğim sevgili aileme ve eĢime yüksek lisans tezim süresince malzeme bazında TYL-2014-5509 kodlu proje ile Erciyes Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Birimi ve referans izolatların temininde desteklerinden dolayı, Litvanya Doğa AraĢtırma Merkezi‟nden Prof. Dr. Gediminas VALKIUNAS, Dr. Rasa BERNOTIENE ve diğer personele teĢekkür ederim.
KAYSERĠ YÖRESĠNDE CULEX PIPIENS BĠYOTĠPLERĠ VE CULEX TORRENTIUM’UN REAL-TIME PCR ĠLE ARAġTIRILMASI VE
MOLEKÜLER KARAKTERĠZASYONU T.C. Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Veteriner Parazitoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, Nisan 2016 DanıĢman: Prof. Dr. Abdullah ĠNCĠ
ÖZET
Bu çalıĢmada, Haziran-Ağustos 2014 tarihleri arasında Kayseri yöresinde çeĢitli bölgelerden toplanmıĢ sivrisinek örneklerinde Culex pipiens kompleks biyotipleri ve Cx. torrentium moleküler olarak araĢtırılmıĢtır. Saha çalıĢmaları boyunca toplam 1052 diĢi sivrisinek örneklemesi yapılmıĢ ve bunların 315‟i (%29,9) morfolojik identifikasyon analizleriyle Cx. pipiens kompleks ve/veya Cx. torrentium olarak teĢhis edilerek ayrılmıĢtır. Ayrılan örneklere ait genomik DNA izolatlarının ilk basamak Real Time PCR analizlerinde tamamının Culex pipiens kompleks nesillerine ait oldukları saptanmıĢ, Cx. torrentium pozitifliği belirlenmemiĢtir. Ġkinci basamak Real Time PCR analizlerinde Cx. pipiens komplekste belirlenen izolatların, 311‟inin Cx. pipiens form pipiens nesillerine ait oldukları belirlenmiĢ, Cx. pipiens form molestus pozitifliği görülmemiĢtir. Kalan 4 örnek analizlerde her iki biyotip yönünden de amplifikasyon göstermemiĢtir. Real Time PCR sonuçlarının konfirmasyonu ve hibrit nesillerin araĢtırılması amacıyla tüm örneklere ait izolatların ACE-2 ve CQ11 microsatellite DNA analizleri gerçekleĢtirilmiĢtir. Analizlerde Cx. pipiens form pipiens olarak belirlenen tüm izolatların ilgili DNA markerları ile pipiens biyotipine özgü bant profilleri sergilediği saptanmıĢ ve izolatların konfirmasyonu sağlanmıĢtır. Real time PCR analizlerinde biyoformlar yönünden amplifikasyon göstermeyen 4 izolatın microsatellite DNA analizleriyle Cx. pipiens form pipiens ve Cx. pipiens form molestus hibritleri oldukları tespit edilmiĢtir. Cx. pipiens form pipiens ve hibrit nesillere ait birer izolatın mitokondrial cytochrome oxidase I (mt-COI) gen bölgesine göre barkodlaması yapılmıĢ ve filogenetik analizleri gerçekleĢtirilmiĢtir. Her iki izolatın sekans analiz sonuçlarına göre yeni bir haplotip oldukları belirlenmiĢ ve haplotip bazında Cx. pipiens komplekse ait nesillerle filogenetik iliĢkileri ortaya konmuĢtur.
Anahtar sözcükler: Culex pipiens biyotipleri, Culex torrentium, Real-Time PCR, Moleküler Karakterizasyon, Kayseri
INVESTIGATION OF CULEX PIPIENS BIOTYPES AND CULEX TORRENTIUM BY REAL-TIME PCR IN KAYSERI REGION AND
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF THE ISOLATES Erciyes University, Graduate School of Health Sciense
Department of Veterinery Parasitology M.Sc. Thesis, April 2016
Supervisor: Prof. Dr. Abdullah ĠNCĠ
ABSTRACT
The biotypes of Culex pipiens complex and Cx. torrentium were molecularly investigated in the mosquito specimens collected from different regions of Kayseri between June and August 2015 in this study. A total of 1052 female mosquito specimens were sampled during the field surveys and 315 (29.9%) out of these were morphologically identified and reserved as Cx. pipiens complex and/or Cx. torrentium.
The first step Real Time PCR analyses of genomic DNA isolates from these reserved specimens revealed that all the specimens were belong to Culex pipiens complex and there was no Cx. torrentium positivity. Among the isolates determined in Culex pipiens complex, 311 were determined as belong to lineages of Cx. pipiens form pipiens according to second step Real Time PCR analyses and there was no positivity for Cx.
pipiens form molestus. The remaining 4 isolates showed no amplification for both two biotypes. ACE-2 and CQ11 microsatellite DNA analyses were carried out on the isolates from all specimens in order to confirm the real time PCR results and investigate the hybrid lineages. All the isolates determined as Cx. pipiens form pipiens showed specific banding pattern for pipiens biotype with the related DNA markers in the analyses result in the confirmation of the isolates. The 4 isolates that did not show amplification for both biotypes in real time PCR assays were designated as the hybrids of Cx. pipiens form pipiens and Cx. pipiens form molestus with the microsatellite DNA analyses. DNA barcoding and phylogenetic analyses were performed on one isolate belong to each Cx. pipiens form pipiens pipiens and hybrids based on mithocondrial cytochrome oxidase I (mt-COI) gene region. Both isolates were determined as new haplotypes according to the sequence analyses and their phylogenetic relations based on haplotypes with the linages belong to Cx. pipiens complex were revealed.
Key words: Culex pipiens biotypes, Culex torrentium, Real-Time PCR, Molecular characterization, Kayseri
ĠÇĠNDEKĠLER
Sayfa
ĠÇ KAPAK ... i
BĠLĠMSEL ETĠĞE UYGUNLUK ... Hata! Yer iĢareti tanımlanmamıĢ. YÖNERGEYE UYGUNLUK ONAYI ... Hata! Yer iĢareti tanımlanmamıĢ. TEġEKKÜR ... iv
ÖZET... vi
ABSTRACT ... vii
ĠÇĠNDEKĠLER ... ix
TABLOLAR LĠSTESĠ ... xi
ġEKĠLLER LĠSTESĠ ... xii
1. GĠRĠġ VE AMAÇ ... 1
2. GENEL BĠLGĠLER ... 3
2.1. SĠVRĠSĠNEKLERDE (CULICIDAE: DIPTERA) SINIFLANDIRMA, CULEX SOYUNUN SINIFLANDIRMADAKĠ YERĠ VE MORFOLOJĠSĠ ... 3
2.2. CX. PIPIENS KOMPLEKSĠNĠN BĠYOLOJĠSĠNDE ÖNEMLĠ FAKTÖRLER .. 8
2.3. CULEX PIPIENS KOMPLEKSĠNĠN DAVRANIġ VE FĠZYOLOJĠSĠ ... 15
2.4. CULEX TÜRLERĠNĠN ĠDENTĠFĠKASYONU ... 17
2.5. CULEX PIPIENS‟ĠN EPĠDEMĠYOLOJĠSĠ ... 18
2.5.1. Türkiye‟de Cx. pipiens Kompleks Üzerine Moleküler ÇalıĢmalar ... 19
2.5.2. Dünyada Cx. pipiens Üzerine Moleküler ÇalıĢmalar ... 20
2.6. CX. PIPIENS‟ĠN VEKTÖRLÜK POTANSĠYELĠ ... 21
3. GEREÇ VE YÖNTEM ... 23
3.1. ARAġTIRMA SAHASI... 23
3.2. SĠVRĠSĠNEK ÖRNEKLERĠNĠN TOPLANMASI ... 23
3.3. MORFOLOJĠK ĠDENTĠFĠKASYON ... 24
3.4. MOLEKÜLER ANALĠZLER ... 25
3.4.1. Genomik DNA Ġzolasyonu ... 25
3.4.2. TaqMan Real Time PCR Ġdentifikasyonları ... 27
3.4.3. ACE-2 ve CQ11 Microsatellite Analizleri ... 29
3.4.4. Mitokondrial Cytochrome Oxidase Subunit I (mt-COI) Geninin Amplifikasyonu ... 30
3.4.5. PCR Ürünlerinin Elektroforezi ... 31
3.4.6. Klonlanma ve Plazmid Pürifikasyonu ... 31
3.4.7. Sekans ve Filogenetik Analizler ... 38
4. BULGULAR ... 40
4.1. MORFOLOJĠK ĠDENTĠFĠKASYON SONUÇLARI ... 40
4.2. MOLEKÜLER ANALĠZ SONUÇLARI ... 42
4.2.1. TaqMan Real Time PCR Sonuçları ... 42
4.2.2. ACE-2 ve CQ11 Microsatellite Analiz Sonuçları ... 45
4.2.3. Mt-COI Gen Bölgesi Amplifikasyon ve Sekans Analizi Sonuçları ... 45
4.2.4. Mt-COI Gen Bölgesi Filogenetik Analiz Sonuçları ... 49
5. TARTIġMA VE SONUÇ ... 53
6. KAYNAKLAR ... 60
ÖZGEÇMĠġ ... 72
TABLOLAR LĠSTESĠ
Sayfa Tablo 2.1. Culex pipiens‟in sistematikteki yeri ... 4 Tablo 2.2. Culex pipiens kompleks ve morfolojik olarak benzer türlerin ayırımında kullanılan gen bölgeleri ... 18 Tablo 3.1. Real Time PCR‟da Cx. pipiens kompleks ve Cx. torrentium identifikasyonunda kullanılan primer ve problar ... 27 Tablo 3.2. Real Time PCR‟da Cx. pipiens kompleks biyoformlarının identifikasyonunda kullanılan primer ve problar ... 28 Tablo 3.3. Microsatellite analizlerinde kullanılan spesifik primerler ... 29 Tablo 4.1. AraĢtırmaya dahil edilen Cx. pipiens örneklerinin örnekleme bölgesine göre dağılımı ... 40 Tablo 4.2. Mt-COI gen bölgesine göre karakterize edilen izolatların tür, DNA izolasyon kaynağı ve GenBank aksesyon numaraları ... 48 Tablo 4.3. Mt-COI gen bölgesine filogenetik analize dahil edilen izolatların pairwise identiklik oranları ... 51
ġEKĠLLER LĠSTESĠ
Sayfa
ġekil 2.1. Cx. pipiens kompleks türlerinin küresel dağılımı. ... 5
ġekil 2.2. Ergin diĢi Cx. pipiens kompleks türlerinin morfolojik yapısı ... 6
ġekil 2.3. Cx. pipiens kompleks türlerine ait larvaların morfolojik yapısı ... 6
ġekil 2.4. Cx. pipiens‟in hayat siklusu ... 9
ġekil 3.1. AraĢtırma sahası ... 23
ġekil 3.2. Karbondioksitli (Kurubuz hazneli) CDC ıĢık tuzağı ... 24
ġekil 3.3. AraĢtırma sahasından toplanan sivrisinek örnekleri ... 24
ġekil 3.4. Sivrisinek örneklerinin sıvı azot yardımıyla ezilmesi ... 25
ġekil 3.5. pJET1.2/blunt klonlama vektörü ... 33
ġekil 3.6. LB katı besi yeri (Orijinal) ... 34
ġekil 3.7. LB katı besi yerinde üreyen koloniler (Orijinal) ... 35
ġekil 3.8. LB katı besi yerinden alınan kolonilerin ampisilinli LB sıvı besi yerlerine ekimi ve 37°C‟de sallayıcı üzerinde inkubasyonu (Orijinal) ... 36
ġekil 3.9. Aval ve Xbal (Thermo Scientific) enzimlerinin bağlanma noktaları ... 38
ġekil 4.1. Erkek (a) ve diĢi (b) sivrisinek ayrımı (Orijinal) ... 41
ġekil 4.2. Culex pipens örneklerinin bazı morfolojik özellikleri (Orijinal) ... 42
ġekil 4.3. TaqMan Real Time PCR analizleri sonucu Cx. pipiens komplekste belirlenen örneklerin amplifikasyon grafikleri ... 43
ġekil 4.4. Cx. torrentium spesifik TaqMan Real Time PCR analizleri sonucu (a: Pozitif kontrol) ... 43
ġekil 4.5. TaqMan Real Time PCR analizleri sonucu Cx. pipiens form pipiens belirlenen bazı örneklerin amplifikasyon grafikleri ... 44
ġekil 4.6. Cx. pipiens form molestus spesifik primer ve probu ile TaqMan Real Time PCR analizleri sonucu ... 44
ġekil 4.7. ACE-2 mikrosatellite analizleriyle bazı izolatlarda belirlenen DNA bant profilleri ... 45
ġekil 4.8. CQ11 mikrosatellite analizleriyle bazı izolatlarda belirlenen DNA bant profilleri ... 45 ġekil 4.9. Bazı Cx. pipiens form pipiens ve hibrit örneklerine ait genomik DNA izolatlarının mt-COI gen bölgesini amplifiye eden primerlerle PCR sonucu elde edilen pozitif amplikonların jel elektroforezde görünümü ... 46 ġekil 4.10. Sekans analizleri için seçilen izolatların mt-COI gen bölgesinin amplifikasyonu sonrası jel pürifiye edilen örneklerin jel elektroforezde görünümü. ... 46 ġekil 4.11. LB katı besi yerinde üreyen 1. ve 2. inkübasyon basamakları sonucu oluĢan koloniler ... 47 ġekil 4.12. Transforme hücrelerde mt-COI gen bölgesinin koloni PCR‟ı sonucu amplikonların jel agarozda görünümü. ... 47 ġekil 4.13. SaflaĢtırılan plazmidlerin restriksiyon enzimleri ile kesimi sonucu insert mt-
COI gen bölgesi fragmentlerinin agaroz jelde görünümü. ... 47 ġekil 4.14. Saptanan mt-COI izolatlarına ait nükleotid ve amino asit sekanslarının ikili hizalamaları ... 49 ġekil 4.15. Cx. pipiens izolatlarının mt-COI gen bölgesi Bayesian inference (BI) analizine göre filogenetik iliĢkileri. ... 52
1. GĠRĠġ VE AMAÇ
Kanla beslenen artropodlar, medikal anlamda parazitliklerinin yanında birçok önemli patojenin omurgalı konaklara naklinde vektör olarak görev almaktadırlar. Bunlar arasında sivrisinekler (Diptera: Culicidae) oldukça önemli bir grubu oluĢturmakta olup çok sayıda virüs, bakteri, protozoon ve nematod türlerine biyolojik ve/veya mekanik vektörlük yapmaktadırlar. Bu vektör-borne patojenlerin oluĢturdukları hastalıkların arasında sıtma, dengue ve sarıhumma, çeĢitli viral ensefalitler ve filariosis gibi çok sayıda hastalık oldukça önem arz etmekte ve farklı coğrafyalarda problemlere yol açmaktadır (1).Dünyanın farklı ülkelerinde görülenmalarya, veba, sarı humma, lenfatik filariosis gibi vektör kaynaklı hastalıklar insanların genetik yapısını (2, 3), bir bölgedeki nüfusun artıĢ ve azalıĢını (4), ve savaĢların sonuçlarını önemli derecelerde etkileyebilmektedir (5).
Sivrisinekler, Nematocera alt takımında Culicidae ailesinde yer almakta ve kan emme özelliği göstermektedirler. Bu ailedeki Culex soyunda bulunan ve “Kuzey Ev Sineği”
olarak adlandırılan Culex pipiens, kozmopolit yayılıĢa sahip olan ve baĢta Batı Nil Virüsü (WNV) olmak üzere çeĢitli patojenlerin insan ve hayvanlara naklinde sorumlu olan sivrisinek türlerinin baĢında gelmektedir (6). Cx. pipiens’e göre daha az tanınan Cx. torrentium özellikle ılıman bölgelerde yaygınlık göstermekte olup Avrupa ülkelerinde de sık olarak bildirilmiĢ ve Sindbis virusunun (SINV) ana enzootik vektörü olarak tanımlanmıĢtır. Cx. torrentium Cx. pipiens ile benzer bionomik ve morfolojik karakter göstermekte olup yalnızca erkek hypopygiasında morfolojik farklılık bulunmaktadır (7).
Zoonotik patojenler için uygun konak ve komponent vektörlerin bulunması enzootik transmisyon için önemlidir. Bu açıdan çeĢitli coğrafik alanlarda baĢta WNV olmak üzere vektör-borne patojenlerin oluĢturdukları risk faktörlerinin belirlenmesi ve pest kontrol stratejilerinin oluĢturulmasında vektör sivrisineklerin moleküler ekolojisi ve epidemiyolojisinin ortaya konması oldukça önemlidir. Bu noktada özellikle ilgili
bölgede yaygınlık gösteren sivrisinek türlerinin baĢarılı identifikasyonu risk potansiyellerinin ortaya çıkarılması açısından primer öneme sahiptir. Cx. pipiens, Pipiens kompleks içerisinde yer almakta olup morfolojik olarak identik ve coğrafik dağılımları da örtüĢen ancak davranıĢsal olarak farklılıklar gösteren Cx. pipiens biyotip pipiens ve Cx. pipiens biyotip molestus olmak üzere iki farklı biyotipi bulunmaktadır.
Culex torrentium’unda Cx. pipiens ile benzer bionomik ve morfolojik karakterler göstermesiyle bunların ayrımı ve vektör potansiyellerinin ortaya konmasında moleküler analizler zorunlu hale gelmiĢtir. Türkiye‟de günümüze kadar yapılan çalıĢmalarda farklı illerde Cx. pipiens yaygınlığı morfolojik kriterlere göre verilmiĢ olup biyotip veya Cx.
torrentium ayrımına dair moleküler bazda herhangi bir çalıĢma yapılmamıĢtır. Bu çalıĢma ile Türkiye‟de ilk kez Pipiens kompleks içerisinde yer alan Cx. pipiens biyotipleri ile Cx. torrentium moleküler olarak araĢtırılmıĢ ve elde edilen izolatların çeĢitli gen bölgelerinin sekans analizleri ile moleküler karakterizasyonları ve filogenetik analizleri gerçekleĢtirilmiĢtir. Proje ile elde edilen sonuçlar Türkiye‟den izole edilen bu türlerin moleküler filogenisini ortaya koymasının yanı sıra çeĢitli patojenler için vektör potansiyelleri açısından risk faktörlerine de önemli katkılar sağlamıĢtır.
2. GENEL BĠLGĠLER
2.1. SĠVRĠSĠNEKLERDE (CULICIDAE: DIPTERA) SINIFLANDIRMA, CULEX SOYUNUN SINIFLANDIRMADAKĠ YERĠ VE MORFOLOJĠSĠ
Sivrisinekler, Arthropoda Ģubesi, Insecta sınıfı, Diptera takımı, Nematocera alttakımı ve Culicidae ailesi içerisinde yer almakta olup sadece bu ailedekilerde kan emme özelliği görülmektedir. Diptera takımına bağlı Nematocera alt takımında, Chaoboridae, Dixidae ve Culicidae aileleri bulunmaktadır (1).
EriĢkin Culicid‟ler, öne doğru yönelmiĢ uzun bir hortuma sahip olup hortum boyu, baĢ ve gövdenin toplam uzunluğuna eĢittir. Kanat damarları üzeri pullarla kaplıdır. Pullar, kanat saçağını oluĢtururlar. Subkostal damar, dallara ayrılmadan kosta ve radius damarlarına paralel seyreder. Culicid larvaları akuatiktir. Çok az bir kısmı predatördür (1).
Knight ve Stone (8) ve Knight (9), Culicidae ailesine ait 3000'in üzerinde türün varlığını bildirmiĢlerdir. Ward (10, 11) ve Gaffigan ve Ward (12) bu listeye 203 yeni tür daha eklemiĢtir. Yapılan çalıĢmalar sonucunda Culicidae ailesine ait toplam 3268 türün varlığı bildirilmiĢtir (11).
Culicidae‟nin aile düzeyindeki monofilisi, bu aileye bağlı Anophelinae, Culicinae ve Toxorhynchitinae alt aileleri ile tanımlanmıĢtır. Bu sınıflandırma, Belkin (13) ve Knight ve Stone (8) tarafından da kabul edilmiĢtir. Alt aileler içerisindeki yüksek filogeniyi netleĢtirmek için tribus (kabile)‟leri oluĢturmak ilk defa Belkin (13) tarafından denenmiĢtir. Belkin (13), Anophelinae alt ailesinin, üst aile köküne daha yakın olduğu düĢüncesi üzerinde tartıĢmıĢ, Harbach ve Kitching (14) tarafından yapılan çalıĢma ile Anophelinae'nin taksonomik yerinin alt aile olduğu kesinlik kazanmıĢtır. Yine bu çalıĢmanın sonucu olarak Anophelinae ve Culicinae geçerli monofiletik alt aileler olarak
kabul edilirken, Toxorhynchitinae, Culicinae alt ailesi altında ayrı bir kabile seviyesine indirilmiĢtir.
Culex pipiens (Linnaeus 1758) 3. Tribus Culicini‟de yer almakta olup Systema Naturae 2000 ve National Center for Biotechnology Information (NCBI) Taxonomy veritabanına göre sistematikteki yeri aĢağıda verilmiĢtir (Tablo 2.1)
Tablo 2.1. Culex pipiens‟in sistematikteki yeri
Sınıflandırma Filum: Arthropoda
Üst Sınıf: Hexapoda Sınıf: Insecta Takım: Diptera
Alt Takım: Nematocera Aile: Culicidae
Alt Aile: Anophelinae, Culicinae, Toxorhynchitinae Cins: Culex
Tür: Culex pipiens
Medikal ve veteriner önemine karĢın Cx. pipiens‟in taksonomik durumu henüz tam olarak netliğe kavuĢmamıĢtır. Genel olarak Cx. pipiens kompleks olarak nitelenen bu türde Cx. pipiens quinquefasciatus, Cx. pipiens pallens, Cx. pipiens pipiens, Cx. pipiens resturans ve Cx. pipiens molestus olmak üzere çeĢitli alt türlerin bulunduğu kabul edilmektedir (ġekil 2.1) (15, 16). Buna karĢın diğer bazı araĢtırıcılar, farklı popülasyonlar üzerine yaptıkları araĢtırmalarda Cx. quinquefasciatus‟un alt tür olmayıp farklı bir tür olduğunu öne sürmüĢlerdir. Ayrıca Avustralya‟ya ait iki alt tür olan C.
pipiens australicus ve C. pipiens golobocoxitus da bu gruba dâhil edilmektedir (17-20).
ġekil 2.1. Cx. pipiens kompleks türlerinin küresel dağılımı. Cx. pipiens’in iki formu (pipiens ve molestus) Asya ve Avustralya‟nın ılıman bölgelerinde bulunmasına karĢın Cx. pipiens form molestus
yerleĢim bölgelerinde daha sık bulunmaktadır. Cx. australicus ve Cx. globocoxitus‟ın ise sadece Avustralya‟da sınırlanmaktadır (16, 21, 22).
Tür kompleks‟inde evrimsel açıdan yakın iliĢkili türler bir grup olarak tanımlanmakta ve genellikle morfolojik olarak ayırımları zor olmaktadır (23). Bu taksonomi Cx.
pipiens kompleksi üyelerinin birçoğu arasında farklılıkları belirlemedeki eksikliği ve özellikle hibritlerin mevcudiyetinden dolayı hala tartıĢmalıdır (16, 21, 24-26).
Morfolojik karakterlerin diğer fizyolojik ve davranıĢsal karakterlerle kıyaslandığında taksonomik çalıĢmalarda daha önemli olduğu belirtilmiĢtir (15). Morfolojik karakterlerden III–IV. segmentlerin larval abdominal seta 1‟i, siphon/saddle indeksi, siphon Ģekli, seta 1a–S ve 1b–S‟in dallanma sayısı, DV/D oranı, R2/R2+3 uzunluk oranı, R2+3‟deki bifurkason ile subcosta ve costadaki kesiĢmenin Cx. pipiens kompleks türlerinin erginlerinin ayrımında önemli olduğu kaydedilmektedir. Ancak mevcut bu kriterler tam olarak bu türlerin ayrımında yeterli olmamaktadır. Erkek genital sisteminin morfolojik ayrımda en önemli kriter olduğu belirtilmektedir (16, 22, 24, 27, 28). Cx.
pipiens kompleks‟in erkek üyeleri üreme organlarının Ģekli ile ayırt edilebilirken (29, 30), diĢileri identifiye etmede bu karakter kullanılamamaktadır.
Cx. pipiens kompleks türlerinin ergin ve larvalarına ait morfolojik özellikler ġekil 2.2 ve 2.3‟de gösterilmiĢtir.
ġekil 2.2. Ergin diĢi Cx. pipiens kompleks türlerinin morfolojik yapısı (Kaynak:https://en.wikipedia.org/wiki/Culex)
ġekil 2.3. Cx. pipiens kompleks türlerine ait larvaların morfolojik yapısı (Kaynak:https://en.wikipedia.org/wiki/Culex)
Morfolojik olarak Cx. pipiens’e çok benzer ve kriptik bir tür olan Culex torrentium (Martini 1925), baĢlıca Batı Palearktrik bölge ve Asya‟da identifiye edilmiĢtir (31, 32).
Culex torrentium Sindbis (SINV) virüsünün vektörü olup deneysel olarak yapılan
çalıĢmalarda Ġskandinavya'da kuĢların ve insanların SINV virüsüne çok duyarlı olduğu bildirilmiĢtir (33). Laboratuar Ģartlarında Cx. torrentium’un vektörlük yeteneğinin Cx.
pipiens’den çok daha fazla olduğu görülmüĢtür. SINV virüsü Kuzey Avrupa‟da her 7 yılda bir insanlarda salgına sebep olmaktadır (34). Bu nedenle bu iki zoonotik sivrisinek türü (Cx. torrentium ve Cx. pipiens) kuĢ populasyonlarında enzoonotik vektör olarak tanımlanmıĢtır. Ġnsanların yanı sıra kuĢlar ve memelilerden kan emmeyi tercih ettiklerinden dolayı Cx. pipiens kompleksinin hibritleri ve üyelerinin hayvanlar ve insanlar arasında köprü kurduğu ve böylece insan populasyonlarında virus enfeksiyonunu taĢıdıkları bildirilmiĢtir (6, 35). Ġnsanlarda enfeksiyonlara sebep olan potansiyel vektörler, antropofilik sivrisinek türleri olduklarından dolayı günümüzde yapılan çalıĢmalar daha çok onlar üzerinde olmaktadır (36, 37).
ÇeĢitli sistematik kontrol programlarına adaptasyona, farklı epitozoolojik ve epidemiyolojik risklere sahip olmalarından dolayı Cx. pipiens ve Cx. torrentium arasındaki tür farklılığı oldukça önemlidir. Fakat bu iki tür Ģimdiye kadar yapılan birçok çalıĢmada ayırt edilememiĢtir (38-40).
Culex torrentium, 1925‟e kadar tanımlanamamıĢtır ve sistematikte henüz tam olarak yeri belirlenememiĢtir (24). Larval seta uzunluğu ve sayısı dikkate alındığında uyuĢmazlıklar vardır ve yumurta morfolojiside teĢhis için yeterli olmamaktadır (41).
Bunların aksine Becker ve ark. (42) larval abdominal setaların sayısında farklılıklar teĢhis etmiĢ fakat bu sayıların Culex pipiens‟de de değiĢken olabileceğini bildirmiĢlerdir. DiĢilerin ayırt edilmesi olanaksız olup son yıllarda Borstler ve ark.
(43)‟nın yaptıkları bir çalıĢmada kanat damar morfometresi ile güvenilir bir ayırım yapmıĢlardır. Sonuç olarak son yıllarda kullanılan genetik markırlar ile Culex torrentium, Avrupada çok hızlı bir Ģekilde identifiye edilmiĢ buna rağmen genetik olarak ve üreme özellikleri ile Culex pipens‟den ayrılsada üreme alanları ve ekolojik karakterlerlerinin benzer olduğu gösterilmiĢtir (44). Adenylate kinase (AK) ve hydroxybutyrate dehydrogenase (HBDH) gen bölgeleri Culex torrentium’u Culex pipiens’den ayırmak için genetik markır olarak kullanılmıĢtır.
Türler arasındaki yakın evrimsel iliĢki genetik analizlerle tanımlanmıĢtır (45, 46).
Bunun sonucunda Cx. pipiens’in genetik olarak tanımlanmıĢ 2 alt türe sahip olduğu (Cx.
pipiens pipiens ve Cx. pipiens molestus) belirlenmiĢtir. Cx. pipiens’in iki formu pipiens ve molestus farklı ekolojilerde bulunmaktadır. Cx. pipies form pipiens, Kuzey ve
Güney Amerikadaki ılıman bölgelerde bulunurken (35) Cx. pipiens form molestus Japonya, Güney Kore Cumhuriyetinde ve Avusturalya‟da bulunmaktadır (16).
Culex quinquefasciatus Afrika ovaları, Amerika, Asya ve Avusturalya‟yıda kapsayan tropikal ve subtropikal bölgelerde yayılıĢ göstermektedir (47). Cx. pipiens ve Cx.
quinquefasciatus çoğunlukla birlikte yaĢarlar ve insanlar ile yakın iliĢki içerisinde bulunmaktadırlar. Cx. pipiens (Cx. pipiens form molestus ve Culex p. form pipiens) ve Cx. quinquefasciatus üreme organları analizi, allozyme poliformizmi ve son yıllarda mikrosatelit analizleri (nuclear DNA) ile hibridize olabildikleri bildirilmiĢtir. Kuzey Amerika, Arjantin, Madakaskar, Japonya ve Güney Kore Cumhuriyetinde Cx. pipiens ve Cx.quinquefasciatus‟un populasyonları arasında yoğun bir hibritleĢme bulunmaktadır (29, 48-53).
2.2. CX. PIPIENS KOMPLEKSĠNĠN BĠYOLOJĠSĠNDE ÖNEMLĠ FAKTÖRLER Diptera takımının genel özelliği olarak sivrisinekler tam metamorfoz (holometabolar) geçirirler. Tüm sivrisinekler geliĢimleri için akuatik habitatlara gereksinim duyarlar.
Yumurtadan çıkıĢtan sonra dört larval dönem (L1-L4) ve pupa dönemini geçirerek eriĢkin döneme geçerler (ġekil 2.4) (6).
ġekil 2.4. Cx. pipiens‟in hayat siklusu (Kaynak: http://www.nsmad.com/about-mosquitoes/mosquito- biology/
Habitat tipleri: Sivrisinekler, pratikte her çeĢit durgun suda üreme potansiyeline sahiptirler. Az miktardaki sularda dahi çok fazla sayıda üreyebilirler. AtılmıĢ teneke kutuları, atılmıĢ araba tekerlekleri, ağaç kovukları, yaprakların üzeri ve hayvanların ayak izlerinde biriken sularda, su depolarında, tuzlu bataklıklar gibi çeĢitli özellikteki sularda üreyebilirler (54). Su hayatına uyum sağlamıĢ olan sivrisinek larvalarına hemen hemen her türlü su birikintisinde rastlamak mümkündür. Ancak, her sivrisinek türü her çeĢit su birikintisinde bulunamamakta ve türlere göre çeĢitli habitatlar bulunmaktadır (55). Yapılan çalıĢmalarla Cx. pipiens'in birinci derecede, olmak üzere belli bir habitat seçmedikleri, hemen her çeĢit sularda bulunduğu ortaya konmuĢ olmakla birlikte genellikle kirli, sulu habitatlarda daha yoğun bulundukları kaydedilmiĢtir (55).
Çiftleşme ve yumurta bırakma (ovipozisyon): DiĢilerin döllenmesi, pupadan eriĢkin döneme geçiĢten kısa bir süre sonra olur. Erkekler ilk önce pupadan eriĢkin döneme geçerler. Üreme yerleri etrafında kümeler halinde uçarak diĢi sivrisineklerin çıkıĢını bekler halde görülebilirler. DiĢi sivrisinek bu kümenin içine girer ve çiftleĢme meydana
gelir. ÇiftleĢmek için geniĢ alanlara ihtiyaç duyan türlere “eurygamous”, dar ve sınırlı alanlarda çiftleĢebilen türlere ise "stenogamous" denir (54).
Sivrisinek türlerinin çoğunda, döllenmiĢ diĢiler yumurtlamak için yılda bir ya da birkaç kez kan emme gereksinimi duyar. DiĢi sivrisineklerin döllendikten sonra kan emerek yumurtlamalarına değin geçen süreye trofogoni dönemi denir. Her bir dönemin üç evresi vardır:
a) Kan emmeye yöneliĢ ve kan emme,
b) Kanın sindirimi ve yumurtalıklarda yumurtaların geliĢimi, c) Üreme yerlerine doğru uçmak ve burada yumurtlamak.
Yazın yeterli sıcaklıklarda bir kez kan emme yumurtaların geliĢimi için yeterli olmaktadır. Kanın sindirimi süresince yumurtalıklardaki tüm yumurtalar olgunlaĢır (trofogoni uyumu). Sonbaharda havaların soğuması ile kan emmiĢ sivrisinekteki yumurtalar olgunlaĢamaz. Ġlkbaharda havaların ısınması ile sivrisinek tekrar kan emmeye baĢlar ve yumurta olgunlaĢması kaldığı yerden devam eder (trofogoni uyumu bozulur) (56).
Çoğu sivrisinek türünde diĢiler, kopulasyon sonrası yumurtaların geliĢimini tamamlayabilmesi için kan emmek zorundadırlar (otojen olmayan geliĢim). Az sayıdaki türün diĢilerine (ör. Cx. pipiens biotype molestus) ait ilk parti yumurtalar kan emmeden de geliĢebilirler (otojen geliĢim). DiĢi sivrisinekler, kan emmeyi takiben 2-4 gün içerisinde 50-500 adet yumurta bırakırlar (6).
Sivrisinekler, bıraktıkları yumurta içerisindeki embriyonun dıĢ etkilerle tetiklenen dinlenme periyoduna (uyku hali) girip girmemelerine göre ikiye ayrılmıĢtır. Ġlk gruptakiler uyku halinde olmayan (nondormant) yumurtalar olup Anopheles, Culex, Culiseta, Mansonia, Uranotaenia, Orthopodomyia ve muhtemelen Wyeomyia cinsine ait türlerdir. Ġkinci gruptakiler ise uyku halinde olan (dormant) yumurtalar olup, Aedes ve Psorophora cinslerine ait türlerdir. Dormant yumurtalar, diğer gruptakilere göre kurumaya daha dirençlidirler (6).
Ġlk gruptaki (nondormant) yumurtalara sahip diĢiler, yumurtalarını tek tek (Anopheles) veya kümeler halinde (Culex, Uranotaenia, Coquillettidia, Orthopodomyia ve alt cins
Culiseta) su yüzeyine bırakırlar. Bu gruptaki (nondormant) diĢiler, suyun üzerinde veya suya çok yakın durarak yumurtaları su yüzeyine bırakırlar. Bu tip yumurtaların embriyoları oda sıcaklığında (23°C) iki gün içerisinde geliĢimini tamamlayarak kısa sürede yumurtadan çıkarlar. Bu tip yumurtalar, kuru ortamda kısa süre içinde canlılığını yitirirler. Ancak çok nemli veya çok az su birikintisi içinde “karaya oturmuĢ” Ģekilde bir gün veya daha az canlılığını koruyabilirler (6).
Uyku haline girmeyen (nondormant) yumurtalara sahip türler, yetiĢme sezonlarına bağlı olarak, senede bir kaç jenerasyon verebilirler. Bu gruptaki türler daha çok aynı sezon içinde birden fazla jenerasyonu kolayca oluĢturabileceği kalıcı ve yarı kalıcı tipteki üreme yerlerinde bulunmaktadır. Genel görüĢ bu Ģekilde olsa da, An. punctipennis ve Cx. pipiens genellikle geçici su kaynaklarında bulunurlar (6).
Ġkinci gruptaki Aedes ve Psorophora cinslerine bağlı türler ise çok farklı bir davranıĢ sergilerler. Bu türlere ait diĢiler yumurtalarını suyun yüzeyinde değil, üreme kaynağının nemli kenarlarına tek tek bırakırlar. Yumurta belirli bir miktar geliĢme gösterir fakat, yumurta geliĢimi tamamlasa dahi yumurtadan larvanın çıkıĢı gerçekleĢmez. Uygun Ģartlar sağlanıncaya kadar yumurtalar uyku halinde bekler. Aedes aegypti‟nin laboratuvar yetiĢtirmelerinde, diĢinin yumurtalarını suyun kenarına konulan kurutma kâğıdının, su seviyesinin üstünde kalan nemli kısımlarına bıraktığı gözlemlenmiĢtir.
Neme temas halinde bir iki gün kalan yumurtalar artık düĢük nemli ortamlara daha dayanaklı hale gelir. Kurutulan (desikasyona tabi tutulmadan) yumurtalar, bu Ģekilde uzun süre saklanabilmektedir. Bir iki ay sonra bu yumurtalardan larva çıkıĢında düĢüĢler baĢlar. Yumurtalardan larva çıkıĢını sağlamak için yumurtaları su ile temas ettirerek bir miktar besin maddesi eklemek yeterlidir (6).
Aedes vexans ve Ochlerotatus caspius türleri su seviyesinin sıkça alçalıp yükseldiği ve su taĢkınlarının görüldüğü yerlerde ürerler. Bu habitat özelliği, Ae. vexans ve Oc.
caspius'un uygun yumurta bırakma davranıĢlarını yerine getirebilmeleri ve yeni nesiller oluĢturabilmeleri açısından önemlidir (6).
Embriyonik geliĢim, yumurtalar suya bırakıldıktan hemen sonra baĢlar. Sıcaklığa bağlı olarak 2-7 gün veya daha uzun sürede embriyonik geliĢim tamamlanır. Suya bırakılan Cx. pipiens pipiens yumurtalarından larva çıkıĢı 30°C‟de bir gün, 20°C‟de üç gün ve 10°C‟de on gün sonra gerçekleĢir. 4°C‟de ise embriyonik geliĢim tamamlanamaz. Aedes
ve Ochlerotatus yumurtalarının embryionik geliĢim süresine etki eden bir kaç çevresel faktör olduğundan dolayı, bu süre Cx. pipiens pipiens‟inkine göre hemen hemen iki kat daha uzun olmaktadır. Suya bırakılan Ae. vexans yumurtalarının, 20°C‟de sekiz gün sonra % 50‟si embriyonik geliĢimini tamamlamaktadır (6).
Larva ve pupa dönemi: Yumurtadan çıkan larvadan eriĢkin evreye değin geçecek olan süre; iklim, mevsim ve suyun sıcaklık durumuna göre değiĢir. Larvalar, 24°C-26°C sıcaklıktaki suda en kısa sürede geliĢirler (56). Optimum hava sıcaklığı ve besin alımında bu süre çoğu Culicinae alt ailesinde ortalama 7 gündür. Anophelinae alt ailesi ise biraz daha uzun süreye ihtiyaç duymaktadır (54).
Larvalar; sudaki mikroorganizmalar, algler, protozoonlar, omurgasız canlılar ve tortulardan beslenir. Beslenme tipleri, filtre edenler, tarayıcılar ve predatörler olmak üzere üç grupta incelenebilir. Filtre edenler, tipik olarak suda baĢ aĢağı asılı dururlar ve su yüzeyinin altından tabana doğru olan kısımda süspansiyon halinde bulunan gıda partiküllerini süzerler (Culex, Coquillettidia, alt cins Culiseta, bazı Aedes ve Ochlerotatus larvaları). Tarayıcılar, su içinde kalan yüzeylerden (çoğu Aedes ve Ochlerotatus larvaları) veya hava ile su arasındaki mikrobiyal film katmanından (Anopheles larvaları) partikülleri, mikroorganizmaları, algleri tekrar süspanse ederek, kazıyarak veya parçalayarak toplarlar. Bitkiler ve ölü omurgasız canlıların küçük parçaları da ağız organelleri ile parçalanabilmektedir. Predatörler genellikle sivrisineklerin haricindeki diğer insektlerin larvaları ile beslenirler (Toxorhynchites, Aedes, Psorophora ve Culex larvaları). Predatör tip larvalara Avrupa'da rastlanmamaktadır (6).
Pupa, akuatiktir. Metamorfozun Ģekillendiği bu geliĢme dönemi, ortalama 2 gün sürer.
Pupa, Diptera takımındaki diğer pupaların aksine, sudaki hareketlenmelere karĢı çok hassas ve dikkat çekecek derecede hareketlidir. Suya dalıĢtan sonra aktif hareketleri ile su yüzeyine çıkan larvaların aksine, pupalar su yüzeyine pasif olarak çıkarlar. Pupalar kuraklığa göreceli olarak daha dayanıklı olup, üreme yerlerindeki su kurumaya yüz tutsa dahi eriĢkinler pupadan çıkabilmektedir. Larvanın aksine, pupa beslenemez (6).
Ergin sivrisineklerin yaşam süreleri: Erkek sivrisinekler genellikle 6-7 gün arasında yaĢarlar. Laboratuvar koĢullarında, yüksek nem ve yeterli karbonhidrat beslenmesi ile yaĢam süreleri bir ayı geçebilir. DiĢiler, özellikle hibernasyon durumunda ve bol gıda
ile 4-5 ay süre ile canlı kalabilirler. Aktivitelerinin en yüksek olduğu dönemlerde ise diĢilerin yaĢam süresi, yaklaĢık iki haftadır (54).
Hibernasyon ve estivasyon: Sivrisinekler, kıĢın soğuk ve yazın kuraklık gibi uygun olmayan hava koĢullarında etkinlik gösteremez ve dinlenme (diyapoz) dönemine girerler. Bu dönemde sivrisineklerin kan emme ve yumurtlama etkinlikleri durur (gerçek diyapoz). Büyük çoğunluğu ölür. Bazı türlerde ise diĢiler, kötü hava koĢullarında dahi (kıĢın ahır ve evlerde) kan emebilirler fakat yumurtlayamazlar. Bu durumda diyapoz, tam değildir (yumurtalık diyapozu) (56). Hibernasyon, Aedes ve Ochlerotatus cinslerinde yumurta döneminde görülmektedir. Anopheles claviger ve An.
plumbeus 3. veya 4. larval dönemde, Oc. rusticus ve Cs. morsitans 2. veya 3. larval dönemde hibernasyona girerler. Culex, Culiseta, Uranotaenia ve Anopheles cinslerinde eriĢkin dönemde hibernasyon görülmektedir (6). Sıtmanın vektörlüğünü yapan bazı Anopheles türlerinde kıĢın tam olmayan yumurtalık diyapozu gözlenir. Bu durum, sıtmanın kıĢın bulaĢtırılması açısından epidemiyolojik önem taĢımaktadır (56).
Hibernasyona girecek diĢiler, sonbaharın son günlerine doğru ahır ve evlere girerek kuytu bir köĢe, aralık, çatlak veya bodrumlara sığınırlar. Havaların soğuması ile sivrisineğin karnındaki yağ gözeleri sayıca artar ve yumurta geliĢimi durur, yumurta yerleri yağla sarılır. Hibernasyona giren diĢiler, su kaybını azaltmak için gliserol, trehaloz ve sorbitolü kullanmazlar, bunun yerine kutikular hidrokarbonları kullanarak su kaybını en aza indirirler (57). Ergin sivrisinek ayaklarını iki yana açar ve karnını duvara dayarcasına yaklaĢtırır. Besin alamaz ve uyuĢukluk (letarji) durumunda kalır.
Hibernasyon esnasında tedirgin edildiklerinde çok yakın bir yere geçerek orada kıĢlamaya devam ederler. Havaların ısınmasıyla hibernasyon sonlanır (56).
Çok sıcak ve kurak geçen yaz aylarında sıvı kaybı sonucu sivrisinek besin alamaz ve uyuĢukluk durumuna girer. Bu duruma da estivasyon (yaz uyuĢukluğu) denir (56).
Ergin sivrisineklerin beslenme tipleri:
Kan ile beslenen (haematophagous) artropodların beslenme yapıları ve konak tercihleri, birçok patojenin çoğalması ve omurgalı konaklara bulaĢması açısından oldukça önemlidir (58, 59). Vektörlerde beslenme yapılarının ve konak tercihlerinin belirlenmesi, vektör-borne hastalıklarla etkili mücadele stratejilerinin ve politikalarının oluĢturulmasına, salgın risklerinin azalmasına ve hem insan hem de hayvanlarda bu
hastalıkların eko-epidemiyolojilerinin daha iyi anlaĢılmasına oldukça önemli katkısı vardır (58). Culex pipiens erkeklerinin ağız yapıları delmeye elveriĢli olmadığından kan ememezler. Erkeklerin beslenmesi; nektarlar, bitki öz suları ve diğer sıvılar ile olmaktadır. DiĢilerin beslenmeleri ise çeĢitli omurgalılardan kan emme yoluyla olur.
Nitekim sivrisineklerin büyük bir çoğunluğu zoofilik olup, insanlar haricindeki hayvanlar ve soğukkanlı omurgalılardan kan emer. Kan emmek için insanı tercih eden türler antropofilik olarak tanımlanır (54). Konak ayrımı yapmadan hayvanlardan ve insanlardan kan emenlere ise zooantropofilik denir (56).
Beslenme yirmidört saatlik zaman dilimi tarafından kontrol edilen birçok insekt aktivitesinden birisidir (60). Ġnsektler ritmik paternlerde beslenir ve hareket ederler. Bu periyod içerisinde inaktif veya uyku dönemlerinde ise hareketsiz kalırlar ve beslenmezler (61). Endojen beslenme ritimleri günlük aydınlık/karanlık siklusların içerisinde olmakla birlikte diğer bazı eksternal ve internal faktörler de (Örn. Sıcaklık, rüzgâr, fizyolojik durum vb.) bu beslenme ritimlerini modüle edebilir (60). Ġnsektlerde erginlerin beslenmesi aydınlık (62, 63), karanlık (64, 65), veya gün doğumu/gün batımı (66, 67) ile sınırlıyken geliĢim dönemleri 24 saat boyunca geliĢigüzel beslenebilirler (68). Ġnsektlerin tüm hayat dönemleri boyunca, yakın türler veya tür içinde dahi beslenme aktivitesi periyodunda farklılıklar bulunabilir (66-71). Kanla beslenen insektlerin günlük beslenme ritimleri üzerine özellikle hastalık naklindeki önemlerinden dolayı vektör türler baĢta olmak üzere detaylı çalıĢmalar yapılmıĢtır (65, 67, 71-74).
Serbest yaĢayan kanla beslenen insektlerin (Örn., Culicide, Culicoides, Ceratopogonids vd.) beslenmeleri, aktif oldukları periyodların konak uygunluğu periyoduyla örtüĢmesini gerektirir. Bunun yanında 24 saat dilimindeki predatör aktivitesi ve çevresel koĢullar (Örn., sıcaklık, rutubet) da insekt uygunluğunu etkileyebilir (75). Yirmidört saatlik zaman dilimi tarafından kontrol edilen insekt kan beslenme aktivitesi, 1) konak uygunluğu, 2) predatör inaktivitesi ve 3) uygun çevresel koĢullar ile senkronize olan konak arama zamanı sayesinde bir mekanizma sağlamaktadır. Örneğin tahtakurularından Cimex lectularius‟un kan beslenmesi, insanların inaktif ve uygun, kısmi rutubetin ise yüksek olduğu sabahın erken saatlerinde gerçekleĢir (75). Birçok patojen ve parazitin vektörler tarafından nakli beslenme periyodlarının yüksek olduğu dönem boyunca Ģekillenir. Vektör türlerin kan emme periyodlarının pik dönemlerinin ve moleküler temellerinin bilinmesi, kan emici insekt türleri ile konaklarının temasını
azaltma amacıyla kontrol önlemlerinin geliĢtirilmesinde oldukça önemlidir. Son zamanlarda bazı vektör türlerde günlük davranıĢ ritimlerinin temelini oluĢturan endojen moleküler saatin detayları tarif edilmiĢtir (76, 77). Sivrisinekler arasında fotoperiyotla ilgili olarak konak arama için uçuĢlar ritmiktir (78-81). Konak varlığına dair iĢaretler de beslenme davranıĢlarını etkilemektedir (82). Bu iĢaretlerden biri CO2 olup, sivrisinek aktivasyonunda önemli olduğu (72) ve konak bulma için uzun mesafeli bir iĢaret rolü üstlendiği belirtilmektedir.
Sivrisineklerin uçma gücü: Havadaki nemin yükselmesi, sivrisineklerin uçuĢ mesafesini artırmaktadır. Ergin sinekler, nemin az olduğu havalarda dinlenme durumunda bulunurlar ve üreme yerlerinden 2-3 km uzağa uçabilirler. Bu mesafeler rüzgărın etkisiyle artabilmektedir. Sivrisineklerin kendi güçleri ile yayılıĢına “aktif dispersiyon”, rüzgâr ve çeĢitli hava, kara, su aracı ile daha uzak yerlere yayılıĢına ise
“pasif dispersiyon” denir. Sivrisinekler 1000 m yüksekliğe kadar çıkabilirler (56).
2.3. CULEX PIPIENS KOMPLEKSĠNĠN DAVRANIġ VE FĠZYOLOJĠSĠ
Cx. pipiens kompleksi içeren populasyonlar, patojen taĢınım etkinliği veya vektörlük potansiyelini etkileyen farklı davranıĢ ve fiziksel özelliklerde bulunmaktadırlar. Bu popülasyonlar, farklı larval habitatları (yeraltında yaĢayan, yerüstünde yaĢayan, kırsal ve Ģehir de yaĢayan) ve çoğrafik dağılımları tercih etmekte ve aynı zamanda konak beslenme modelleri, gonotrofik geliĢmeler ve ergin diĢilerin hibernasyonununda da farklılık göstermektedirler. Cx. pipiens kompleksi sivrisineklerin hibernasyonu davranıĢsal, biyokimyasal ve fiziksel olayların uyumunu içerir, genellikle çevresel sinyaller (fotoperiyod, sıcaklık, besin varlığı ve nem) aracılığıyla baĢlatılır ve önemli fiziksel ya da davranıĢsal değiĢiklikler ile sonuçlanmaktadır (83).
Kısa fotoperyotlarda Cx. pipiens form pipiens ve Cx. p. pallens diĢileri çitftleĢebilir ancak kan emme davranıĢları gözlenmez. Kısa fotoperyotlarda kanı sindirme yetenekleri kanın sindirimini sağlayan lipaz enzimlerinin baskılanması ile engellenmektedir (84).
DiĢiler nektar veya karbonhidrattan zengin besinlerle beslenerek vücutlarında biriken yağı uzaklaĢtırabilirler (84). ÇiftleĢen fakat kanla beslenmeyen diĢiler genellikle kısmen soğuk ve nemli yeraltında, bodrum ve mağaralar gibi kapalı/güvenli bölgelere kaçarlar (83). Hibernasyon içinde hareketsiz veya diyapoz halinde kalırlar. Cx. quinquefasciatus, Cx. globocoxitus, Cx. australicus, and Cx. pipiens form molestus diapoza girmezler ve
düĢük sıcaklıklarda yavaĢ yavaĢ geliĢmelerine rağmen sezon boyunca geliĢirler (30, 83).
Örneğin Avustralya‟da daha sıcak güney bölgelerde Cx. australicus, korunmuĢ bölgelere kaçabilmekte fakat gonotrofik ayrılma görülmemektedir. Bunun sonucunda ise doğru bir Ģekilde diapoz geçirememektedir (30). Diapoza girme eğilimi kompleks içerisindeki taksonlarda kısmen sürekli ortaya çıkmaktadır. Culex pipiens sivrisinekleri sonbahar sonunda diyapoza girer ve kanla beslenmeyi bırakırlarsa bu durumda yayılımları durur fakat benzer iklim Ģartlarında aynı alanda Cx. quinquefasciatus’ta bulunmaktadır böylece alanda daha geniĢ yayılabilmektedir.
Sıcaklık, Cx. pipiens kompleksi üyelerinin omurgalı kanı olmaksızın yumurta bırakma yeteneklerini veya otogeninin baskılanmasına sebep olmaktadır. Otogeni özellikle sınırlı sayıda konak bulunması durumunda sivrisinek yoğunluğunu artırabilir ve aynı zamanda patojenlerin taĢınımınıda azaltabilmektedir. Otogenik yumurtlama davranıĢı, larvaların sayısını ve beslenmesini etkilemektedir.
Otogeni, kanalizasyon ya da metro sistemi gibi yeraltı bölgelerinde soğuk hava Ģartlarında yaĢayan Cx. pipiens form molestus ile iliĢkilendirilmektedir (35, 85). Fakat Kuzey Kaliforniyan‟ın bir kısmı (86), Kuzey Afrika (18), Güney Afrika (87) gibi ılıman bölgelerde Cx. pipiens form molestus populasyonlarında da otogeninin yaygın olduğu bildirilmiĢtir (88).
Kompleks içinde oldukça farklı olan beslenme, özellikle yumurtlamak için kuĢ ya da memeli kanı ile olan beslenme eğilimidir.
Cx. pipiens kompleksi içerisinde yer alan Cx. pipiens, Cx. pipiens form pipiens ve Cx.
pipiens form molestus olmak üzere morfolojik olarak identik iki biyotipe ayrılmaktadır.
Ancak bu iki biyoform, davranıĢsal olarak farklılık göstermektedir. Örneğin Cx. pipiens f. molestus, ilk yumurta yığınını kan beslenmesinden önce bırakır. Buna karĢılık Cx.
pipiens f. pipiens reprodüksiyonunda kan beslenmesi zorunludur (89). Cx. pipiens f.
molestus popülasyonları sıklıkla yer altında (kiler, mahzen, yer altı tünelleri gibi) beslenirken (16, 90, 91), Cx. pipiens f. pipiens popülasyonları daha çok açık ve yer üstünde beslenir. Asya‟daki Cx. pipiens f. molestus popülasyonlarının günlük uçuĢ paternleri pipiens kompleksteki yer üstünde beslenen diğer alt türlere göre aritmik olduğu kaydedilmiĢtir (78, 92). Yetersiz ıĢık kaynaklarıyla karanlık habitatları ve uçuĢ aktivitesindeki aritmiye dair bulgular, Cx. pipiens f. molestus‟un yer üstünde beslenen
Cx. pipiens f. pipiens popülasyonları ile kıyaslandığında biyolojik yapısında ıĢık tarafından uyarılmadığını ortaya çıkarmıĢtır. Ayrıca bu iki biyoformun doğal popülasyonlarının da farklı konak tercihleri olduğu rapor edilmiĢtir. Cx. pipiens f.
pipiens‟in kan beslenmesinde daha çok kanatlı (93, 94), Cx. pipiens f. molestus‟un ise insanları (16, 95) tercih ettiği kaydedilmiĢtir.
2.4. CULEX TÜRLERĠNĠN ĠDENTĠFĠKASYONU
Sivrisineklerin doğru bir Ģekilde identifikasyonu, vektör taraması ve kontrolü için oldukça önemlidir. Çünkü farklı vektörlerin bulunma oranları ve enfeksiyonu çoğunlukla transmisyon risklerini farklı seviyelerde göstermektedir. Cx. pipiens kompleks sivrisineklerinin doğru bir Ģekilde identifikasyonu çeĢitli metodlara dayanmaktadır. Cx. pipiens‟den Cx. quinquefasciatus’u ayırmak için diĢi üreme organları (DV/D ratio) ve kanat damarlanmasında ki kantitatif karakterler kullanılmaktadır (29). Hibritler ise genellikle ebeveyn populasyonunun fenotipik ve genotipik özelliklerini orta seviyede göstermektedir. Bu yüzden hibritler arasındaki ayırım çok güvenilir olmamaktadır (48, 96-98).
Ayrıca Cx. pipiens’in (form pipiens ve form molestus) 2 formu morfolojik karakterler kullanılarak ayırt edilememektedir (95). Dolayısıyla onların identifikasyonu, karakteristik olarak yumurta geliĢmesinde ki farklılıklar (Cx. pipiens form molestus da sıklıkla autogeny gözlenmektedir) ve /veya tercih ettikleri larval habitatlar incelenerek (form molestus yer altı bölgelerini form pipiens yerüstü bölgelerini tercih eder) ayırt edilebilmektedirler. Kuzey Amerika‟da Culex restuans, Cx. nigripalpus ve Culex salinarius, Kuzey Avrupa‟da Culex torrentium, Yeni Zellanda‟da Culex pervigilans, ve Orta ve Doğu Asya‟da Culex vagans, Cx. pipiens kompleks içinde yer alan türlerden genetik olarak farklılıklar göstermektedir.
Lokal popülasyonlarda gözlenen morfolojik ve biyolojik karakterlerdeki varyasyonlar, Cx. pipiens kompleks türlerinin taksonomik durumuyla ilgili olarak daha kesin verilerin gerekliliğini ortaya koymuĢtur (18). Tür kompleksinin taksonomik durumunun kesin olarak ortaya konması farklı popülasyonlarda yapılacak çalıĢmalardan elde edilecek daha kesin ve bütünleyici bilgilere ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir (16). Dünyada Cx. pipiens kompleksinin hızlı ve baĢarılı identifikasyonu oldukça önemlidir.
Morfolojik teĢhis yöntemlerinin çeĢitli zorlukları bulunmakta olup zaman alıcı ve
erkeklerle sınırlıdır. Biyokimyasal ve moleküler teknikler 1995 yılında Cx. pipiens kompleksinin identifikasyonunda kullanılmaya baĢlanmıĢtır. Crabtree ve ark. (99) ITS 2 genini hedef alan standart PCR yöntemlerinin Cx. pipiens kompleks, Cx. restuans ve Cx. salinarius türlerinin ayrımında kullanıĢlı olduğunu ancak tür kompleksinin identifikasyonunda yetersiz kaldığını söylemiĢlerdir. Basit sekans tekrarları (SSRs) veya kısa ard arda tekrarlar (STRs) olarak da bilinen Microsatellite lokus ile ACE2, COI ve ITS genleri üzerine PCR ve PCR-RFLP gibi diğer moleküler tekniklerde tür kompleksinin ayrımında kullanılmıĢtır. Bunlar arasında ACE geni ve Microsatellite lokus en önemli karakterler olarak nitelenmiĢ ve özellikle Cx. pipiens ve Cx.
quinquefasciatus‟un ayrımında kullanılabileceği belirtilmiĢtir (35, 100).
Sivrisineklerin identifikasyonu polimeraz zincir reaksiyonu temel alınırak yapılmakta ve tür spesifik primerlerin hedef aldğı 12S-ribosomal (99), ACE2 gen bölgesi (22, 97), ya da diğer nükleer sekans analizleri kullanılmaktadır (Tablo 2.2) (101).
Tablo 2.2. Culex pipiens kompleks ve morfolojik olarak benzer türlerin ayırımında kullanılan gen bölgeleri
Lokus Hedef türler Referans
Ribosomal
Cx. pipiens sl Cx. restuans Cx. salinarius
(99)
Nuclear
Cx. p. pipiens
Cx .quinquefasciatus (99)
Ribosomal
Cx. pipiens sl, Cx. nigripalpus
(96)
Nuclear (Ace2)
Cx. p. pipiens Cx. quinquefasciatus
Cx. p. pallens Cx. torrentium Cx. australicus Cx. pervigilans
(22)
Nuclear (Ace2)
Cx. pipiens
Cx. quinquefasciatus (97)
Nuclear (Ace2)
Cx. p. pallens
Cx. pipiens f. molestus (102)
Nuclear (CQ11)
Cx. pipiens f. pipiens
Cx. pipiens f. molestus (101)
2.5. CULEX PIPIENS’ĠN EPĠDEMĠYOLOJĠSĠ
Cx. pipiens’in atasının eski buzullardan sonra Afrika‟nın yüksek bölgeleri ve ılıman Kuzey Avrupa bölgelerinde de kolonize olan bir Afrika türü olduğu tespit edilmiĢtir.
Yakın zamanda, muhtemelen erken 16. Yüzyılda yenidünyada var olan bütün ılıman iklimlerde bulunmaktadırlar (16).
Cx. quinquefasciatus‟un atası ise tropik iklimlerde yaĢamıĢtır ve bunun yanısıra Güneydoğu Asya da yaĢayan populasyonları da bulunmaktadır (47). Cx.
quinquefasciatus‟un Doğu Afrika ve Asya da ki mevcudiyeti hakkında genetik çalıĢmaların yapılması gerekmektedir. Cx. quinquefasciatus‟un Batı Afrikadaki varlığı 1950‟lerde ekolojik gözlemler ile belirlenmiĢ (25) ve son zamanlarda genetik analizlerle de desteklenmiĢtir (47).
Cx. pipiens kompleks sivrisineklerinin yoğunluğu sucul ortamdaki besinlerden faydalanma baĢarıları ile doğru orantılıdır. Culex pipiens kompleks türleri yaygın bir Ģekilde yüksek organik bileĢenler içeren sucul habitatlar da geliĢirler (16). Birçok araĢtırmacı Culex p. form pipiens ve Cx. quinquefasciatus’un dünya çapındaki dağılımı ve yoğunluğunun insan taĢımacılığından kaynaklandığını düĢünmektedirler (29, 103).
Büyük gemilerin karinaları özelliklede uzun yolculuklarda jüvenil sivrisinekler için habitat sağlayabilecek durumdadır. Buralardaki fazla sayıdaki insan ve hayvan, sivrisinekler için birkaç jenerasyonun yaĢayabileceği kadar besin sağlayabilecek durumdadırlar.
Cx. pipiens kompleks‟in iki ayrı domestik yayılımı vardır. Kuzey Afrika‟da tarımın geliĢmesi, Cx. pipiens form molestus‟un yayılmasına yol açmıĢtır (35). Buna karĢılık Güneydoğu Asya da muhtemelen tarımın ilerlemesi, Cx. quinquefasciatus‟un domestik formlarının yayılmasına neden olmuĢtur (47, 104).
Cx. pipiens form molestus ev sivrisineklerinin stereotipine uyar ve son derece kirli kanalizasyonlarda geliĢir. Genellikle evlere girerek kapalı alanlarda çiftleĢir ve kolaylıkla memeliler üzerinden beslenir. Özellikle de Mısır‟da lenfatik filariazis‟in esas vektörü olarak rol oynar. Cx. quinquefasciatus‟un domestik popülasyonu ise Çin ve Güneydoğu Asya da lenfatik filariazis‟in bulaĢtırılmasında önemli rol oynamaktadır (105).
2.5.1. Türkiye’de Cx. pipiens Kompleks Üzerine Moleküler ÇalıĢmalar
Türkiye‟de günümüze kadar sivrisinek türleri üzerine yapılan çalıĢmaların daha çok morfolojik identifikasyonlara dayalı prevalans çalıĢmaları olduğu ve moleküler tabanlı
çalıĢmaların çok sınırlı olduğu görülmektedir. Benzer olarak Cx. pipiens kompleks üyelerinin genotiplendirilerek karakterizasyonlarının sağlandığı yalnızca iki çalıĢma (106, 107) bulunmaktadır. Bu çalıĢmalardan Günay ve ark. (107); Türkiye‟nin farklı bölgelerinden izole edilen ve morfolojik analizlerle Culex soyunda belirlenen Cx.
(Barraudius) modestus, Cx. laticinctus, Cx. mimeticus, Cx. perexiguus, Cx. pipiens, Cx.
pipiens form molestus (laboratuvar kolonisi olarak belirtilmiĢ), Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Cx. torrentium, Cx. tritaeniorhynchus ve Cx. hortensis türlerinin mt-COI gen bölgesine göre barkodlamalarını ve karakterizasyonlarını yapmıĢlardır. Ergunay ve ark. (106) da Türkiye‟nin farklı bölgelerinden izole edilen sivrisinek örneklerinde Batı Nil Virusu‟nu araĢtırdıkları çalıĢmalarında mt-COI sekans analizleri ile Cx. pipiens kompleks içerisinde Cx. quinquefasciatus ve Cx. perexiguus türlerini ilk kez rapor etmiĢlerdir.
Bunun yanında yine Cx. pipiens kompleks nesillerinin tularemi (108), kanatlı sıtması (109), D. immitis (110), ve Batı Nil Virusu (106) gibi patojenlere vektörlük potansiyelleri, Wolbachia endosimbiontunun araĢtırılması (111, 112) ve kan beslenmesinde konak tercihlerinin moleküler analizleri (113) üzerine moleküler düzeyde çeĢitli araĢtırmalar yapılmıĢtır.
2.5.2. Dünyada Cx. pipiens Üzerine Moleküler ÇalıĢmalar
Culex pipiens dünyada geniĢ bir yayılıma sahip olmakla birlikte Culex pipiens‟in alt türleri ile ilgili hem morfolojik hemde moleküler anlamda yapılmıĢ birçok çalıĢma bulunmaktadır.
Smith ve Fonseca tarafından (22) Culex pipiens kompleks üyelerini ve hibritlerini identifiye etmek için yapılan PCR tabanlı çalıĢmada Culex pipiens kompleks (Cx.
pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. p. pallens, Cx. australicus), Cx. torrentium ve Cx.
pervigilans, Cx. pipiens ve Cx. quinquefasciatus arasındaki hibritleri belirlemek için acetylcholinesterase (ace2) gen bölgesi kullanılmıĢtır.
Weitzel ve ark‟nın (44) Almanyada yaptığı çalıĢmada Culex pipiens ve Culex torrentium’un ergin diĢi ve erkelerinin ayırımının yanı sıra larvaların ayırımınıda gösteren adenylate kinase (AK) ve 2- hydroxybutyrate dehydrogenase (HBDH) enzimleri tür teĢhisi için kullanılmıĢtır. Toplanan 712 örnekden %96.1‟i Cx pipiens,
%3.9‟u ise Cx. torrentium olarak belirlemiĢlerdir.
Weitzel ve ark.‟nın (114) Polonya‟nın Wroclaw bölgesinde yaptıkları bir çalıĢmada, adenylate kinase (AK) ve 2- hydroxybutyrate dehydrogenase (HBDH) enzimleri tür teĢhisi için kullanılmıĢ ve çalıĢma sonucunda 24 farklı bölgeden toplanan 650 adet Culex larvasının %94‟nün Culex pipiens, %6‟sının ise Culex torrentium olduğu görülmüĢtür.
Kuzey Afrikada yapılan baĢka bir çalıĢmada ise Amraoui ve ark. (115) 2010 yazında topladıkları örneklerin 2012 yılında CQ11 mikrosatellit analizini yapmıĢlar ve 214 eriĢkin Culex pipiens örneğinden %55.6‟sının Culex pipiens form pipiens, %33.3‟ünün Culex pipiens form molestus ve %11.1‟nin ise hibrit olduğunu saptamıĢlardır.
Rudolf ve ark.‟nın (7) Almaya‟nın çeĢitli bölgelerinden 2011 ve 2012 yıllarında toplanan Culex pipiens örnekleri üzerinde yaptıkları çalıĢmada Cx. torrentium ve Cx.pipiens gen lokuslarını ayırt etmek için acetylcholinesterase (ace2) ve Cx.pipiens biyotiplerini ayırt etmek için ise CQ11 mikrosatellit lokusu kullanmıĢ, çalıĢmada identifiye edilen 350 sivrisinek örneğinden 227‟sinin Cx.pipiens form pipiens, 3‟ünün Cx.pipiens form molestus, 119‟unun Culex torrentium ve 1‟inin de hibrit olduğu tespit edilmiĢtir.
Di Luca ve ark.(116) tarafından yapılan çalıĢmada ise Ġtalyanın farklı bölgelerinden topladıkları 914 Culex pipiens örneğini Ace/CQ11 Mikrosatellit analizine tabii tutmuĢlardır ve sonuçta 576 (63.0%) Cx.pip f. pip. 206 (22.6%) Cx.pip f. mol. ve geriye kalan 132 (14.4%) örneği hibrit olarak belirlemiĢlerdir.
2.6. CX. PIPIENS’ĠN VEKTÖRLÜK POTANSĠYELĠ
Sivrisinekler, medikal açıdan önemli olan çeĢitli patojenleri naklederler. Virüsler, bakteriler, protozoonlar ve nematodların etkeni olduğu önemli hastalıklar olan sıtma, dengue, sarıhumma, çeĢitli viral ensefalitler ve filariosis vb.‟nin nakillerinden sorumludurlar. Sivrisineklerin vektörlük rolleri mekanik veya biyolojik olabilmektedir (1).
Cx. pipiens kompleks sivrisineklerinin genetik varyasyonu, enfekte olan sivrisineklerin virüsü yaymasını ve/veya nakletme yeteneğini etkileyebilmektedir (117). Örneğin microsatellit analizlerinde New York‟dan farklı lokasyonlardan toplanan Cx. pipiens sivrisineklerinin benzer lokasyonlardan toplanan sivrisineklere göre WNV için
vektörlük kabiliyetinin genetik olarak farklı olduğu saptanmıĢtır (118). Kuzeydoğu ve Orta Amerikanın kuzeyin‟de WNV‟nin baskın vektörü Cx. pipiens’dir (103, 119-121).
WNV için vektörlük kabiliyetinde önemli farklılık gösteren Cx. pipiens form pipiens, form molestus ve Cx. quinquefasciatus‟un kolonilerinin laboratuar hibritleri ile yapılan çalıĢmalar son zamanlarda arttırılmıĢtır (122).
Cx. pipiens sivrisinekleri, insanları enfekte eden WNV, St. Louis Encephalitis virusü ve filariyal nematodların yanı sıra kanatlı malaryası gibi vahĢi yaĢam patojenlerini içeren çeĢitli patojenlerin naklinde de önemli rol oynamaktadır (121, 123, 124). Bir tür içinde ki populasyonlar arasındaki farklı beslenme varyasyonları onların bulaĢtırdıkları patojenlerde önemli değiĢikliğe neden olmaktadır. Örneğin Güneydoğu Asya‟daki Cx.
quinquefasciatus çoğunlukla insanlar üzerinden beslenir ve insan lenfatik filariasis‟inin temel vektörüdür. Oysaki Hawai‟deki Cx. quinquefasciatus populasyonu kuĢlar üzerinden beslenir, kuĢ malaryası (Plasmodium relictum) ve nesli tükenmekte olan endemik Avian pox‟un en etkili vektörüdür (125, 126).
Asya, Afrika ve Güney Amerika‟nın tropik bölgelerinde lenfatik filariasis etkeni olan nematodlar, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi ve Brugia timori, yaklaĢık 120 milyon insanı etkilemiĢtir. Buralarda görülen filariasis vakalarının yaklaĢık %90‟ında hastalık etkenini W. Bancrofti oluĢturmaktadır. Hastalığın vektörlüğünü yapan en önemli türler ise Culex pipiens quinquefasciatus ve Mansonia spp.‟dir (6).
WNV‟nin evrimleĢmiĢ genetiği, 1999‟da çıkartılmaya baĢlanmıĢ (termed NY99), 2001‟de ilk saptamalar elde edilmiĢ (termed WN02) ve 2004‟de (127, 128) tamamlanmıĢtır. Sonraki araĢtırmalar da evrimleĢmiĢ WN02 genotipindeki viral suĢların Culex pipiens ve Culex tarsalis sivrisineklerinin her ikisinde de vektörlük kabiliyetliğini arttırdığı görülmüĢtür (128, 129) ve bu farkın özellikle yüksek sıcaklıklarda ortaya çıktığı gösterilmiĢtir (130). WNV„nin NY99 ve WN02 soyundan gelen suĢlarının arasındaki fark, sadece 3 nükleotidden kaynaklanmakta olup 159. pozisyondaki alanin yerine valin gelmesiyle aminoasit değiĢlikliğine yol açmaktadır (127, 128).
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. ARAġTIRMA SAHASI
ÇalıĢma Haziran-Ağustos 2014 tarihleri arasında sivrisineklerin yoğun gözlendiği Kayseri‟nin Ġncesu, Bünyan ve YeĢilhisar ilçelerindeki çeĢitli odaklarında yürütülmüĢtür (ġekil 3.1).
ġekil 3.1. AraĢtırma sahası
3.2. SĠVRĠSĠNEK ÖRNEKLERĠNĠN TOPLANMASI
Ergin diĢi sivrisineklerin yakalanması amacıyla karbondioksitli (Kurubuz hazneli) (ġekil 3.2) CDC ıĢık tuzakları (All-Weather LED EVS Traps, 2780, BioQuip Products CA 90220, USA) kullanılmıĢtır. Tuzaklar 17.30-19.00 saatleri arasında aktive edilmiĢ ve ertesi gün 07.00-08.30 saatleri arasında tekrar toplanmıĢtır. Yakalanan sivrisinekler tutuldukları fileler içinde laboratuvara canlı olarak getirilmiĢtir (ġekil 3.3). Sineklerin
ölmesi amacıyla fileler -20 oC‟de 30 dk bekletilmiĢtir. Ölen sinekler %70 etil alkol ile 2 ml‟lik ependorflar içine toplanmıĢtır.
ġekil 3.2. Karbondioksitli (Kurubuz hazneli) CDC ıĢık tuzağı
ġekil 3.3. AraĢtırma sahasından toplanan sivrisinek örnekleri
3.3. MORFOLOJĠK ĠDENTĠFĠKASYON
Ependorflar içerisinde bulunan sivrisinek örnekleri bilgisayar destekli stereo mikroskop altında çeĢitli tür ayrımına iliĢkin kaynaklar (24, 131, 132) ve elektronik ortamda yazılı
Avrupa Sivrisinekleri Tür Ayrım Anahtarı (133) kullanılarak identifiye edilmiĢ ve Culex pipiens kompleks/Cx. torrentium olarak identifikasyonları sağlanan örnekler ayrılmıĢtır. Ayrılan örneklerin entegre digital kamera sistemiyle morfolojik özellikleri görüntülenmiĢ ve veriler kayıt altına alınmıĢ sonrasında %70 etil alkol içerisine alınarak moleküler analizlere kadar muhafaza edilmiĢtir.
3.4. MOLEKÜLER ANALĠZLER 3.4.1. Genomik DNA Ġzolasyonu
%70 etil alkol içerisinde muhafaza edilen sivrisinek örneklerinden genomik DNA izolasyonu moleküler ve filogenetik analizler için bireysel örnekler üzerinde gerçekleĢtirilmiĢtir.
Sivrisineklerden genomik DNA ekstraksiyonu, Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı Laboratuarı'nda bulunan ekstraksiyon ünitesinde yapılmıĢtır.
%70‟lik etil alkol solüsyonu içerisinde muhafaza edilen örneklerin her biri önce steril DNA‟se RNA‟se free mikrosantrifüj tüplerine alınmıĢ ve üzerlerine sıvı azot ilave edilerek steril pestle ile toz haline getirilmiĢtir (ġekil 3.4).
ġekil 3.4. Sivrisinek örneklerinin sıvı azot yardımıyla ezilmesi
Daha sonra tüplerin üzerine 20µl proteinase K ve 150 µl lysis buffer ilave edilerek hemen 1dk vortekslenmiĢtir, 56°C‟de 1 gece su banyosunda tutulmuĢtur. Tüplerden
