ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
DOKTORA TEZĐ
GENTIANA OLIVIERI GRISEB.’DE KALLUS VE SÜSPANSĐYON KÜLTÜRLERĐNDE BULUNAN BAZI SEKONDER METABOLĐTLER
Canan YAĞCI TÜZÜN
BĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI
2011 ANKARA
TEZ ONAYI
Canan YAĞCI TÜZÜN tarafından hazırlanan “Gentiana olivieri Griseb.’de Kallus ve Süspansiyon Kültürlerinde Bulunan Bazı Sekonder Metabolitler” adlı tez çalışması 02/12/2011 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda DOKTORA TEZĐ olarak kabul edilmiştir.
Danışman : Prof. Dr. M. Cihat TOKER Eş danışman : -
Jüri Üyeleri:
Başkan: Prof. Dr. Rukiye TIPIRDAMAZ
Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Üye: Prof. Dr. M. Cihat TOKER
Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Üye: Doç. Dr. Gül Nilhan TUĞ
Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Üye: Yrd. Doç. Dr. H. Nurhan BÜYÜKKARTAL Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Üye: Yrd. Doç. Dr. Hatice ÇÖLGEÇEN Zonguldak Karaelmas Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Yukarıdaki sonucu onaylarım
Prof. Dr. Özer KOLSARICI Enstitü Müdürü
ÖZET
Doktora Tezi
GENTIANA OLIVIERI GRISEB.’DE KALLUS VE SÜSPANSĐYON KÜLTÜRLERĐNDE BULUNAN BAZI SEKONDER METABOLĐTLER
Canan YAĞCI TÜZÜN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. M. Cihat TOKER
Flavonoit, iridoit ve alkaloit içeren Gentiana olivieri Griseb. (Gentianaceae), antidiyabetik, antidepresan ve sindirime yardımcı olarak kullanılmaktadır. Flavonoit (izoorientin ile izoviteksin) ve iridoitlerin (gentiopikrozit ile svertiamarin) varlığı G. olivieri kallus ve süspansiyon kültürlerinde araştırıldı. G. olivieri tohumları 0.1 mM GA3 içeren Woody Plant Medium (WPM)’da çimlendirildi. Kallus üretmek için ilk deneme için yaprak ve kök eksplantları, ikincisi için sadece yaprak eksplantı kullanıldı. Her iki denemede de eksplantlar 60 günlük aseptik fidelerden alındı. Eksplantlar 1 mg/l Naftalen Asetik Asit (NAA) ile 0.5 mg/l Benzil Amino Purin (BAP) veya 0.2-0.5 mg/l Kinetin içeren Murashige ve Skoog (MS) ile WPM ortamlarına ekildi. Kültürler ilk denemede karanlıkta; ikincide ise 16/8 aydınlık/karanlık fotoperiyotta 3000 lux ışık şiddetinde inkübe edildi. Đkinci denemeden elde edilen kalluslardan süspansiyon kültürleri kuruldu. Kallus kültürlerinden 3 alt kültür ve süspansiyon hücrelerinden 25 gün boyunca üretilen sekonder metabolitler; kalitatif ve kantitatif olarak araştırıldı.
Sekonder metabolit üretiminde süspansiyon kültürü, kallus kültürüne göre daha verimli bulundu. 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l BAP içeren WPM ortamında 20. günde süspansiyon kültüründe gelişen hücrelerde izoviteksin miktarı G. olivieri ekstresinden 10 kat fazla bulundu (0.408 mg/g). 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l Kinetin içeren WPM ortamında 1. alt kültürde gelişen kallus hücreleri izoorientin üretimi için en iyi sonucu verdi (0.492 mg/g). Đridoit yapıda olduğu düşünülen fakat gentiopikrozit ve svertiamarin ile eşleşmeyen maddeler üretildi.
Aralık 2011, 124 sayfa
Anahtar Kelimeler: Gentiana olivieri, kallus kültürü, hücre süspansiyon kültürü, bitki sekonder metabolitlerinin üretimi
ABSTRACT
Ph. D. Thesis
SOME SECONDARY METABOLITES OF CALLUS AND SUSPENSION CULTURES OF GENTIANA OLIVIERI GRISEB.
Canan YAĞCI TÜZÜN Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor : Prof. Dr. M. Cihat TOKER
Gentiana olivieri Griseb. (Gentianaceae), which contains flavonoid, iridoid and alkaloid, has been used as antidiabetic, antidepressant and digestive aid. Existence of flavonoids (isoorientin and isovitexin) and iridoids (gentiopicroside and swertiamarin) were investigated in callus and suspension culture of G. olivieri. Seeds of G. olivieri were germinated in Woody Plant Medium (WPM) with 0.1 mM GA3. Leaf and root explants were used for the first experiment while only leaf explant was used for the second to produce callus. In both experiments, explants were obtained from 60 days old aseptic plantlets. Explants were sown onto Murashige & Skoog Medium (MS) and WPM including 1 mg/l Naphtalane Acetic Acid (NAA) with 0.5 mg/l Benzyl Amino Purine (BAP) or 0.2-0.5 mg/l Kinetin. Cultures were incubated in the dark in the first experiment while the second was in 3000 lux at 16/8h light/dark photoperiod. Suspension cultures were established from calli which obtained from the second experiment. Secondary metabolites, which were produced from callus cultures during 3 sub-culture and from suspension cultures during 25 days, were investigated qualitatively and quantitatively.
Suspension cultures were found more productive than callus cultures in terms of secondary metabolite production. Quantity of isovitexin, grown in WPM suspension cultures containing 1 mg/l NAA and 0.5 mg/l BAP in the 20th day, was found ten times more from G. olivieri extract (0.408 mg/g). Callus cells which grown in WPM containing 1 mg/l NAA and 0.5 mg/l Kinetin in the first sub-culture were found to be more succesful for isoorientin production (0.492 mg/g).
Substances, which were considered to have iridoidal structure but had no match with gentiopicroside and swertiamarin, were produced.
December 2011, 124 pages
Key Words: Gentiana olivieri, callus culture, cell suspension culture, production of plant secondary metabolites
TEŞEKKÜR
Bu tez, Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü tarafından desteklenen “Gentiana olivieri Griseb.’de kallus oluşumu ve kallusta izoorientin miktarının tayini (2001-K- 120-240)” ile TÜBĐTAK tarafından desteklenen “Bitkisel Kaynaklı Đlaç Etken Maddelerinin Biyoteknolojik Yöntemlerle Üretilmesi Üzerine Çalışmalar (1055343)”
adlı projeler kapsamında yürütülmüştür.
Bu çalışmayı yürütmemi sağlayan, fikirleriyle beni yönlendiren, araştırmalarımda ilgi, bilgi ve desteğini esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. M. Cihat TOKER ve çalışmalarımda her zaman desteğini gördüğüm ve Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakognozi Ana Bilim Dalı’nda bulunan laboratuarında tüm imkanları sunan Sayın Hocam Prof. Dr. Gülnur TOKER’e sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Kantitatif analizleri yürüttüğüm Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakognozi Ana Bilim Dalı’nda görev yapan Sayın Hocalarım Prof. Dr. Đhsan ÇALIŞ, Prof. Dr. Tayfun ERSÖZ, Doç. Dr. Funda Nuray YALÇIN başta olmak üzere tüm personele güleryüzlerinden, verdikleri destek ve yardımlarından dolayı şükranlarımı sunarım.
Hayatım boyunca attığım her adımda bana destek olan babam Emin Ali YAĞCI, annem Ayşe YAĞCI, abim Ayhan YAĞCI’ya tüm kalbimle teşekkür ederim. Tezimi bitirmemde sonsuz manevi desteğini gördüğüm eşim Mehmet Murat TÜZÜN’e sonsuz teşekkür ederim.
Canan YAĞCI TÜZÜN Ankara, Aralık 2011
ĐÇĐNDEKĐLER
ÖZET ... i
ABSTRACT ... ii
TEŞEKKÜR ... iii
SĐMGELER DĐZĐNĐ ... vii
ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ ... viii
ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ ...x
1. GĐRĐŞ ...1
2. KAYNAK ÖZETLERĐ ...5
2.1 Gentianaceae Familyası ve G. olivieri ile Đlgili Sistematik Bilgiler ...5
2.1.1 Gentianaceae familyası ...5
2.1.2 Gentiana L. cinsi ...5
2.1.3 Türkiye’de yayılış gösteren Gentiana türlerinin teşhis anahtarı (Davis 1978) ...6
2.1.4 Gentiana olivieri Grisebach ...7
2.1.4.1 Sistematik bilgileri ...7
2.1.4.2 Genel özellikleri ve habitatı ...7
2.1.4.3 Türkiye’deki yayılışı ...8
2.1.4.4 Sinonim ve yerel isimleri ...9
2.2 Gentiana L.’nin Kullanım Alanları ...9
2.2.1 Gentiana olivieri’nin kullanım alanları ... 11
2.3 Gentiana L.’de Bulunan Biyoaktif Özellikteki Bileşikler ... 11
2.3.1 Flavon C-heterozitler (C- Glikozil flavonoitler) ... 13
2.3.1.1 Flavon C-heterozitlerin genel özellikleri ve biyosentez yolları ... 13
2.3.1.2 Flavon C-heterozitlerin biyolojik aktivite ve kullanım alanları ... 15
2.3.2 Đridoit ve sekoiridoit glikozitler ... 16
2.3.2.1 Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin genel özellikleri ve biyosentez yolları ... 16
2.3.2.2 Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin biyolojik aktivite ve kullanım alanları ... 18
2.4 Doku Kültürü ile Đlgili Genel Bilgiler ... 18
2.4.1 Bitki doku kültürünün uygulama alanları... 19
2.4.2 Bitki doku kültürü yöntemleri ... 20
2.4.2.1 Kallus kültürü ... 20
2.4.2.2 Süspansiyon kültürü ... 20
2.4.2.3 Organ kültürü ... 21
2.4.2.4 Somatik embriyogenez ... 21
2.4.2.5 Mikroçoğaltım ... 21
2.4.2.6 Transgenik bitki üretimi ... 22
2.4.3 Bitki doku ve hücre kültürü teknikleri kullanılarak sekonder metabolit üretiminin ticari önemi, avantaj ve dezavantajları ... 22
2.4.4 Bitki Doku Kültürlerinde Sekonder Metabolit Üretimini Artırmak Đçin Stratejiler ... 23
2.4.4.1 Üretici gücü yüksek hücre hatlarının taranması ve seçilmesi ... 23
2.4.4.2 Ortam miktarlarının ve bileşenlerinin değiştirilmesi ... 24
2.4.4.2.1 Şeker miktarı ... 24
2.4.4.2.2 Nitrat miktarı ... 25
2.4.4.2.3 Fosfat miktarı ... 25
2.4.4.2.4 Büyüme düzenleyiciler ... 25
2.4.4.2.5 Öncü molekül beslemesi ... 26
2.4.4.3 Kültür şartlarının optimizasyonu ... 26
2.4.4.3.1 Sıcaklık ... 26
2.4.4.3.2 Aydınlatma ... 26
2.4.4.3.3 Çalkalama ... 27
2.4.4.4 Uyarma (Elisidasyon) ... 27
2.4.4.5 Permeabilizasyon ... 27
2.4.5 Bitki doku kültüründe kullanılan besin ortamları ... 28
2.5 Gentiana L. Üzerine Yapılan Çalışmalar ... 30
2.5.1 Fitokimyasal çalışmalar ... 30
2.5.1.1 Flavonoitlerle ilgili fitokimyasal çalışmalar ... 30
2.5.1.2 Đridoit ve sekoiridoitlerle ilgili fitokimyasal çalışmalar ... 31
2.5.2 Biyoaktivite çalışmaları ... 32
2.5.2.1 Flavonoitlerle ilgili biyoaktivite çalışmaları ... 32
2.5.2.2 Đridoit ve sekoiridoitlerle ilgili biyoaktivite çalışmaları ... 33
2.5.3 Doku kültürü çalışmaları ... 34
2.5.3.1 Gentiana türleri ile yapılan doku kültürü çalışmaları ... 34
2.5.3.2 Gentiana türlerinde ve Gentianaceae familyasına dahil bitkilerde yapılan sekonder metabolit üretimi çalışmaları ... 38
2.6 Gentiana olivieri Griseb. üzerine yapılan çalışmalar ... 41
2.6.1 Fitokimyasal çalışmalar ... 41
2.6.2 Biyoaktivite çalışmaları ... 42
2.6.3 Doku kültürü çalışmaları ... 43
3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 45
3.1 Materyal ... 45
3.2 Yöntem ... 45
3.2.1 Besin ortamının hazırlanması ... 46
3.2.1.1 Stok çözeltiler ... 46
3.2.1.1.1 Major tuz stok çözeltilerinin hazırlanması ... 46
3.2.1.1.2. Minor tuz stok çözeltilerinin hazırlanması ... 47
3.2.1.1.3 MS ortamı için demir stok çözeltisinin hazırlanması ... 48
3.2.1.1.4 Vitamin stok çözeltisinin hazırlanması ... 48
3.2.1.2 Bitki büyüme düzenleyicileri ... 49
3.2.1.2.1 Naftalen Asetik Asit (NAA) stok çözeltisi (1 mg/ ml) ... 49
3.2.1.2.2 Benzil Amino Purin (BAP) stok çözeltisi (1 mg/ ml) ... 49
3.2.1.2.3 Kinetin stok çözeltisi (1 mg/ ml) ... 50
3.2.1.3 Besin ortamlarının hazırlanması ... 50
3.2.1.4 pH ayarı... 51
3.2.1.5 Sterilizasyon ... 51
3.2.1.5.1 Besin ortamının sterilizasyonu ... 51
3.2.1.5.2 Diğer malzemelerin sterilizasyonu ... 52
3.2.1.5.3 Ekim odasının sterilizasyonu ... 52
3.2.1.5.4 Tohum için yüzey sterilizasyonunun basamakları ... 53
3.2.1.5.5 Eksplantların yüzey sterilizasyonu ... 53
3.2.1.6 Ortamların petrilere dökülmesi ... 53
3.2.1.7 Ortamlara yapılan ekimler ... 54
3.2.1.7.1 Tohum çimlendirilmesi ... 54
3.2.1.7.2. Kallus kültürü ... 55
3.2.1.7.3 Süspansiyon kültürü ... 57
3.2.2 G. olivieri, kallus ve süspansiyon ekstrelerinin hazırlanması ... 58
3.2.3 Standart maddelerin hazırlanması ... 59
3.2.4 Kallus ve süspansiyon kültürlerinde sekonder metabolit analizi ... 59
3.2.4.1 Đnce tabaka kromatografisi (ĐTK) ... 59
3.2.4.2 Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ... 60
3.2.5 HPLC sonuçlarının değerlendirilmesi ... 61
3.2.5.1 Piklerin doğruluğunun belirlenmesi ... 61
3.2.5.2 Kalibrasyon eğrisinin çizilmesi ... 62
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ... 63
4.1 In vitro Çimlendirme ... 63
4.2 Kallus Üretimi ... 63
4.2.1 Kallusların karanlıkta inkübasyonu ... 63
4.2.2 Kallusların aydınlıkta inkübasyonu ... 64
4.2.3 Kütle büyüme indeksleri (KBĐ) ... 64
4.2.3.1 Karanlık inkübasyon için KBĐ bulguları ... 64
4.2.3.2 Aydınlık inkübasyon için KBĐ bulguları ... 68
4.3 Süspansiyon kültürü ... 71
4.3.1 Kütle büyüme indeksi (KBĐ), ortam ve pH miktarındaki değişimler ... 71
4.4.1 Kalitatif analiz (ĐTK) ... 74
4.4.1.1 Karanlık inkübasyonda gelişen kallus kültürlerinin ĐTK’sı ... 74
4.4.1.2. Aydınlık inkübasyonda gelişen kallus kültürlerinin ĐTK’sı ... 74
4.4.1.3 Süspansiyon kültürlerinin ĐTK’sı ... 79
4.4.2 Kantitatif analiz (HPLC) ... 79
4.4.2.1 Kalibrasyon eğrisinin çizilmesi ... 85
4.4.2.2 Kallus ekstreleri için HPLC analizi ... 86
4.4.2.3 Süspansiyon kültüründen elde edilen hücre ekstreleri için HPLC analizi ... 87
5. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 101
KAYNAKLAR ... 109
ÖZGEÇMĐŞ ... 122
KISALTMALAR DĐZĐNĐ
AEF Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Herbaryumu ANK Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Herbaryumu
B5 Gamborg besin ortamı
BAP Benzil Amino Purin
CPPU N-(2-kloro-4-piridil)N'-fenil üre Dicamba 3,6-dikloro-o-anisik asit
GA3 Gibberellik Asit
GÜEF Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Herbaryumu
1H-NMR Proton Nükleer Manyetik Rezonans HPLC Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi HUB Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Herbaryumu HÜEF Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Herbaryumu
IAA Đndol-3- Asetik Asit
ĐTK Đnce Tabaka Kromatografisi
Kinetin 6-furfurilamino purin (N6-furfuriladenin)
LD50 Letal Doz
MS (M) Murashige ve Skoog besin ortamı
½ MS Makro ve mikro tuzları yarı yarıya azaltılmış MS ortamı
MS Kütle Spektrometresi
MY Murashige ve Skoog ortamında yaprak eksplantından kallus kültürü
NAA Naftalen-3 Asetik Asit
NaOCl Sodyum hipoklorit (Çamaşır suyu)
NMR Nükleer Manyetik Rezonans
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Ri Agrobacterium rhizogenes bakterisinin kök oluşumuna neden olan Ri plazmidi RT-PCR Ters Transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu
T-DNA Agrobacterium rhizogenes bakterinin tümör oluşturan Ri plazmidinin bitki hücresine aktardığı DNA parçası
TDZ N-fenil-N'-1,2,3 tiyadiazol-5-il üre
UV Ultraviyole
WPM (W) Woody Plant Medium besin ortamı Zeatin 6-(4-Hidroksi-3-metilbu-2-enilamino) purin
ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ
Şekil 2.1. a. Gentiana olivieri Griseb. (Afat) b. G. olivieri habitatı ... 8
Şekil 2.2 G. olivieri’nin Türkiye’deki yayılışı ... 9
Şekil 2.3. a. G. sinoornata, b. Gentian desenli tabak ve fincan, c. Đngiltere’de basılmış pul ... 11
Şekil 2.4. Başlıca flavonoit tipleri ... 14
Şekil 2.5. Flavonoit biyosentez yolu ... 14
Şekil 2.6. Gentianaceae’de en sık rastlanan flavonoitler ... 15
Şekil 2.7. Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin biyosentez yolu ... 17
Şekil 2.8. Gentianaceae familyasında en çok bulunan sekoiridoit glikozitler ... 17
Şekil 2.9. Bitki hücre kültürlerinden sekonder metabolit üretiminde hücre hattı seçimi ... 24
Şekil 3.1. Gaziantep’ten aktardan satın alınmış G. olivieri herbası ... 45
Şekil 3.2. a. Gentiana olivieri Griseb. tohumları, b. Ekilen tohumların petrideki durumu ... 55
Şekil 3.3. a. Ekilen kök, b. yaprak eksplantlarının petrideki konumları ... 56
Şekil 4.1. 60 gün inkübasyon sonunda çimlenen G. olivieri fideleri ... 63
Şekil 4.2. 1.alt kültür sonunda karanlık inkübasyonla kök eksplantından oluşan kalluslar ... 65
Şekil 4.3. 1.alt kültür sonunda karanlık inkübasyonla yaprak eksplantından oluşan kalluslar. ... 66
Şekil 4.4. 1.alt kültür sonunda aydınlık inkübasyonla yaprak eksplantından oluşan kalluslar. ... 67
Şekil 4.5. Karanlık inkübasyon yapılan kallus kültürlerinde yaprak (a) ve kök (b) eksplantlarına göre KBĐ değerlerindeki değişiklikleri gösteren grafikler ... 70
Şekil 4.6. Aydınlık inkübasyon yapılan kallus kültürlerinde yaprak eksplantına göre KBĐ değerlerindeki değişiklikleri gösteren grafikler ... 71
Şekil 4.7. Süspansiyon kültüründe gelişen hücreler ... 72
Şekil 4.8. Süspansiyon kültüründe 25 günlük inkübasyon süresince hücre ağırlıklarındaki değişimler ... 72
Şekil 4.9. Süspansiyon kültüründe 25 günlük inkübasyon süresince ortam miktarındaki değişimler ... 73
Şekil 4.10. Süspansiyon kültüründe 25 günlük inkübasyon süresince ortam pH’sındaki değişimler ... 73
Şekil 4.11. WY ve WK serisinde karanlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi I’de, %5’lik H2SO4’le görünümleri ... 76
Şekil 4.12. MY ve MK serisinde karanlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi I’de, %5’lik H2SO4’le görünümleri ... 77
Şekil 4.13. a. WY, WK ve b. MY, MK serilerinde karanlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi II’de, NA ile UV366’da görünümleri... 78
Şekil 4.14. a. WY ve b. MY serisinde aydınlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi II’de NA ile görünümleri... 80
Şekil 4.15. Süspansiyon kültüründe aydınlıkta inkübe edilerek ilk 25 günde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi II’de NA ile görünümleri... 81
Şekil 4.16. Đzoorientin’in a. program I’de ve b. program II’de verdiği pikler ... 82
Şekil 4.17. Đzoviteksin’in a. program I’de ve b. program II’de verdiği pikler ... 83
Şekil 4.18. G. olivieri ekstresinin a. program I’de ve b. program II’de verdiği pikler ... 84
Şekil 4.19. Program I’de: a. Gentiopikrozit, b. Svertiamarinin verdiği pikler ... 85
Şekil 4.20. Đzoorientin için elde edilen kalibrasyon grafiği ve doğru denklemi ... 86
Şekil 4.21. Đzoviteksin için elde edilen kalibrasyon grafiği ve doğru denklemi ... 86
Şekil 4.22. W1Y1 ortamında gelişen kallus hücrelerinde a. izoorientinin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ... 88
Şekil 4.23. W1Y3 ortamında gelişen kallus hücrelerinde a. izoorientinin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ... 89
Şekil 4.24. W2Y1 ortamında gelişen kallus hücrelerinde a. izoorientinin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ... 90
Şekil 4.25. a. W3Y1 ve b. W3Y2 ortamlarında gelişen kallus hücrelerinde izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ... 91
Şekil 4.26. W2S15 ortamında gelişen süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ... 92
Şekil 4.27. W2S20 ortamında gelişen süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ... 93
Şekil 4.28. W3S10 ortamında gelişen süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ... 94
Şekil 4.29. W3S15 ortamında gelişen süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ... 95 Şekil 4.30. W3S20 ortamında gelişen süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik
ve spektrumlarını gösteren kromatogram ... 96 Şekil 4.31. a. W1S5 ve b. W1S10 ortamlarında gelişen süspansiyon hücrelerinde izoviteksinin pik ve
spektrumlarını gösteren kromatogram ... 98 Şekil 4.32. a. W1S15, b. W1S20 ortamlarında gelişen süspansiyon hücrelerinde izoviteksinin pik ve
spektrumlarını gösteren kromatogram ... 99 Şekil 4.33. a. W2S5, b. W2S10 ortamlarında gelişen süspansiyon hücrelerinde izoviteksinin pik ve
spektrumlarını gösteren kromatogram ... 100
ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ
Çizelge 2.1. Bitki doku kültüründe en çok kullanılan temel besin ortamları ... 29
Çizelge 2.2. Araştırmacıların iridoit ve flavonoit yapılı bileşikleri HPLC ile kantitatif ... 32
olarak belirlemek için kullandıkları kolon, solvan sistemi ve dedektörün dalga boyu... 32
Çizelge 3.1. WPM ve MS ortamları için major tuz stok çözeltisi ... 47
Çizelge 3.2. WPM ve MS ortamları için minor tuz stok çözeltisi ... 47
Çizelge 3.3. MS ortamı için demir stok çözeltisi ... 48
Çizelge 3.4. WPM ve MS ortamları için minor tuz stok çözeltisi ... 48
Çizelge 3.5. Kallus ve süspansiyon kültürü için ortamlarda kullanılan büyüme düzenleyicileri ve konsantrasyonları ... 49
Çizelge 3.6. Đzoorientin ve izoviteksin standart maddelerinin kalibrasyonu için kullanılan konsantrasyonlar ... 62
Çizelge 4.1. Karanlık ve aydınlık inkübasyon ile üretilen kallusların kütle büyüme indeksleri-KBĐ ... 69
Çizelge 4.2. HPLC analizi sonucunda G. olivieri ile kallus ve süspansiyon hücrelerinde bulunan Io ve Iv standart maddelerin miktarları ve yüzdeleri... 97
1 . GĐRĐŞ
Türkiye Florası’nda kayıtlı 12 Gentiana L. (Gentianaceae) türünden birisi olan Gentiana olivieri Griseb., 10-30 cm. boyunda gövdeye sahip, çok yıllık, otsu bir bitkidir (Davis 1978). Ülkemizde Đç Anadolu, Orta Karadeniz, Doğu ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinde sınırlı alanlarda yetişen bu bitki Gaziantep civarında, halk arasında “Afat”
olarak bilinmektedir.
Gentianaceae’ye dahil birçok bitki, özellikle Uzak Doğu ülkelerinde eski zamanlardan beri halk arasında çeşitli hastalıkları tedavi etmek için kullanılmaktadır. Çin halk tıbbında G. macrophylla, G. tibetica, G. crassicaulis, G. dahurica’dan elde edilen preparatlar günümüzde de hazırlanıp pazarlanmaktadır. Bu preparatlar hepatit, konstipasyon (peklik), romatizma, ağrı, hipertansiyon ve mikrobiyal enfeksiyonların tedavisinde oldukça sık kullanılmaktadır (Tan vd. 1998). G. scabra kökleri ise ensefalitis B, iştahsızlık, mantar enfeksiyonu ve enflamasyonda kullanılmaktadır (Edis 2003, Yang 2001). Yurdumuzda doğal olarak yetişen G. lutea (sarı centiyan, centiyane)’nın iştah açıcı ve sindirime yardımcı etkisi bilinmektedir. Đçerdiği acı sekoiridoit glikozitlerden dolayı bu bitki, sinir uçlarını uyararak salgıları artırır ve iştahı açar. Antipiretik (ateş düşürücü) ve yara iyileştirici etkisinin yanında antianemik etkisinin olduğu da tespit edilmiştir (Edis 2003).
Gaziantep yöresinde G. olivieri’nin ise çiçekli toprak üstü kısımları kan şekerini düzenleyici (Başer vd. 1986, Aslan 2000), ateş düşürücü, iştah açıcı ve sakinleştirici olarak kullanılmaktadır (Baytop 1984, Ersöz ve Çalış 1991). Özbekistan’da da diyare, soğuk algınlığı, mide ağrısı tedavisinde ve yara iyileştirici olarak kullanıldığı bildirilmiştir (Honda 1999). Ayrıca alyuvar sayısını artırıcı özelliğinden dolayı kansızlık (anemi) tedavisinde de kullanılmaktadır (Başer vd. 1986). G. olivieri’nin sulu ekstresiyle yapılan bir çalışmada, sekoiridoit fraksiyonunun antikonvülsan ve antidepresan olduğu tespit edilmiştir (Ersöz ve Çalış 1991). Ayrıca G. olivieri’nin çiçekleri Pakistan’da “Bangero” olarak bilinmekte ve çeşitli medikal problemler için kullanılmaktadır (Edis 2003).
Gentiana türleri üzerinde yapılan çalışmalarla sekoiridoit, iridoit, flavonoit, terpenoit, ksanton, alkaloit gibi bileşiklerin bulunduğu belirlenmiştir (Ersöz 1988, Jensen ve Schripsema 2002). Ersöz (1988) yaptığı çalışmada G. olivieri’de ksantonların bulunmadığını buna karşın sekoiridoit glikozit olan triflorozit, sverozit, svertiamarin ve gentiopikrozitin; iridoit heteroziti olan loganik asitin; flavon C-heteroziti olan izoorientin ve orientin türevlerinin varlığını tespit etmiştir. Bu bileşiklerden bitkiye acı tadını veren iridoit ve sekoiridoitlerin iştah açıcı olduğu bilinmektedir. Ayrıca yüksek ateşi düşürmede, antikolinerjik ve antihepatotoksik olarak sıklıkla kullanılmaktadır (Şener ve Toker 1986, Bilaloğlu ve Harmandar 1999, Aslan 2000, Deliorman Orhan vd.
2003).
Günümüzde insan sağlığı açısından flavonoitlerin oldukça önemli olduğu yapılan çalışmalarda kanıtlanmıştır. Flavonoitlerin düz kaslar, gastrointestinal ve ürogenital sistem üzerinde spazmolitik aktiviteye sahip olduğu bunların yanında diüretik, antimutajenik, antitümoral, antimikrobiyal, antidepresan, antianemik ve östrajenik aktivitelerinin var olduğu belirlenmiştir (Şener ve Toker 1986, Bilaloğlu ve Harmandar 1999). G. oliveri’nin metanollü ekstresinin yüksek antidiyabetik aktivite gösterdiği tespit edilmiş, aktiviteden sorumlu olan maddenin bir flavon C- heteroziti olan izoorientin olduğu belirlenmiştir (Aslan 2000). Ayrıca Aktay vd. (2000)’nin yaptıkları çalışmada G. olivieri ekstraktının hepatoprotektif olduğunu kanıtlamışlardır.
Birçok Gentiana türü dünyanın çeşitli yerlerinde kesme ve saksı çiçeği olarak satılmaktadır. Gösterişli çiçeklere sahip olan bu bitkilerin soyları, süs bitkisi ve ilaç olarak doğadan aşırı toplanma nedeniyle, tükenme tehlikesiyle karşı karşıyadır. Bu nedenle de bazı Gentiana türlerinin birçok Avrupa ülkesinde doğadan toplanması ve satılması yasaklanmıştır. Ülkemizde de G. lutea, ihracatı yasaklanan 18 bitki türünden birisidir (http://www.tarim.gov.tr/mevzuat/teblig/dogal_ciceksoganlarinin_2006_yiliihracat_listesihakkinda_teblig.doc).
Ayrıca bu bitki Türkiye Bitkileri Kırmızı Kitabı’nda da EN kategorisindedir (Ekim vd.
2000).
Gentianaceae familyasına ait bitkilerde, bitki biyoteknolojisini kullanarak yapılan çalışma sayısı oldukça fazladır. Yapılan çalışmalar daha çok, nesli tehlike altında olan bu türlerin çoğaltılması üzerinedir. Momcilovic vd. (1997), G. lutea, G. cruciata, G.
purpurea ve G. acaulis’te, Morgan vd. (1997) G. cerina ve G. corymbifera’da kallustan;
Bach and Pawlowska (2003), G. pneumonanthe’de somatik embriyogenezle; Takahata and Jomori (1989), G. scabra’nın mezofil protoplastlarından protoplast kültürüyle;
Hosokawa vd. (1998), G. triflora X G. scabra hibridinde süspansiyon kültürüyle mikroçoğaltım çalışmalarını başarmışlardır.
Bitkide bulunan biyoaktif bileşiklerin araştırılmasıyla ilgili çok fazla sayıda çalışma vardır. Bu çalışmalarda, doğadan toplanan bitkiler çeşitli yöntemlerle ekstre edilip, standart maddeler varlığında karşılaştırmalı olarak kimyasal analizler yapılmış ve miktarları bulunmuştur. Arino vd. (1997) G. lutea köklerinden; Takeda vd. (1999) G.
olivieri’den; Liang vd. (2007) G. scabra’dan çeşitli sekonder metabolitleri izole edip, miktarlarını belirlemişlerdir. Bu tip çalışmalar sayesinde yeni biyoaktif sekonder metabolitler keşfedilmektedir.
Yapılan çalışmalardan birisi de bitki doku kültürü teknikleriyle biyoaktif bileşiklerin üretilmesidir. Bitkilerde sekonder metabolit olarak üretilen bu bileşikler kallus, hücre süspansiyon kültürleriyle ve geniş çapta biyoreaktörlerle üretilebilmektedir. Gentiana türleri için bu tip çalışmalar çok yaygın değildir fakat sekonder metabolitlerin öneminin anlaşılmasıyla günümüzde hız kazanmıştır. Bu yolla üretimi en çok yapılan grup iridoitlerdir. Hosokawa vd. (1998), süspansiyon kültüründe, Menkovic vd. (2000a) ve Tiwari vd. (2007) ise gen aktarılarak elde edilen saçak köklerde iridoitleri analiz etmişler ve sonuçlara göre doku kültürü yönteminin iridoit üretimi için avantajlı olduğunu vurgulamışlardır.
Đçerdiği sekonder metabolitlerden dolayı G. olivieri’nin ilaç sanayiinde kullanım potansiyeli yüksektir. Tıbbi bir bitki olması nedeniyle ekonomik öneme sahip olan bu bitki, Türkiye’nin ilaç sanayiine katkısı bakımından değerlendirilmesi gereken bir bitkidir. Yüksek lisans çalışmamızda biyoaktif sekonder metabolitler açısından zengin
olduğu bilinen G. olivieri bitkisinde doku kültürü ile kallus elde edilmiştir (Yağcı 2005). Bu çalışmada ise G. olivieri tohumları in vitro çimlendirildi; elde edilen bitkiciklerden eksplantlar alınarak farklı bitki büyüme düzenleyicileri içeren besin ortamları kullanıldı ve kallus dokusu üretildi. Devamında ise kallus veriminin artırılması, kalluslardan süspansiyon kültürleri kurulması ve bu yolla üretilen kallus ile süspansiyon kültürlerindeki bazı biyoaktif özellikteki sekonder metabolitlerin varlığının standart maddelerle karşılaştırılarak tespit edilmesi amaçlandı.
2 . KAYNAK ÖZETLERĐ
2.1 Gentianaceae Familyası ve G. olivieri ile Đlgili Sistematik Bilgiler
2.1.1 Gentianaceae familyası
Çoğu ılıman bölgelerde yetişen, genellikle tüysüz, bir veya çok yıllık otsu bitkilerdir.
Yaprakları tam, karşılıklı veya alternat dizilişli, sapsızdır. Çiçekler erdişi, aktinomorftur. Kaliks 4-5 parçalı, gamosepaldir. Korolla 4-5 parçalı, gamopetaldir.
Stamen sayısı petal adedi kadar ve korolla loplarının önündedir. Ovaryum üst durumlu, 2 karpelli, bir gözlü, çok ovüllü, plasentalanma paryetal-marginaldir. Stilus tek veya yoktur. Stigma genellikle 2 lopludur. Meyve 2 gözlü septisit kapsüldür. Dünyada hemen her bölgeye yayılmış 70 cins, 800 kadar türü; Türkiye’de ise 7 cinsi, 80’e yakın türü bulunmaktadır (Davis 1978).
2.1.2 Gentiana L. cinsi
Çok yıllık (nadiren tek yıllık) otsu, bazen az çok dallanmış ve yere yatık, bazen etli bir rizomdan çıkmış bir veya birkaç dal taşıyan bitkilerdir. Çiçekler 4-5 (-9)- parçalıdır.
Kaliks az çok derin parçalı, loplar kısmen bir iç zar ile birleşmiştir. Korolla fazla derin olmayan bir şekilden huni şekline kadar değişen biçimlerde; soluk ve menekşe-mavi, sarı veya krem rengindedir (nadiren beyaz). Genellikle ana loplar ile alternat durumda küçük loplar vardır. Korolla boğazı içte, tüysüzdür. Anterler bazifikstir. Ovaryum üste gittikçe incelen kısa bir stilus ile sonlanır veya stilus hiç yoktur. Stigma 2, kalıcıdır.
Ovaryum tabanında nektaryum bulunur. Meyve kapsül, eliptikten oblonga kadar değişen şekillerde, saplı veya sapsızdır (Davis 1978).
Gentiana cinsinin Türkiye Florası’nda kayıtlı 12 türü vardır:
G. lutea L., G. asclepiadea L., G. cruciata L., G. olivieri Griseb., G. aquatica L., G.
pyrenaica L., G. septemfida Pallas, G. boissieri Schott & Kotschy ex Boiss., G. gelida
2.1.3 Türkiye’de yayılış gösteren Gentiana türlerinin teşhis anahtarı (Davis 1978)
1. Taban yaprakları çok büyük (40x25 cm): korolla yarısından fazla bölünmüş, açık sarı...lutea
1. Taban yaprakları 15x3 cm (çoğunlukla daha küçük): korolla ½’ den daha az bölünmüş; beyaz, soluk sarı, mavi veya menekşe.
2. Dallar uzun, genellikle 30 cm’den uzun, çiçekler yaprakların koltuklarında.
3. Yapraklar akut, çiçekler 5 parçalı, anterler tabanda birleşmiş
...asclepideae 3. Yapraklar obtus, çiçekler 4 parçalı, anterler serbest
...cruciata 2. Dallar kısa, genellikle 30 cm’den daha kısa, çiçekler terminal veya terminal ve lateral.
4. Tek yıllık bitkiler.
5. Korolla soluk mavi, loplar obtus, meyve kapsula, saplı
...aquatica 5. Korolla parlak mavi, loplar akut, meyve kapsula, sapsız
...nivalis 4. Çok yıllık bitkiler.
6. Rizomun üst kısmı lifli bir kılıfla kaplı, gövde dik,10-40 cm ...olivieri
6. Rizomun üst kısmı lifli bir kılıfla kaplı değil, gövde genellikle yere yatık veya 10 cm’den kısa
7. Korolla soluk sarı...gelida 7. Korolla mavi (nadiren beyaz),
8. Çiçekler 3 veya daha fazla sayıda, terminal durumda; gövde basit bir yapıda...septemfida 8. Çiçekler genellikle tek tek; gövde basit veya dallı
9. Çiçekli gövde 11 veya daha fazla sayıda internodyuma sahip, gövde basit, yere yatık...boissieri
9. Çiçekli gövde 11’den az sayıda internodyuma sahip, gövde genellikle tabanda çok dallanmış.
10. Korollanın 2. lopları yaklaşık ana loplar kadar, korolla 10- parçalı;
internodyumlar hemen hemen eşit uzunlukta...pyreniaca 10. Đkincil loplar ufak, genellikle ana lopların yarısı kadar, nodusların arası çiçeklenmeden sonra açılır.
11. Rozet yaprakların en uzun olanları gövdedeki yapraklardan çok daha uzun, korolla 20-28 mm veya daha uzun...verna
11. Rozet yapraklar yaklaşık gövde yaprakları kadar, korollanın boyu 20 mm’den kısa...brachyphylla
2.1.4 Gentiana olivieri Grisebach
2.1.4.1 Sistematik bilgileri
Gentiana cinsine ait olan G. olivieri Griseb., Gentianaceae familyasındadır. Bu familya ise Asteridae subclasisine dahil olan Gentianales ordosunda bulunmaktadır (http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=GENTI).
2.1.4.2 Genel özellikleri ve habitatı
10-30 (-40) cm boyunda, 1-3 dik çiçekli gövdeli, yaprakları tabandaki rozetten çıkan, çok yıllık, otsu bir bitkidir. Rizomun üst kısmı tüylü bir koruyucu kılıf ile örtülmüştür.
Đnternodyum sayısı azdır, en yukarıdaki gövde yapraklarını geçer. Rozet yapraklar, 15 cm uzunlukta, oblanseolat, obtus veya subakuttur. Gövde üzerindeki yapraklar 6 cm’ye kadar, lanseolat, perfoliat ve gövdeyi bir kılıf gibi sarmış şekildedir. Çiçekler (-1) 3-10 arasında olup, terminal, 5 parçalıdır. Kaliks 12-15 mm, yarısına kadar bölünmüştür.
Korolla mavi, iç kısmı 20-30 mm, beyazımsı, 1/3’üne kadar bölünmüş, ikincil loplar birincil lopların yarısı kadardır. Meyve kapsül, stilusa doğru gittikçe incelir, kısa saplıdır. Çiçeklenme devresi Nisan-Temmuz ayları arasıdır ve kireçli topraklardaki çimenliklerde bulunur (şekil 2.1). 350-2300 m arasındaki yüksekliklerde yetişir (Davis 1978).
Şekil 2.1. a. Gentiana olivieri Griseb. (Afat) b. G. olivieri habitatı (Fotoğraf, Prof. Dr.
A. Selçuk Ertekin tarafından çekilmiştir)
2.1.4.3 Türkiye’deki yayılışı
Gentianaceae familyasının Gentiana cinsine dahil bir tür olan Gentiana olivieri Griseb.
Türkiye, Kuzey Irak, Đran (güneyi hariç), Afganistan, Orta Asya’da Tian Shan’a kadar yayılım gösteren bir bitkidir (Davis 1978). Türkiye’deki yayılış alanları:
A4: Çankırı: Ilgaz Dağı, 1800 m, W. Kotte (ANK 1934), Çankırı: Ilgaz Dağı, 1800 m (Davis 1978)
A6: Tokat: Almus- Niksar arası, 700 m (Davis 1978)
A9: Kars: Sarıkamış- Karakurt arası, sarıçam ormanı, Kelkit Deresi mevkii, 1800-1900 m, O. Güneş (HUB 1240)
B6: Sivas: Hafik- Zara arası, 1120 m (Davis 1978), Sivas: Zara-Đmranlı yolu, 5-8. km, yamaçlarda, 1400 m, M. Koyuncu (AEF)
B8: Erzurum: Erzurum-Aşkale arası, 1500 m (Davis 1978)
B9: Bitlis: Pelli, 2200 m (Davis 1978), Bitlis: 7 km güneyi, Seyitova Köyü çevresi, 1500 m, A. Engin (ANK 2707), Van: Tatvan- Sorgun, Van Gölü üstü, Quercus infectoria çalılığı, volkanik taban, 1650-1750 m, H. Peşmen (HUB)
C6: Gaziantep: Birecik yakınları (Davis 1978), Gaziantep: Nizip’ten 36 km, 600 m, Davis- Hedge (ANK 1957), Gaziantep: Kertüşe Köyü, T. Ersöz, Đ. Çalış (HÜEF 87- 1231), Gaziantep: Araban Yolu, 15. km, M. Aslan (GÜEF 99G001).
C7: Şanlıurfa: Şanlıurfa’nın 5 km batısı, 800 m (Davis 1978) C8: Siirt: Siirt’ten Eruh’a doğru, 500 m (Davis 1978)
C9: Mardin: Cizre’den 9 km ileride, 350 m (Davis 1978), Mardin: 19. km, kalker kayaları, 930 m, Huber-Morath (ANK 86)
C10: Hakkari: Sat Dağları, Yüksekova’dan Varagöz’e doğru, 2150 m (Davis 1978) (şekil 2.2).
Şekil 2.2 G. olivieri’nin Türkiye’deki yayılışı (Davis 1978) 2.1.4.4 Sinonim ve yerel isimleri
Gentiana regeliana Gandoger., G. weschniakowii Regel., Tretorhiza olivieri (Griseb.) Sojak. G. olivieri, Türkiye’de Gaziantep yöresinde “Afat”, Çin’de ise “xie wan que qin jiao” (http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=113422), Pakistan’da ise
“Bangero” ismi ile tanınmaktadır (Edis 2003).
2.2 Gentiana L.’nin Kullanım Alanları
Đçerdikleri flavon C-heterozitler ve sekoiridoit glikozitler nedeniyle Gentiana cinsi, halk tıbbında sıklıkla kullanılmaktadır. Gentiana cinsine ait türlerden bazıları Uzak Doğu başta olmak üzere birçok ülkede yüzyıllardan beri bilinmekte ve çeşitli bitkisel
preparatların içeriğinde bulunmaktadır. Çin halk tıbbında G. macrophylla kökleri ve diğer Gentiana türlerinden (G. tibetica, G. crassicaulis, G. dahurica) elde edilen ve
“Qinjiao (Chin-chiu)” olarak adlandırılan ilaç, hepatit, konstipasyon (peklik), romatizma, ağrı, hipertansiyon, fungal ve bakteriyal enfeksiyonların tedavisinde oldukça sık kullanılmaktadır (Tan vd. 1998). G. scabra kökleri de “Longdan (Long- Dan-Cao)” olarak bilinmekte ve geleneksel Çin ilacı olarak sıklıkla ensefalitis B, iştahsızlık, mantar enfeksiyonu ve inflamasyonda kullanılmaktadır (Edis 2003, Yang 2001).
Yurdumuzda halk arasında iştah açıcı ve sindirime yardımcı karışımların içeriğinde kullanılan ve aktarlarda satılan Gentian türü G. lutea (sarı centiyan, centiyane)’dır. Bu bitkinin sonbaharda toplanıp güneşte kurutulmuş kök ve rizomları, içerdiği acı sekoiridoit glikozitlerden dolayı halk tıbbında çok eskiden beri kullanılmaktadır. Bu acı ilaç, sinir uçlarını uyararak salgıları artırır ve iştahı açar. Eskiden ateş düşürücü olarak da kullanılmış, haricen yara iyileştirici olarak da kullanılmaktadır. Bunların yanında alyuvarları artırıcı etkisi olduğu da tespit edilmiştir (Edis 2003).
Gösterişli çiçeklere sahip olan Gentian’lar, tıbbi kullanımlarının dışında özellikle Uzakdoğu, Avrupa ve Amerika’da kesme ve saksı çiçeği olarak satılmaktadır. Ayrıca içeceklere acı aromanın verilmesinde kullanılmasının yanı sıra parfüm ve tonik gibi kozmetik malzemelerinin içinde de yer almaktadır. Çiçeklerinin güzelliği nedeniyle birçok şair ve yazar için ilham kaynağı olmuş, birçok kuruluşun isim ve logosunda kullanılmış ve birçok eşyaya da (pul, nakış işlemesi gibi) tema oluşturmuşlardır (http://gentian.rutgers.edu/ethno.htm) (Şekil 2.3).
Şekil 2.3. a. G. sinoornata, b. Gentian desenli tabak ve fincan, c. Đngiltere’de basılmış pul (http://alpineenthusiast.blogspot.com/,
http://www.gimex.de/www_site/produktgrafx/enzian_detail1.jpg, http://gentian.rutgers.edu/ethno_stamps.htm#GENTIANA%20stamps)
2.2.1 Gentiana olivieri’nin kullanım alanları
Türkiye’de Doğu ve Güneydoğu Anadolu’da “Afat” isimiyle bilinen G. olivieri’nin çiçekli toprak üstü kısımları halk arasında kan şekerini düzenleyici (Başer vd. 1986, Aslan 2000), ateş düşürücü, iştah açıcı ve sakinleştirici olarak kullanılmaktadır (Baytop 1984, Ersöz ve Çalış 1991). Özbekistan’da da diyare, soğuk algınlığı, mide ağrısı tedavisinde ve yara iyileştirici olarak kullanıldığı bildirilmektedir (Honda 1999). Ayrıca alyuvar sayısını artırıcı özelliğinden dolayı kansızlık (anemi) tedavisinde de kullanılmaktadır (Başer vd. 1986). G. olivieri’nin sulu ekstresiyle yapılan bir çalışmada, sekoiridoit fraksiyonunun anti konvülsan (kas gevşetici, sakinleştirici) ve antidepresan (sakinleştirici) olduğu tespit edilmiştir (Ersöz ve Çalış 1991).
Sekoiridoit glikozitlerin tümör nekrozis faktör üretimini inhibe ederek hepatite karşı koruyucu olduğu bilinmektedir. Ayrıca tatlarının acı olması nedeniyle sinir uçlarını uyararak mide salgısını artırırlar. Bu etkisinden dolayı sindirim güçlüğü, mide ekşimesi ve peklik tedavisinde kullanılır. Yani sekoiridoit glikozitler gastrointestinal sistemde sindirime yardımcı olan maddelerdir (Tan vd. 1998, Takeda vd. 1999).
2.3 Gentiana L.’de Bulunan Biyoaktif Özellikteki Bileşikler
Gentiana türlerinde major olarak bulunan iridoit ve sekoiridoit yapısındaki bileşiklerin bitkinin toprak altı (Arino vd. 1997, Carnat vd. 2005, Jiang vd. 2010), toprak üstü
kısımlarından (Ersöz ve Çalış 1991) veya tüm bitkiden (Takeda vd. 1999) izole edildiği bilinmektedir. Gentiana türlerinden en çok izole edilen sekoiridoit yapılı bileşikler gentiopikrozit, svertiamarin, sverozit ve bunların türevleridir.
Geçmiş yıllarda Gentiana türlerinde C-glikozil flavonların (flavon C-heterozitler) varlığı da yapılan birçok çalışmayla gösterilmiştir (Ersöz 1988, Kuo vd. 1996, Lin vd.
1997, Ko vd. 1998). Günümüzde yeni flavonoitler bulunmakta ve bunların biyoaktif özellikleri araştırılmaktadır (Sezik vd. 2005, Petrovic vd. 2008). Gentiana türlerinde flavonoit yapılı bileşikler çeşitlilik göstermektedir. Flavon C-heterozitlerinin yanında O- heterozitleri de bulunabilmektedir (Ersöz 1988). Bulunan bileşikler genellikle luteolinden türevlenen bileşiklerdir. Ersöz (1988) ve Aslan (2000)’ın yaptıkları tez çalışmalarında G. olivieri’deki flavonoitlerin izoorientin (homoorientin) ile izoviteksin ve bunların türevleri olduğunu bulmuşlardır.
Jensen ve Schripsema (2002) çalışmalarında iridoit ve sekoiridoitlerin familyada ortak bileşik olduğunu buna karşın ksantonların seksiyonlar arasında farklılıklar gösterdiğini bildirmişlerdir. Szücs vd. (2002) yaptıkları çalışmada bunu desteklemiş ve Pneumonanthe seksiyonuna dahil G. pneumonanthe ve G. asclepiadea ile Gentiana seksiyonunda olan G. lutea’da ksanton yapısındaki gentisin ve gentiozit izomerlerini tespit ederlerken, Cruciata seksiyonunda bulunan G. cruciata’da ksanton yapılı bileşiklere rastlamamışlardır. G. olivieri’de de ksanton bulunmadığı Ersöz (1988) tarafından belirtilmiştir.
Gentiana türlerinde yapılan çalışmalarda alkaloitlerin varlığı da gösterilmiştir (Samatov vd. 1967, Rakhmatullaev ve Yunusov 1972). Popov vd. (1988) ise yaptıkları çalışmada alkaloitlerin gentiopikrozit ve svertiamarinden oluştuğunu göstermişlerdir. Mansoor (1996) doktora tez çalışmasında G. olivieri’deki alkaloitleri izole etmiştir. Tezindeki yöntemle izole ettiği alkaloitlerin antibakteriyal ve antifungal aktiviteleri (Mansoor vd.
1999) ile antihipertansif etkisini araştırmıştır (Mansoor vd. 2004).
G. olivieri, major olarak iridoit, sekoiridoit glikozitleri ve flavonoitleri içerdiği için (Jensen ve Schripsema 2002, Edis 2003) bu tez çalışmasında bu gruplar üzerinde araştırma yapıldı.
2.3.1 Flavon C-heterozitler (C- Glikozil flavonoitler)
2.3.1.1 Flavon C-heterozitlerin genel özellikleri ve biyosentez yolları
Flavonoitler şikimat-asetat yolu ile fenilalaninden oluşan fenolik yapıda bileşiklerdir.
Fenilalanin, sinnamik asite ve daha sonra okside olarak p-kumarik asite dönüşür. p- kumarik asit, 3 asetat ünitesiyle kondensasyona uğrayarak A halkasını oluşturup, tetrahidrokalkona dönüşecek olan ilk ara ürünün oluşmasını sağlar. Diğer kapalı halka yapısı (C halkası) oluştuğunda bir flavonon olan naringenin meydana gelir. Bundan sonra flavonlar arasında değişik formlar oluşur; flavon (viteksin, izoviteksin, orientin, izoorientin); izoflavon (daidzein, genistein); flavonol (kemferol), dihidroflavonol (dihidrokemferol) (Crozier vd. 2000) (Şekil 2.4-2.5). Jensen ve Schripsema (2002) yaptıkları derlemede, Fujita ve Inoue (1979)’nun radyoaktif etiketleme yöntemi kullanarak izoviteksinin, içlerinde izoorientinin de bulunduğu flavonoitlerden bir grubun öncü maddesi olduğunu gösterdiklerinden bahsetmiştir.
Şekil 2.4. Başlıca flavonoit tipleri (Crozier vd. 2000)
Şekil 2.5. Flavonoit biyosentez yolu (Jensen ve Schripsema (2002)’den Türkçeleştirilerek alınmıştır)
Gentiana türlerinden çok sayıda flavonoit bileşiği izole edilmiştir. Bu bileşiklerden büyük bir kısmı flavon C-heteroziti yapısındadır (Ersöz 1988, Edis 2003). Bunlar, flavonoitlerin 6 veya 8. C atomuna veya her ikisine C-C bağı ile şeker bağlanması ile oluşur. Bu bileşiklere en fazla Leguminosae, Gramineae, Gentianaceae, Compositae ve Labitae familyalarında rastlanır. Flavon C-heterozitler, bitkinin kökü dışında bütün kısımlarında, yaprak, çiçek, gövde, kabuk, odununda ve genellikle uygun O-heterozitleri ile beraber bulunurlar (Edis 2003). Gentianaceae’de en sık rastlanan orientin, viteksin, izoorientin ve izoviteksinin formülleri şekil 2.6’daki gibidir.
Şekil 2.6. Gentianaceae’de en sık rastlanan flavonoitler
2.3.1.2 Flavon C-heterozitlerin biyolojik aktivite ve kullanım alanları
Flavonoitler, bitkilerde, özellikle çiçeklerdeki renklenmeyi sağlayan sekonder bileşiklerdir. Çeşitli flavonoitlerin polar oksin taşınmasını negatif yönde etkilediği, ayrıca Arabidopsis polenlerinde yapılan çalışmalarda polen çimlenmesini artırıcı etkiye sahip oldukları kanıtlanmıştır. Bunlara ek olarak flavonoitlerin mikroorganizma ve böcek saldırılarına karşı koruyucu etkiye sahip olduğu da belirtilmiştir. Genellikle yaprak, çiçek ve tomurcuklarında bulunan flavonoitlerin bitkide oksidasyon-redüksiyon olaylarına katıldığı ve büyümede rol oynadıkları bilinmektedir (Şener ve Toker 1986, Taylor ve Grotewold 2005).
Flavonoitlerin, süperoksit ve hidroksil radikallerini ortadan kaldırarak antioksidan etki gösterdiği bilinmektedir. Flavonoitlerin düz kaslar, gastrointestinal ve ürogenital sistem üzerinde spazmolitik aktiviteye sahip olduğu, aynı zamanda damar genişletici etkileri nedeniyle de kardiyovasküler sistem üzerinde etkili oldukları bildirilmiştir.
Flavonoitlerin antibakteriyal, antitümoral, antiviral; izoflavonoitlerin ise fitoöstrojenik aktivitelerinin olduğu bildirilmiştir (Şener ve Toker 1986, Bilaloğlu ve Harmandar 1999).
Flavonoitlerin epinefrin metabolizması üzerine etki ettiği ve C vitamininin etkisini uzatarak kapiller çeperinin direncini artırdığı ve permeabiliteyi azalttığı da bulunmuştur.
Flavonoitlerin diüretik etkiye sahip olduğu uzun yıllardır bilinmekte ve bu etkinin permeabiliteyi azaltmak suretiyle olduğu ileri sürülmektedir (Şener ve Toker 1986).
2.3.2 Đridoit ve sekoiridoit glikozitler
2.3.2.1 Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin genel özellikleri ve biyosentez yolları
Siklopentanoid monoterpen türevi olan ve mevalonik asitten (MVA) bir dizi biyosentetik mekanizma ile oluşan iridoitler; iridoit glikozitler, basit iridoitler (non- glikozidik iridoitler), sekoiridoitler ve bisiridoitler olarak dört gruba ayrılabilir (Bianco 1994, Jensen ve Schripsema 2002) (Şekil 2.7). Đridoitlerin yapısındaki siklopentan halkanın bozulmasıyla sekoiridoitler, piran halkasının bozulmasıyla iridoit türevleri oluşur (Dinda vd. 2007). Đridoitler bitkilerde genellikle suda çözünebilen glikozitler şeklinde bulunur. Bu familya için karbosiklik iridoitlerin neredeyse tümü sekoiridiotlerin öncü molekülü loganinden türevlenmiştir.
Iridomirmex cinsi karıncaların savunma mekanizmalarında yer alan iridoidal, iridomirmesin gibi bileşiklerin izolasyonu ile isim kazanmıştır. Đridoitler, böcekler dışında bitkiler aleminde Angiospermlerde tespit edilmiştir. Angiospermlere dahil her türlü bitkide bulunabilen yaygın bileşiklerdendir (Seigler 1999). Gentianaceae familyasında en çok bulunan sekoiridoit glikozitler; gentiopikrozit, svertiamarin ve sverozittir (Ersöz 1988, Jensen ve Schripsema 2002), (Şekil 2.8).
Şekil 2.7. Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin biyosentez yolu (MVA-Mevalonik asit) (Jensen ve Schripsema (2002)’den Türkçeleştirilerek alınmıştır)
Şekil 2.8. Gentianaceae familyasında en çok bulunan sekoiridoit glikozitler
2.3.2.2 Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin biyolojik aktivite ve kullanım alanları
Gentianaceae familyasındaki bitkiler içerdikleri iridoit ve sekoiridoit yapısındaki bileşikler nedeniyle “acı” olarak bilinmektedirler. Acı tadlarından dolayı tükrük ve mide salgıları başta olmak üzere vücuttaki salgıları artırırlar. Bu nedenle özellikle Uzakdoğu ülkelerinde toniklerin içine katılarak iştah açıcı, mide rahatsızlıklarını giderici ve konstipasyon (peklik) tedavisine yardımcı olarak kullanılırlar (Tan vd. 1998, Jensen ve Schripsema 2002). Đridoidal bileşikler acı içeceklerin yapımında da kullanılmaktadırlar (Carnat vd. 2005). Yine acı tadlarından dolayı, doğada birçok canlının, bitkiyi yiyememesi nedeniyle antifidant (normal yeme davranışını engelleyen) etkiye de sahiplerdir (Seigler 1999).
Tundis vd. (2008) yaptıkları mini-derlemede, iridoit ve sekoiridoit yapısındaki bileşiklerin serbest radikallerin oluşumunu inhibe ederek nöroprotektif ve antioksidan etkiye sahip olduklarını belirtmişler; antikanser, anti-enflamatuvar1, kardiyovasküler2, antihepatotoksik3, koleretik4, hipoglisemik, hipolipidemik, antispasmodik (spazmolitik)5, antiviral, antimikrobiyal, immünomodulatör, antialerjik, anti-lejmanyal6 ve mollussisidal7 özellikleri olduğuna dair yapılan çalışmaları irdelemişlerdir.
2.4 Doku Kültürü ile Đlgili Genel Bilgiler
Bitki doku kültürü, apikal meristem ve mezofil gibi dokuların; kök, gövde ve yaprak gibi organların; meristematik hücreler, kallus hücreleri gibi hücre ve hücre kısımlarının bitkiden ayrılarak steril koşullarda (aseptik) yapay besin ortamları üstünde in vitro olarak yetiştirilmesi ve bunlardan oluşan değişime açık hücre ve dokulardan (kallus)
1 Enflamasyon yani iltihaplanmayı azaltarak ağrıyı azaltıcı yapıdaki maddeler
2 Kan dolaşımını kolaylaştırıcı etkiye sahip olan maddeler
3 Karaciğerde toksik etki yaratabilecek maddeleri önleyen maddeler
4 Safra uyarıcı maddeler
5 Spazm baskılayıcı maddeler
6 Lejyoner hastalığını önleyici maddeler
7 Mollusk (deniz omurgasızları) öldüren ajanlar
yeni bitkilerin yani klonların ya da bitkisel ürünlerin (primer ve sekonder metabolitler) elde edilmesidir.
Bitki doku kültürü çalışmalarında bitkiden ayrılarak ortama koyulan parçaya eksplant denir. Eksplant, küçük bir bitki olabileceği gibi organ, embriyo, tek hücre ve hatta çeperi kaldırılmış hücre (çıplak hücre, protoplast) kadar küçük olabilir. Önemli olan eksplanttaki hücrelerde totipotensi yeteneğinin bulunmasıdır. Totipotensi ise zigotta görülen ve mitoz bölünmelerle somatik hücrelere geçen tam bir bitki oluşturma özelliğidir.
2.4.1 Bitki doku kültürünün uygulama alanları
Bitki doku kültürü, bitki biyoteknolojisi ve bitki genetik mühendisliğinde kullanılan temel araştırma metotları arasında yer alır (Kyte 1987, Babaoğlu vd. 2001). Bitki doku ve hücre kültürünün bitki ıslahında, (türler arası melezlemelerden sonra) embriyo kültürü, haploid bitki üretiminde anter (polen) ve yumurtalık (ovül) kültürü, somaklonal varyasyon, in vitro seleksiyon, in vitro döllenme, in vitro germplazm muhafazası, somatik hücre melezlemesi (protoplast füzyonu), gen transferi gibi uygulama alanları vardır. Bitki ıslahı dışında ise hastalıksız bitki elde edilmesinde meristem kültürü, mikroçoğaltım, sentetik tohum üretimi (somatik embriyolar), sekonder metabolit üretimi (kallus-hücre süspansiyonları) gibi alanlarda uygulanmaktadır (Babaoğlu vd.
2001).
Günümüzde küresel ısınma nedeniyle toprak veriminin azalması ve dünya nüfusunun hızla çoğalması nedeniyle başta tahıllar olmak üzere sebze ve meyve yetiştirmek için tarım alanlarının kısıtlı olması, bilim insanlarını sorunu çözme yolunda araştırma yapmaya teşvik etmiştir. Tarımsal sorunların çözülmesi için mikroçoğaltım, gen aktarımı ile bitkilere çeşitli özellikler (kuraklığa, pestisitlerde dayanıklı veya vitamin içeriği zenginleştirilmiş tahıllar vb.) kazandırarak verimi artırmak gibi biyoteknolojik yollar kullanılması çözüm yolunda atılan değerli adımlar arasındadır.
Tıbbi ve aromatik bitkilerin ilaç ve kozmetik sanayinde kullanımı da çok yaygındır.
Tıbbi bitkilerin ilaç sanayinde hammadde olarak kullanılması bu bitkilerin doğadan aşırı miktarda toplanmasına neden olmakta ve türlerin nesilleri tehlike altına girebilmektedir.
Bilim insanları bu soruna da biyoteknolojik yöntemlerle çözüm önerileri sunmuş ve başarılı uygulamalarla ilaç etken maddesi olan sekonder metabolitler bitki doku veya hücrelerine adeta bir fabrika gibi ürettirilmiştir (Zenk vd. 1977, Curtin vd. 1983).
2.4.2 Bitki doku kültürü yöntemleri
Bitki biyoteknolojisinde genel bir terim olarak kullanılan doku ve hücre kültürü aslında birbirine bağlı birçok yöntemi kapsar. Kullanılacak yöntemler denemenin amacına göre değişir. Mikroçoğaltımda, doğrudan eksplanttan rejenerasyonla bitki çoğaltılabilirken, dolaylı yolla, önce kallus oluşturulur bundan da organogenez ve somatik embriyogeneze yönelerek de bitki elde edilebilir. En çok kullanılan kültür yöntemlerine aşağıda kısaca değinilmiştir:
2.4.2.1 Kallus kültürü
Kök, gövde, apikal meristem, kotiledon, yaprak gibi organlardan alınan küçük parçaların (eksplant), kallus (bitki yara dokusu) oluşturmak için besin ortamlarına ekilmesiyle yapılan yöntemdir. Kallus oluşumu inkübasyon süresine, ortam sıcaklığına, fotoperiyoda, bitkinin kallus oluşturabilme yeteneğine göre değişir. Elde edilen kalluslardan sekonder metabolit üretimi, süspansiyon kültürü, protoplast kültürü ve füzyonu, mikroçoğaltım yapılabilir (Yağcı vd. 2008).
2.4.2.2 Süspansiyon kültürü
Üretilen kalluslar sıvı besin ortamına ekilip çalkalamalı inkübasyon yapılırsa süspansiyon kültürü kurulmuş olur. Hücreler sıvı ortamda serbest şekilde gelişir. Bu yöntem özellikle ekstrasellüler bileşiklerin üretiminde kullanılır. Đstenen madde
ekstraselüler değilse üreyen ve inkübasyon sonunda gelişen hücreler mekanik, kimyasal veya enzimatik olarak parçalanır ve madde elde edilir (Yağcı vd. 2008).
2.4.2.3 Organ kültürü
Üretilen kalluslardan veya doğrudan alınan eksplant üzerinden organ oluşturmaya yönelik yöntemdir. Organ kültürüyle sadece istenen organın gelişmesi sağlanabilir örneğin köksüz bitkicik veya sadece kök oluşumu gibi. Ayrıca bu kültür tipi organa özel sekonder metabolitlerin üretiminde oldukça avantajlıdır (Yağcı vd. 2008).
2.4.2.4 Somatik embriyogenez
Embriyo gelişiminin somatik hücrelerle gerçekleştirilmesidir. Bu yöntemde besin ortamına büyüme düzenleyiciler eklenerek kalluslarda embriyo oluşumu sağlanır. Bu yöntem özellikle bitki çoğaltımında kullanılır. Günümüzde birçok bitkide sentetik tohum yapımında somatik embriyogenez yöntemi kullanılmaktadır (Yağcı vd. 2008).
2.4.2.5 Mikroçoğaltım
Bu yöntem kalluslardan (dolaylı organogenez) veya eksplant üzerinden (doğrudan organogenez) organ gelişimini sağlar. Bu yöntemde temel, totipotensi özellikleri kullanılarak hücrelerin bitki oluşturmaya teşvik edilmesidir. Bu hücrelerin orijinleri küçük bir eksplanttır ve bu eksplant çeşitli büyüme düzenleyicilerle organ oluşturmaya yönlendirilirler. Sonuçta tek bir hücreden bir bitkicik oluşur. Dolayısıyla teorik olarak eksplant üzerindeki totipotent hücre sayısı kadar bitki elde edilecektir. Gerçek şartlarda başarı beklenen kadar olmasa da küçük bir yaprak parçasından veya yaprak sapından alınan bir parçadan çok sayıda bitki elde edilmektedir (Yağcı vd. 2008).
2.4.2.6 Transgenik bitki üretimi
Tür içi, türler arası ve organizmalar arası gen aktarımı anlamına gelen transgenik kavramı, bitkilerde elit türler elde etmek, pestisitlere direnç sağlamak, verimi artırmak, besin içeriğini zenginleştirmek ve temel araştırmalara ışık tutmak için yapılan bir işlemdir. Günümüzde biyoteknoloji alanındaki hızlı gelişme sayesinde transgenik bitki elde etmenin birçok yolu vardır. Bunlardan en çok kullanılanları dikotil bitkilerde Agrobacterium tumefaciens ve A. rhizogenes, çeşitli virus ve fajlar gibi biyolojik ajanlar yoluyla; mikroenjeksiyon, mikroprojektil bombardıman ve elektroporasyon gibi fiziksel yollarla gen aktarımıdır (Yağcı vd. 2008).
2.4.3 Bitki doku ve hücre kültürü teknikleri kullanılarak sekonder metabolit üretiminin ticari önemi, avantaj ve dezavantajları
Bitki doku kültürü yöntemleri ile sekonder metabolit üretiminin avantajları şunlardır (Ramachandra-Rao ve Ravishankar 2002, Razdan 2003, Lila 2005, Yağcı vd. 2008):
1. Üretim daha güvenilir, basit ve tahmin edilebilirdir.
2. Normalde ana bitkide bulunmayan bileşiklerin üretilebilmesine olanak sağlar.
3. Politik, coğrafik ve mevsimsel engellerden bağımsız üretim yapılabilir.
4. Karmaşık bitki ekstraksiyonlarıyla karşılaştırıldığında fitokimyasalların izolasyonu daha çabuk ve etkili yapılabilir.
5. In vitro olarak üretilen bileşikler tüm bitkideki bileşikler ile doğrudan paraleldir.
6. Tarlada yetişen bitkide istenmeyen bileşikler hücre kültüründe elimine edilebilir.
7. Hücre kültürleriyle bitkinin kendisinden elde edilen fitokimyasalların miktarı karşılaştırıldığında hücre kültürlerinden çok daha fazla miktarda ürün elde edilebilir hatta üretim endüstriyel boyuta taşınabilir.
8. Hücre kültürleri deney kurmak için mükemmel bir modeldir.
9. Hücre kültüründe genetik uygulamalara yönelik işaretlemeler ve değişimler yapılabilir.
10. Temel araştırmalara (örneğin metabolik ve biyokimyasal yolların anlaşılmasında) yol gösterici tayinler yapılabilir.
11. Ucuz öncü moleküller kullanılarak, yeni bileşiklerin tekli veya çoklu enzim sistemleriyle biyotransformasyonu gerçekleştirilebilir.
Sekonder metabolit üretiminde stabil olmayan hücre hatları, düşük verim, yavaş gelişme ve üretimi artırmada yaşanan sorunlar gibi geliştirilmesi gereken konular vardır (Ramachandra-Rao ve Ravishankar 2002).
2.4.4 Bitki Doku Kültürlerinde Sekonder Metabolit Üretimini Artırmak Đçin Stratejiler
2.4.4.1 Üretici gücü yüksek hücre hatlarının taranması ve seçilmesi
Hücre hattı geliştirmek, istenen ürünün yüksek miktarda elde edilebildiği ana bitkinin seçimiyle, kallus artırma ile ve yüksek verimli hücrelerin gözlenmesiyle başlar. Sonra karışık populasyon arasından istenen ürünü en çok üreten hücre hatları taranır ve bu hücrelerle çalışılır. Genetik yapıdan kaynaklanan çeşitlilik, yüksek verimli hücrelerin var olmasını sağlayabilir. Eğer istenen ürün pigment içeriyorsa seçim kolaylıkla yapılabilir. Örneğin Lithospermum erythrorhizon kültüründe şikonin üretiminde, taranan hücrelerden kırmızı renklilerin seçilmesiyle 13-20 kat fazla verim alınmıştır (Fujita vd. 1984, Yağcı vd. 2008) (Şekil 2.9).
Şekil 2.9. Bitki hücre kültürlerinden sekonder metabolit üretiminde hücre hattı seçimi (Bourgaud vd. 2001)
2.4.4.2 Ortam miktarlarının ve bileşenlerinin değiştirilmesi
Birçok sekonder metabolitin oluşumu besin ortamındaki maddelerin miktarı, stres faktörleri, ışık ve büyüme düzenleyicileri gibi dış faktörlerden kolaylıkla etkilenebilmektedir (Yağcı vd. 2008).
2.4.4.2.1 Şeker miktarı
Bitki hücre kültürleri genellikle heterotrofik olarak, karbonu basit şekerlerden (sakaroz), inorganik maddeleri de diğer bileşenlerden karşılayarak gelişirler. Sakaroz seviyesi sekonder metabolit birikimi yapan kültürlerin üretkenliklerini etkilemektedir. Aralia cordata hücre süspansiyonunda %5 sakaroz ile antosiyanin üretimi düşmüş, %3’te ise artmıştır (Sakamoto vd. 1993).
