Gentiana türleri ile yapılan doku kültürü çalışmaları

Bu kısımda Gentiana türlerinde yapılan protoplast kültürü, mikroçoğaltım, rejenerasyon, somatik embriyogenez teknikleriyle çoğaltma çalışmalarına yer verilmiştir. Ayrıca doku kültürü yöntemleri kullanılarak yapılan genetik ve histolojik araştırmalara da değinilmiştir.

Takahata ve Jomori (1989), G. scabra’nın mezofil protoplastlarından bitkicik geliştirmişlerdir. Protoplastlar, in vitro çoğaltılmış G. scabra yapraklarından enzimatik yollarla izole edilmiştir. Hücre bölünmesi, modifiye edilmiş MS veya B5 sıvı kültürde 4-5 günden sonra başlamıştır ve 6-8 hafta sonra küçük kalluslar taze ortama aktarılmıştır. Sürgünler 1.0 mg/l IAA ve 6.0 mg/l BA içeren MS katı ortamında, protoplast kaynaklı kalluslardan farklılaşmıştır. Bitkicikler hormon içermeyen MS ortamında köklendirilmişlerdir.

Momcilovic vd. (1997), G. lutea, G. cruciata, G. purpurea ve G. acaulis ile yaptıkları çalışmada, mikroçoğaltımı hedeflemişlerdir. 4 türün tohumları in vitro olarak çimlendirilmiş ve oluşan fideler eksplant kaynağı olarak kullanılmıştır. G. lutea, G.

purpurea ve G. acaulis tohumları 0.2 mM (0,069 g/l) GA3 içeren MS ortamına, G.

cruciata’nın tohumları ise 10 mM (1,01 g/l) KNO3 içeren MS ortamına ekilmiştir.

Çimlenmeden 30 gün sonra 2-3 internod geliştiren bitkilerden eksplantlar alınmıştır.

Sürgün oluşumu ve çoğaltım için G. cruciata ve G. lutea’da MS; G. acaulis ve G.

purpurea’da ise sadece makro tuzları WPM’dan oluşan MS ortamı kullanılmıştır.

Sürgün oluşumunu uyarmak amacıyla IAA ve BAP çeşitli konsantrasyonlarda kullanılmıştır. 0.2 mg/l IAA varlığında BAP konsantrasyonunun artırılmasıyla sürgün oluşumunun arttığı gözlenmiştir. Dört bitkide de 0.2 mg/l IAA ve 4 mg/l BAP’ın en çok sürgün verdiği belirlenmiştir. Bunun yanında 2 mg/l BAP varlığında değişik IAA konsantrasyonları denendiğinde sürgün sayısının bitkilerde değişik sonuçlar verdiği görülmüştür. Köklendirme için NAA’in değişik konsantrasyonları [0.67- 10.74 µM (0,12- 2 mg/l)] denenmiş ve ilk adventif kök oluşumu 14. günde gerçekleşmiştir.

Köklenen bitkicikler hormonsuz MS ve WPM’ye aktarılmıştır. Yalnız G. cruciata’nın kök gelişimine NAA’lı ortamda devam edilmiştir.

Morgan vd. (1997) ise G. cerina ve G. corymbifera’nın in vitro çoğaltımı üzerine bir çalışma yapmışlardır. G. corymbifera’nın tohumları 100 mg/l GA3 içeren MS ortamında çimlendirilmiş ve 70 gün sonra % 54 çimlenme gözlenmiştir. Seradan toplanan G.

cerina ve in vitro çimlendirilen G. corymbifera fidelerinden alınan sürgünler, BAP içeren MS ortamlarında çoğaltılmıştır. G. cerina için 0.05 ve 0.5 mg/l BAP konsantrasyonları arasında sürgün çoğalma oranında önemli bir fark gözlenmemiştir. En yüksek sürgün çoğalması, G. corymbifera’da 0.2 mg/l BAP’da olmuştur. Ortama 1 mg/l GA3 eklenmesi, çoğalmanın artmasına neden olmuştur. En iyi uygulama G. cerina için 50 gün sonra sürgün oluşumunu 7 kat artırırken G. corymbifera için artış 3 kattan fazla olmuştur. Kök oluşumu IBA ile MS ortamında gerçekleştirilmiştir. Sonuçta 0.3 mg/l IBA her iki türde de kök oluşumu için tavsiye edilmiştir.

Hosokawa vd. (2000) partikül bombardımanı tekniğiyle transgenik bitkiler elde etmek

yapmışlardır. Bu çalışmada, bir partikül tabancası kullanılarak Caulimovirüs (CaMV) 35S promotoruna bağlanan β-Glukuronidaz geni, süspansiyon kültür hücrelerine aktarılmıştır. Transformasyona uğradığı düşünülen hücreler önce 30 mg/l higromisin, 10 mg/l N-fenil-N'-1,2,3 tiyadiazol-5-il üre (TDZ), 1 mg/l NAA ve 30 g/l sakaroz içeren sıvı ortamda geliştirilmiştir. Sonra içeriği aynı ortama, 2 g/l jellan gum katılmış ve katı ortam elde edilmiştir. 12 hafta sonra bu ortamdaki higromisine dirençli olan yani β-Glukuronidaz genini alan hücrelerden gelişen kalluslar seçilmiştir. Seçilen kallusların analizi PCR ve Southern blotting teknikleri kullanılarak yapılmış ve β-Glukuronidaz genini aldıkları tespit edilmiştir.

Pawlowska ve Bach (2003) nesli tükenme tehlikesi altında olduğundan korunmakta olan G. pneumonanthe’nin, süs bitkisi olarak mikroçoğaltımı üzerine bir çalışma yapmışlardır. Bunun için olgun ve olgun olmayan tohumlar in vitro çimlendirilmiş daha sonra elde edilen fidelerden sürgün uçları ile bir nod içeren fideler eksplant olarak kullanılmıştır. BAP, kinetin, TDZ ve 2iP olmak üzere dört sitokinin ile IAA ve GA3

kullanılmıştır. En yüksek çoğalma bir nodlu fideden 10 µM BAP içeren ortamda elde edilmiştir. Aksillar sürgünler 0.5 ve 1 µM IAA, NAA ve IBA içeren ortamlarda köklendirilmiş ve en iyi etki IAA’da görülmüştür. Köklenme, hormon içermeyen ortamlarda da gözlenmiştir. Köklendirilmiş bitkicikler, %65 hayatta kalma oranıyla toprağa geçirilmiş ve serada akklimatize edildikten sonra dış ve iç mekan koşullarında geliştirilmiştir. Klon bitkilerin çiçek ve gövde sayısının doğal ortamda yaşayan bitkilere göre daha fazla olduğu gözlenmiştir.

Bach ve Pawlowska (2003), G. pneumonanthe’de somatik embriyogenezi gerçekleştirmişlerdir. Bir önceki çalışmalarında (Pawlowska ve Bach 2003) elde edilen in vitro rejenere olmuş bitkilerin yaprak ve apikal meristemlerinden alınan eksplantlar kullanılmıştır. Kallus oluşumu için BAP ve Pikloram veya 2,4 D içeren ½ MS ortamı kullanılmıştır. 3-4 hafta sonra kültürlerde ilk somatik proembriyolar elde edilmiştir. En çok embriyojenik kallus 2,4 D içeren ve karanlıkta inkübe edilenlerde olmuştur.

Embriyolar, oksin miktarı azaltılan ortamlarda olgunlaşmış ve hormon içermeyen ortamda çimlendirilmiştir. Kallus ve somatik embriyolardan elde edilen bitkilerin

sitometrik analizleri, DNA içeriklerinin ana bitkiden farklı olduğunu göstermiştir. Fakat akklimatize olan bitkilerin, verici (ana) bitkidekiyle aynı miktarda DNA içerdikleri tespit edilmiştir.

Butiuc-Keul vd. (2005) G. punctata’nın in vitro organogenezi için ½ MS ortamında in vitro çimlenen fidelerden alınan eksplantları kombineli şekilde 2iP, zeatin, IBA ve mısır ekstresi içeren MS ortamına aktarmışlardır. 2iP, zeatin ve IBA içeren ortamlarda çoğalma az olmuştur. Bitki çoğalması ortama mısır ekstresinin eklenmesiyle az miktarda da olsa artmıştır. Rizogenez (kök oluşumu) sadece 1 mg/l NAA, 1 mg/l 2iP ve 1 mg/l mısır ekstresi içeren ortamda gözlenmemiştir. Đn vitro bitkicikler kültürün 6.

haftasından sonra toprağa alınmışlar ve akklimatize edilmişlerdir.

Takashi vd. (2005) G. scabra’nın çiçek renginin kendiliğinden mutasyona uğrayarak pembeden eflatuna dönüştüğünü moleküler araştırmalarla kanıtlamışlardır. Mutasyonun delfinidin adlı antosiyanin türevinin oluşumunu sağlayan flavonon 3′,5′-hidroksilaz (F3′5′H) adlı enzimde olduğunu kanıtlamışlardır. Flavonon 3′,5′-hidroksilaz (F3′5′H) enziminin genine yerleştirilen iki farklı transpozon elementiyle bu enzimin aktivasyonu bozulmuş ve bu yolun katalizlenmesi önlenmiştir. Sonuç olarak delfinidinin üretilmediği, buna karşılık pembe rengi veren siyanidinin üretildiği gösterilmiştir.

Fiuk ve Rybczynski (2008), G. cruciata, G. kurroo, G. lutea, G. pannonica ve G.

tibetica’nın embriyojenik potansiyellerini belirlemek amacıyla bir çalışma yapmışlardır.

Bu bitkilerin tohumları önceklikle 0.5 mg/l GA3 içeren MS ortamında in vitro çimlendirilmiş daha sonra ise sürgün oluşumunu uyarmak amacıyla fideler, 2.0 mg/l BAP ve 0.2 mg/l NAA içeren MS ortamına aktarılmışlardır. Buradan elde edilen sürgün eksplantları, bitki büyüme düzenleyici içermeyen ortama aktarılarak aksenik sürgün kültürü yapılmıştır. Daha sonra aksenik sürgünlerden gelişen yapraklardan alınan eksplantlar, NAA, 2,4-D ve dicamba olmak üzere üç oksinin ve zeatin, kinetin, TDZ, N-(2-kloro-4-piridil)N'-fenil üre (CPPU) ve BAP olmak üzere beş sitokinin varlığında kültüre alınmıştır. Đki aylık kültür sonunda en yüksek embriyogenez frekansı G.

kurroo’da bulunmuştur (%54.7). Bu bitki, uygulanan tüm büyüme düzenleyicilerini

içeren ortamlarda morfojenik kapasite göstermiş, buna karşılık G. lutea’da hiçbir uygulamada somatik embriyo oluşumu gözlenmemiştir. Somatik embriyo oluşumu eksplant başına ortalama G. tibetica ve G. cruciata’da 6.6, G. pannonica’da 15.7, G.

kurroo’da 14.2 olarak bulunmuştur. Optimum rejenerasyon NAA’nın BAP veya TDZ ile kombinasyonunda başarılı olmuştur. NAA rizogenezi de çok miktarda artırmıştır.

Ayrıca G. kurroo, G. cruciata ve G. pannonica adventif köklerinden somatik embriyolar elde edilmiştir. Somatic embriyolar ½ MS ortamında bitkiciğe dönüştürülmüştür.

2.5.3.2 Gentiana türlerinde ve Gentianaceae familyasına dahil bitkilerde yapılan