Bitkilerin doğal yaşamlarını engellemeden tıbbi amaçlı kullanılmalarını sağlayacak alternatif bir yöntem geliştirme çabasında olan bilim insanları doku kültürü tekniklerini kullanarak Bitki Biyoteknolojisi adında yeni bir bilim dalı yaratmıştır. Amaca göre değişen tekniklerle çok az bitkisel materyal kullanılarak endüstriyel boyutlara varabilen üretimler gerçekleştirilebilmektedir (Ramachandra Rao ve Ravishankar 2002). Fakat üretim aşamasına geçilmeden model olabilecek araştırılmalar yapılması gerekmektedir.
Öncelikle bitkinin doku kültürü tekniklerine cevap verip vermediği belirlenmeli daha sonra verimi artırmaya yönelik çalışmalar yapılmalıdır. En son aşamada ise optimizasyon tam olarak sağlanıp aşamalı olarak biyoreaktörlerde üretime geçilmelidir.
Çalışmamız bu amaca yöneliktir.
Gentiana cinsine ait birçok türde mikroçoğaltım (Morgan vd. 1997, Zhang ve Leung 2002, Bach ve Pawlowska 2003), protoplast kültürü (Takahata ve Jomori 1989), somatik embriyogenez (Bach ve Pawlowska 2003), hücre süspansiyon kültürü (Chueh vd. (2000) çalışmaları bulunmaktadır. Sekonder metabolit üretimi ile ilgili çalışmalar iridoitler üzerine yoğunlaşmıştır (Chueh vd. 2000, Menkovic vd. 2000a, Devic vd.
2006, Cai vd. 2009). Yapılan literatür taraması sonucunda G. olivieri ile ilgili yapılan tek doku kültürü çalışmasının Yüksek Lisans tezi olduğu görülmüştür (Yağcı 2005). Bu çalışmada, in vitro çimlendirilmiş G. olivieri fidelerinden alınan eksplantlardan kurulan kallus ve süspansiyon kültürlerinde bazı biyoaktif özellikteki sekonder metabolitlerin varlığının araştırılması amaçlanmıştır.
Kallus üretimi aşamasında iki deneme yapıldı. Đlk denemede kök ve yaprak eksplantları kullanıldı ve inkübasyon karanlıkta gerçekleştirildi. Đkinci denemede ise sadece yaprak eksplantı kullanıldı ve inkübasyon 3000 lux ışık şiddetinde aydınlıkta gerçekleştirildi.
Her iki deneme için de kallus üretimi ilk 30 günde gözlendi. Kallus oluşum aşaması sonunda elde edilen kallusların miktarları analiz için yeterli olmadı. Bu nedenle kallus gelişimini artırmak için her 4 haftada bir alt kültür yapıldı. Böylece hem kallus miktarlarındaki artış belirlenerek en çok hücre artışının olduğu ortam belirlendi, hem de analiz için yeterli miktarda kallus elde edildi. Ayrıca sekonder metabolit içeriğindeki değişimler aylık izlenebildi. Sekonder metabolit üretimi için en fazla materyalin (kallus veya süspansiyon hücreleri) hangi ortamdan elde edilebileceğini belirlemek için KBĐ
değerleri hesaplandı. Böylece KBĐ değerleri ile eksplantların doku kültürüne verdikleri cevap belirlendi. Karanlıkta inkübe edilen yaprak eksplantlarının köklere göre çok daha fazla hücre artışına sahip olduğu gözlendi. Yaprak eksplantlarında KBĐ-2 ve KBĐ-3 sonuçlarının KBĐ-1’e göre düşük olması, kallus artışının en hızlı eksplant ekimi aşamasında gerçekleştiğini gösterdi. Karanlıkta gelişen kallusların miktarları aydınlıktakilerden yüksek bulundu (Çizelge 4.1). Đnkübasyon ve eksplant türü kallus renklerinde farklılık yaratmadı ve kalluslar sarı renkli, çok gevrek olmayan fakat kolay dağılabilen yapıda üredi. Karanlık inkübasyonda en fazla hücre artışı yaprak eksplantında, 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l BAP içeren W1 ortamında olurken (59.52 kat);
aydınlık inkübasyonda en fazla hücre artışı 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l Kinetin içeren W2 ortamında (26.4 kat) gözlendi (Çizelge 4.1). Edis (2003) yaptığı çalışmada G. olivieri herbasından elde ettiği ekstrede çok miktarda izoorientin bulunduğunu göstermiştir.
Bunun yanında Çalış vd. (1992) G. septemfida’da ve Krstic vd. (2004) G. dinarica’da herbada yaptıkları çalışmada iridoitlere rastlamışlardır. Sekonder metabolitlerden flavonoitler bitkinin herbasında bulunmaktadır. Bu nedenle ikinci denemede aydınlık inkübasyon yapılmasına karar verildi.
G. olivieri’de süspansiyon kültürü ise yaprak eksplantından aydınlık inkübasyon ile 1.
alt kültür sonunda gelişen kallus hücrelerinden kuruldu. 25. günün sonuna kadar her 5 günde bir hücre miktarındaki değişim izlendi. En fazla hücre artışı ise 1 mg/l NAA ve 0.2 mg/l Kinetin içeren W3 ortamında (4 kat) gözlendi (Şekil 4.8). Chueh vd. (2000) G.
davidii var. formosana’da yaptıkları süspansiyon kültürü çalışmasında gövdeden aldıkları eksplantları 1 mg/l NAA ve 0.2 mg/l kinetin içeren MS ortamında kallus kültürüne almışlardır. Elde ettikleri hücrelerden 0.2 mg/l Kinetin sabit kalmak koşuluyla 0, 0.5, 1, 2 ve 4 mg/l 2,4 D, NAA veya IAA içeren MS ortamında süspansiyon kültürü kurmuşlardır. 36. günün sonuna dek her 4 günde bir hücre artışını izlemişlerdir. Buna göre en çok hücre artışının sadece 0.2 mg/l Kinetin içeren ortamda olduğunu belirlemişlerdir. Daha sonra 0, 0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/l konsantrasyonlarda Kinetin deneyerek hücre artışını izlemişler ve yine en iyi sonucu 0.2 mg/l Kinetinin verdiğini bulmuşlardır. Çalışmamızda da 0.2 mg/l Kinetinin (W3 ortamı) daha iyi sonuç verdiği gözlendi.
Đn vitro çimlendirilmiş G. olivieri fidelerinden alınan kök ve yaprak eksplantlarından üretilen kallus hücrelerinde iridoit ve flavonoit grubu bileşikler önce ĐTK ile kalitatif olarak araştırıldı. Karanlıkta gelişen hücrelerde iridoit grubu standart bileşiklerle aynı hizada lekeler görüldü. Karanlık ve aydınlık inkübasyonun Gentiana türlerinde in vitro sekonder metabolit üretimi üzerine etkisi ile ilgili bir makaleye rastlanmasa da iridoit ve sekoiridoitlerin in vivo’da köklerde daha fazla bulunduğu bilinmektedir (Vanisree vd.
2004). Bu nedenle karanlık inkübasyon iridoit üretimini sağlamış olabilir. Buna karşın topraküstü kısımda fazla miktarda olduğu bilinen flavonoitler karanlıkta inkübe edilen hücre ekstrelerinde gözlenmedi (Şekil 4.11-4.13). Aydınlıkta inkübe edilen kallus hücrelerinde ise ilk denemenin aksine flavonoit grubu standart bileşiklerle aynı hizada lekeler görüldü. Elimizdeki referans iridoitlerden farklı, iridoit olabilecek maddelere rastlandı (Wagner vd. 2001). Bu ekstrelerdeki leke sayısı ve yoğunluğu ilk denemedekilere göre daha fazla oldu (şekil 4.14). Doğal ortamında yetişen Gentiana türlerinde genel olarak topraküstü kısımlarda flavonoitler (Deliorman Orhan vd. 2003), toprakaltı kısımlarında ise iridoitler (Chulia vd. 1996) yoğundur. Elde edilen sonuçlar bu bulgular ile örtüşmektedir; ilk denemede (karanlık inkübasyonda) iridoitler gözlenirken ikinci denemede (aydınlık inkübasyon) flavonoit ve iridoitler gözlendi.
Fakat doku kültürü çalışmalarında bitkide çok miktarda bulunan bileşiklerin in vitro’da üretilmediği veya aksine bitkide bulunmayan bileşiklerin üretilebileceği de unutulmamalıdır (Ramachandra Rao ve Ravishankar 2002).
Üretilen sekonder metabolitler sayı ve yoğunluk olarak değerlendirildiğinde süspansiyon kültüründe üretilenlerin WY ortamlarında aydınlıkta üretilen kalluslardakilerden fazla olduğu gözlendi. Svertiamarin ve gentiopikrozit ile eşleşen maddeler bulunmazken ĐTK’da tespit edilen, Rf değerleri ve renkleriyle iridoit grubu bileşiklerden olduğu düşünülen (Wagner vd. 2001) fakat referansları olmadığından ne olduğu belirlenemeyen maddeler üretildi (alıkonma zamanı 2 ve 38. dak) (Şekil 4.26-4.33).
Aydınlıkta inkübe edilen kalluslarda üretilen sekonder metabolitlerin varlığını daha net ortaya çıkarmak ve miktarlarını belirleyebilmek için HPLC kullanıldı. En fazla izoorientin miktarı 0.492 mg/g (kuru ağırlık-ka) [% 0.049] ile 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l
Kinetin içeren W2 ortamında 1. alt kültür sonunda yaprak eksplantından elde edilen hücrelerde bulundu. Bu miktar, G. olivieri’de izoorientinin en fazla bulunduğu yaprak ve çiçeklerden hazırlanan ekstre ile karşılaştırıldığında 5.8 kat daha azdır. Bunu yanında diğer bir flavonoit olan ve G. olivieri’de daha az miktarda bulunan izoviteksin, en fazla 1 mg/l NAA ve 0.2 mg/l Kinetin içeren W3 ortamında yaprak eksplantından 2. alt kültür sonunda üretilmiştir (0.337 mg/g) [% 0.034]. Bu miktar bitkide bulunandan 8.43 kat daha fazladır. Bu sonuçlar, kallus kültürünün G. olivieri’den izoviteksin üretimi için daha başarılı olduğunu göstermektedir. Gentiana türlerinde kallus kültürü ve rejenere olan bitkiler ile sekonder metabolit üretimi daha çok iridoitler üzerinedir. Elde ettiğimiz sonuçlarla, daha önce yapılan çalışmalar karşılaştırıldığında sekonder metabolitlerin miktarları değişkenlik göstermektedir. Menkovic vd. (2000a) G. lutea’dan in vitro üretilen sürgün ve köklerde sekoiridoit, γ-piron ile izoorientin ve izogentisin bileşiklerini tespit etmişlerdir. Hormonsuz MS ortamında gelişen sürgünlerde % 1.48 (ka), köklerde ise % 0.71 oranında gentiopikrozit elde etmişlerdir. Bu miktarlar sürgünde doğal yetişen bitkiden alınan yapraktakine oranla yaklaşık 1.8 kat fazla iken in vitro elde edilen kökte doğadan alınan köke göre 9 kat daha azdır. Svertiamarin in vitro sürgünde yapraktakiyle aynı oranda bulunurken in vitro kökte üretilememiştir.
Đzoorientin ise yaprakta % 0.93 oranında bulunurken in vitro kökte % 0.11 oranında üretilebilmiştir. Ayrıca çeşitli büyüme düzenleyiciler kullanarak elde ettikleri sürgünlerde de sekonder metabolitlerin varlığını araştırmışlardır. 0.25 mg/l BAP ve 0.2 mg/l IAA içeren ortamda gelişen sürgünlerde gentiopikrozit miktarı % 3.59, svertiamarin miktarı % 0.73 ve izoorientin miktarı % 0.1 oranında üretilebilmiştir. Cai vd. (2009) G. straminea’da yaptıkları kapsamlı kallus kültüründe kallusların büyük çoğunluğu sonradan somatik embriyogeneze uğramışlardır. 11.42 µM IAA içeren MB ortamında (MS tuzları, B5 vitaminleri ve kazein hidrolizat içeren besin ortamı) gelişen sarı-yeşil proembriyojenik hücrelerde % 0.031 (ka), yeşil proembriyojenik hücrelerde ise % 0.53 oranında gentiopikrozit bulmuşlardır. Sabovljevic vd. (2006), farklı lokalitelerden topladıkları Blackstonia perfoliata (Gentianaceae)’de yaptıkları çalışmada, in vitro çimlendirdikleri fideleri ve kökleri kültüre almışlardır. Doğadan toplanan bitkilerde gentiopikrozit miktarı % 5.75-7.35 arasında iken svertiamarin % 0.66-1.28 arasında bulunmuştur. 0.5 µM IBA içeren MS ortamında gelişen fidelerde gentiopikrozit miktarı % 5.52, svertiamarin miktarı ise % 0.38 olarak bulunmuştur. Kök
kültüründe ise 10 µM IBA ile gentiopikrozit miktarını % 3.21, svertiamarin miktarını ise % 0.21 olarak tespit etmişlerdir. Çalışmamızda yaprak eksplantından aydınlıkta elde edilen hücrelerde izoorientin miktarı en fazla % 0.049, izoviteksin ise % 0.034 olarak bulunmuş; svertiamarin ve gentiopikrozite rastlanmamıştır. Svertiamarin ve gentiopikrozitler daha ziyade köklerde bulunan maddelerdir.
G. olivieri’de aydınlık inkübasyonda yaprak eksplantından gelişen kalluslardan kurulan süspansiyon kültürlerinde, ortam ve büyüme düzenleyiciler kallus kültüründekilerle aynı olacak şekilde hazırlandı. 25 gün süren inkübasyon aydınlıkta gerçekleştirildi. Her 5 günde bir alınan hücreler ekstre edildi ve sekonder metabolit varlığı önce ĐTK ile kalitatif olarak gözlendi. Đridoit yapıda olduğu düşünülen fakat elimizdeki referanslardan farklı maddeler üretildi (Wagner vd. 2001). Plaklarda, flavonoitlerin karakteristik rengi olan sarı lekeler tespit edildi. Lekelerin yoğunluğunun genel olarak inkübasyon boyunca arttığı gözlendi (Şekil 4.15). HPLC sonuçlarına göre süspansiyon kültürü kallus kültürüne göre sekonder metabolit üretiminde daha başarılı bulundu (çizelge 4.2). Yapılan HPLC analizi sonucunda süspansiyon kültürlerinde W1 serisinde izoorientin görülmezken, W2 ve W3 ortamlarında 10. günden sonra az miktarda görüldü. Süspansiyon kültüründe en fazla miktarda izoorientin 0.217 mg/g (% 0.022) olarak W2S15’de rastlandı. Elimizdeki referans iridoitlere rastlanmadı. Buna karşın W3S5 dışında tüm ortamlarda üreyen hücrelerde izoviteksin üretildi. En yüksek izoviteksin miktarları, G.olivieri ekstresine oranla 10.2 kat fazla olan W1S10’da (0.408 mg/g) [% 0.041] ve 9.73 kat fazla olan W3S10’da (0.389 mg/g) [% 0.039] elde edildi.
Đzoviteksin, doku kültürü yoluyla ilk defa bu çalışmayla üretildi. Chueh vd. (2000) G.
davidii var. formosana’da yaptıkları süspansiyon kültürü çalışmasında, kültür şartlarının optimizasyonu üzerine bir çalışma yapmışlardır. 0.2 mg/l Kinetin içeren sıvı MS ortamında geliştirdikleri hücrelerin sekoiridoit içeriklerini araştırmışlar ve gentiopikrozit için en yüksek miktara 24. günde 1.6 mg/g (süspansiyon hücrelerinin kuru ağırlığı) ile ulaşırken svertiamarin için bu sonuç 12 günde 2.24 mg/g olarak gerçekleşmiştir. Piatczak vd. (2005a) Centaurium erythraea (Gentianaceae)’de sürgün artışını ve sekoiridoit üretimini amaçladıkları çalışmalarında kallus ve süspansiyon kültürü yapmışlardır. Sürgünlerden aldıkları eksplantları 0.1 mg/l IAA ve 1 mg/l BAP içeren MS ortamında 1 yıldan fazla süre alt kültürde geliştirmişler, daha sonra yine aynı
konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicileri içeren sıvı ve katı ortamlarda kültüre almışlardır. Doğal yetişen bitkide 4.78 mg/g gentiopikrozit ve 35.45 mg/g svertiamarin bulunurken, 10 haftalık mikroçoğalan fidelerden gelişen sürgünlerde gentiopikrozit 48 mg/g, svertiamarin ise 86.5 mg/g’a kadar yükselmiştir. Çalışma sonucuna göre katı ve sıvı kültürlerde üretilen sekonder metabolitlerin miktarları hemen hemen aynı olmuştur.
Jensen ve Schripsema (2002)’nin bildirdiğine göre Fujita ve Inoue (1979), radyoaktif etiketleme yöntemi kullanmışlar ve izoviteksinin, içlerinde izoorientinin de bulunduğu flavonoitlerden bir grubun öncü maddesi olduğunu kanıtlamışlardır. Bu çalışma, öncü molekül olarak kabul edilen izoviteksinin kallus kültürlerinde 1. alt kültürde, süspansiyon kültürlerinde ise 5. günden itibaren üretilmesini açıklar niteliktedir.
Gerçekleştirilen kallus ve süspansiyon kültürlerinde izoviteksinin izoorientine dönüşümü için gerekli biyokimyasal sürecin tam olarak gerçekleşmediği düşünülebilir.
Bununla beraber çizelge 4.2’de, W1Y1 hariç, izoorientin üretimi olan tüm ortamlarda izoviteksinin de üretildiği gözlenmektedir.
Literatür taramasında Gentiana türlerinden izoviteksinin izole edildiği bildirilmesine rağmen (Lin vd. 1997, Bergeron vd. 1997, Xu vd. 2009) izoviteksinin varlığı G. olivieri bitkisinde araştırılmamıştır. Bu çalışmayla çiçek ve yapraklarından yapılan metanolik ekstraksiyon ile G. olivieri’de izoviteksinin varlığı gösterildi.
Đzoviteksinin antiradikal etkisi Masteikova vd. (2008) tarafından bildirilmiştir. Lin vd.
(2002), izoviteksinin antioksidan aktivitesi üzerine yaptıkları ayrıntılı çalışmada, izoviteksinin, analogları olan diğer flavonoitlere göre oldukça kuvvetli antioksidan aktiviteye sahip olduğunu, bunun yanında DNA’yı koruduğunu, reaktif oksijen türlerinin insan promiyelositik lösemi hücreleri üzerindeki etkilerini kaldırdığını, bunu da en düşük sitotoksik etki göstererek yaptığını bulmuşlardır. Peng vd. (2008) yaptıkları çalışmada viteksin ve izoviteksinin fazla biriktiğinde sinir, böbrek, retina hastalıklarına ve katarakta neden olabilen glikasyon son ürünlerinin oluşumunu engellediğini bulmuşlardır. Oksidatif stresle çok iyi başa çıkan izoviteksin günlük hayatta kullanılan
bir metabolittir. Aspalathus linearis (Rooibos) (Rabe vd. 1994),
Passiflora sp. (Pereira vd. 2005), Euterpe oleracea (Akai meyvesi) (Schauss vd. 2006) ve Vitex agnus-castus’ta (hayıt meyvesi) (Jarry vd. 2006) izoorientin
ile beraber bulunan izoviteksin, bu bitkilerden hazırlanan çaylarla detoks kürü ve sakinleştirici olarak kullanılmaktadır. Bununla beraber izoviteksin, kozmetik ürünlerinde de ciltten serbest radikalleri uzaklaştırıcı ajan olarak kullanılmaktadır (http://www.coreana.com/eng/Brand/GoodsView.asp?CateID=389, 2010). Ciltteki serbest radikallerin ortadan kalkmasıyla cilt, yumuşak, esnek ve daha canlı olmakta dolayısıyla yaşlanma etkilerini de hafifletmektedir.
Çalışmamızda biyolojik etkileri kanıtlanmış olan izoorientin ve izoviteksin, Gentiana olivieri Griseb. bitkisinde ilk kez doku kültürü yöntemleriyle üretildi. Đzoorientin miktarının bitkideki miktara göre az olması bu metabolitin üretimi üzerinde daha ayrıntılı çalışmalar yapılması gerektiğini göstermektedir. Đzoorientin üretimini artırmak için farklı büyüme düzenleyiciler kullanılabilir, öncül molekül eklemesi yapılabilir, elisitörler kullanılabilir, metabolizma mühendisliği teknikleri kullanılarak biyokimyasal araştırmalar yapılabilir veya gen aktarımı yoluyla metabolitin miktarı artırılmaya çalışılabilir.
Đzoviteksinin çalışmamızda 10 kat fazla üretilmesi ise doku kültürü tekniğinin (özellikle süspansiyon kültürünün) bu metabolitin büyük miktarlarda üretilmesi için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu çalışma öncü niteliktedir, üretimin büyük miktarlara taşınabilmesi için bu yöntemin optimizasyonu tam olarak yapılmalıdır. Yine izoorientin üretimini artırmaya yönelik denenebilecek yöntemler kullanılarak izoviteksinin in vitro hücrelerdeki miktarı daha da artırılabilir. Bu çalışmada G.
olivieri’de referans olarak kullanılan svertiamarin ve gentiopikrozit karanlık inkübasyon ile üretilebilmesine (Şekil 4.11-4.13) karşın aydınlık inkübasyon ile üretilememiştir.
Đridoit yapılı bileşikleri üretmek için karanlık inkübasyonla kök eksplantından elde edilen kalluslar ile süspansiyon kültürü kurulabilir.
KAYNAKLAR
Aberham, A., Schwaiger, S., Stuppner, H. and Ganzera, M. 2007. Quantitative analysis of iridoids, secoiridoids, xanthones and xanthone glycosides in Gentiana lutea L.
roots by RP-HPLC and LC-MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 45 (3); 437-442.
Aktay, G., Deliorman, D., Ergun, E., Ergun, F., Yeşilada, E. and Çevik, C. 2000.
Hepatoprotective effects of Turkish folk remedies on experimental liver injury. J.
Ethnopharmacol., 73 (1-2); 121-129.
Anonim. 2006. Sayı: 2005/45, 26326, 26678, Web Sitesi:
http://www.resmigazete.gov.tr/default.aspx#, Erişim Tarihi: 01.08.2011.
Anonim. 2009. Web Sitesi:
http://www.tarim.gov.tr/Files/Mevzuat/teblig/dogal_ciceksoganlarinin_2006_yili ihracat_listesihakkinda_teblig.doc, Erişim Tarihi: 14.05.2009.
Anonymous. 2002-2008. Web Sitesi: http://gentian.rutgers.edu/ethno.htm, Erişim Tarihi: 14.05.2009.
Anonymous. 2002-2008. Web Sitesi:
http://gentian.rutgers.edu/ethno_stamps.htm#GENTIANA%20stamps, Erişim Tarihi: 14.05.2009.
Anonymous. 2009. Web Sitesi: http://alpineenthusiast.blogspot.com, Erişim Tarihi:
14.05.2009.
Anonymous. 2009. Web Sitesi:
http://www.gimex.de/www_site/produktgrafx/enzian_detail1.jpg, Erişim Tarihi: 14.05.2009.
Anonymous. 2010. Web Sitesi:
http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=113422, Erişim Tarihi:
10.10.2011.
Anonymous. 2011. Web Sitesi:
http://www.coreana.com/eng/Brand/GoodsView.asp?CateID=389, Erişim Tarihi: 05.01.2011.
Anonymous. 2011. Web Sitesi:
http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=GENTI, Erişim Tarihi: 20.12.2011.
Arino, A., Arberas, I., Jesus Leiton, M., Renobales, M. and Dominguez, J. B. 1997. The
Extraction of Yellow Gentian Root (Gentiana lutea L.). Z. Lebensm. Unters.
Forsch. A, 205; 295-299.
Aslan, M. 2000. Şeker Hastalığına Karşı Halk Đlacı Olarak Kullanılan Bitkiler Üzerinde Farmakognozik Araştırmalar, Doktora Tezi, Ankara.
Babaoğlu, M., Gürel, E. and Özcan, S. 2001. Bitki Bitoteknolojisi -1- Doku Kültürü ve Uygulamaları. Selçuk Üniversitesi Vakfı Yayınları.
Bach, A. and Pawlowska, B. 2003. Somatic Embryogenesis in Gentiana pneumonanthe L. Acta Biologica Cracoviensia, 45 (2); 79-86.
Barz, W., Daniel, S., Hinderer, W., Jaques, U., Kessmann, H., Koster, J. and Tiemann, K. 1988. Elicitation and metabolism of phytoalexins in plant cell cultures. In:
Plant cell biotechnology. Pais, M., Mavituna, F. and Novais, J. (eds), NATO ASI Series, Springer-Verlag, pp. 211–230, Berlin.
Başer, K. H. C., Honda, G. and Miki, W. 1986. Herb Drugs and Herbalists in Turkey, Studia Culturae Đslamicae 27, Tokyo.
Baytop, T. 1984. Türkiyede Bitkiler ile Tedavi. Đstanbul Üniversitesi Yayınları No:
3255, 194-195 p., Đstanbul.
Beaumont, M.D. and Knorr, D. 1987. Effects of immobilizing agents and procedures on viability of cultured celery (Apium graveolens) cells. Biotechnol Lett, 9; 377–
382.
Bergeron, C., Marston, A., Gauthier, R. and Hostettmann, K. 1997. Iridoids and secoiridoids from Gentiana linearis. Phytochemistry, 44(4); 633 637.
Berlin, J., Martin, B., Nowak, J., Witte, L., Wray, V. and Strack, D. 1989. Effects of permeabilization on the biotransformation of phenylalanine by immobilized tobacco cell cultures. Z Naturforsch 44c; 249–254.
Bianco, A. 1994. Recent Developments in Iridoids Chemistry. Pure & Appl. Chem., 66 (10/11); 2335-2338.
Bilaloğlu, G. V. ve Harmandar, M. 1999. Flavonoidler. Aktif Yayınevi, Đstanbul.
Bourgaud, F., Bouque, V. and Guckert, A. 1999. Production of flavonoids by Psoralea hairy root cultures. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 56; 97–104.
Bourgaud, F., Gravot, A. Milesi, S. and Gontier, E. 2001. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science, 161; 839-851.
Brodelius, P. 1988. Permeabilization of plant cells for release of intracellularly stored
products: viability studies. Appl Microbiol Biotechnol, 27; 561–566.
Butayarov, A. V., Batirov, E. Kh., Tadzhibaev, M. M. and Malikov, V. M. 1993.
Xanthones and Flavonoids of Gentiana karelinii. Chemistry of Natural Compounds, 29(3); 408-409.
Butiuc-Keul, A., Şuteu, A. and Deliu, C. 2005. In vitro Organogenesis of Gentiana punctata. Not. Bot. Hort. Agrobot., 33 (1); 38-41.
Cai, Y., Liu, Y., Liu, Z. Zhang, F., Xiang, F. and Xia, G. 2009. High-frequency
embryogenesis and regeneration of plants with high content of gentiopicroside from the Chinese medicinal plant Gentiana straminea Maxim. In Vitro Cell.
Dev. Biol.-Plant, 45; 730-739.
Carnat, A., Fraisse, D., Carnat, A., Felgines, C., Chaud, D. and Lamaison, J. 2005.
Influence of Drying Mode on Iridoid Bitter Constituent Levels in Gentian Root.
Journal of the Science of Food and Agriculture, 85; 598-602.
Chueh, F., Chen, C. and Tsay, H. 2000. Studies on Factors Affecting the Establisment of Gentiana davidii var. formosana (Hayata) T.N. Ho Cell Suspension Cultures.
Journal of Food and Drug Analysis, 8 (4); 297-303.
Chulia, A. J., Vercauteren, J. and Mariotte, A. M. 1996. Iridoids and Flavones from Gentiana depressa. Phytochemistry, 42(1); 139-143.
Crozier, A.,Burns, J., Aziz, A. A., Steward, A. J., Rabiasz A. S., Jenkins, G. I., Edwards, C. A. and Lean, M. E. J. 2000. Antioxidant Flavonols from Fruits, Vegetables and Beverages: Measurements and Bioavailability. Biological Research, 33(2); 79-88.
Curtin, M. E. 1983. Harvesting Profitable Products from Plant Tissue Culture. Biotech., 1; 644-657.
Çalış, Đ., Rüegger, H., Chun, Z. and Sticher, O. 1990. Secoiridoids Glucosides Isolated from Gentiana gelida. Planta Medica, 56; 406-409.
Çalış, Đ., Ersöz, T., Chulia, A.J. and Rüedi, P. 1992. Septemfidoside: A New Bis-Iridoid Diglucoside from Gentiana septemfida. Journal of Natural Products, 55(3); 385-388.
Davis, P. H. 1978. Flora of Turkey and East Eagean Islands. V 6. S. 311. Edinburg University Press, Edinburgh.
Deliorman Orhan, D., Aslan, M., Aktay, G., Ergun, E., Yesilada, E. and Ergun, F. 2003.
Evaluation of Hepatoprotective Effect of Gentiana olivieri Herbs on Subacute Administration and Isolation of Active Principle. Life Sciences, 72; 2273-2283.
Deus, N. B. S. and Zenk, M. H. 1982. Exploitation of plant cells for the production of alkaloids in Catharanthus roseus cell suspension cultures. Planta Med, 50;427–
431.
Devic, M., Momcilovic, I., Krstic, D., Maksimovic, V. and Konjevic, R. 2006. In vitro Multiplication of Willow Gentian (Gentiana asclepiadea L.) and the Production of Gentiopicrine and Mangiferin. Phyton, 46(1); 45-54.
DiCosmo, F. and Towers, G. H. N. 1984. Stress and secondary metabolism in cultured plant cells. In: Recent advances in phytochemistry, vol. 18. Timmerman, B. N., Steelink, F. A. and Loewus, F. A. (eds), Plenum, pp. 97–175, New York.
DiCosmo, F. and Tallevi, S. G. 1985. Plant cell cultures and microbial insult:
interactions with biotechnological potential. Trends Biotechnol, 3;110–111.
DiCosmo, F., Quesne, A., Misawa, M. and Tallevi, S.G. 1987. Increased synthesis of ajmalicine and catharanthine by cell suspension cultures of Catharanthus roseus in response to fungal culture filtrates. Appl Microbiol Biotechnol, 14;101–106.
Dinda, B., Debnath, S. and Harigaya, Y. 2007. Naturally Occurring Iridoids. A Review, Part 1. Chem. Pharm. Bull., 55(2); 159-222.
Dornenburg, H. and Knorr, D. 1993. Cellular permeabilization of cultured tissues by high electric field pulses or ultra high pressure for the recovery of secondary metabolites. Food Biotechnol, 7; 35–48.
Edis, M. 2003. Türkiye’de Yetişen Bazı Gentiana L. Türlerinin Đzoorientin Yönünden Değerlendirilmesi. Yüksek Lisans Tezi, Ankara.
Ekim, T., Koyuncu, M., Vural, M., Duman, H., Aytaç, Z. ve Adıgüzel, N. 2000. Türkiye Bitkileri Kırmızı Kitabı (Eğrelti ve Tohumlu Bitkiler). Türkiye Tabiatını Koruma Derneği ve Van Yüzüncüyıl Üniversitesi, Barışcan Ofset, 166 s., Ankara
Eilert, U. 1987. Elicitation: methodology and aspects of application. In: Cell culture and somatic cell genetics of plants, vol. 4. Constabel, F. and Vasil, I. (eds), Academic Press, pp. 153–196, San Diego.
Ersöz, T. 1988. Gentiana olivieri Griseb. Üzerinde Farmakognozik Araştırmalar.
Doktora Tezi, Ankara.
Ersöz, T. and Çalış, Đ. 1991. C-Glucosylflavones from Gentiana olivieri. Journal of Faculty of Pharmacy, Hacettepe University, 11 (1); 29-36.
Fedoreyev, S. A., Pokushalova, T. V., Veselova, M. V., Glebko, L. I., Kulesh, N. I., Muzarok, T. I., Seletskaya, L. D., Bulgakov, V. P. and Zhuravlev,Yu. N. 2000.
Isoflavonoid production by callus cultures of Maackia amurensis. Fitoterapia, 71(4); 365-372.
Felix, H. R. 1982. Permeabilized cells. Anal Biochem, 120; 211–234.
Fiuk, A. and Rybczynski, J. J. 2008. Genotype and Plant Growth Regulator-dependent Response of Somatic Embryogenesis from Gentiana spp. Leaf Explants. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, 44; 90-99.
Fujita, M. and Inoue, T. 1979. Biosynthesis of C-glucosylflavones in Swertia japonica.
Yakugaku Zasshi, 99; 165–171.
Fujita, Y., Takahashi, S. and Yamada, Y. 1984. Selection of cell lines with high
productivity of shikonin derivatives through protoplasts of Lithospermum erythrorhizon. Proc Euro Congr Biotechnol (3rd), 1;161–166.
Furze, J. M., Rhodes, M. J. C., Parr, A. J., Robins, R. J., Whithehead, I. M. and
Threlfall, D. R. 1991. Abiotic factors elicit sesquiterpenoid phytoalexin production but not alkaloid production in transformed root cultures of Datura stramonium. Plant Cell Rep, 10;111–114.
Gamborg, O.L., Miller, R.A. and Ojima, K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50 (1); 151-158.
Guo, Y. G., Li, H. J., Cai, Y. X., Zhong, Y. and Peng, Z. Y. 1992. Studies on the production of secondary metabolites in plant cell cultures. In: Biochemical engineering for 2001. Furusaki, S., Endo, I. and Matsuno, R. (eds), Springer-Verlag, pp. 242–245, Tokyo.
Gürel, S., Gürel, E. and Kaya, Z. 2002. Establishment of Cell Suspension Cultures and Plant Regeneration in Sugar Beet (Beta vulgaris L.). Turkish Journal Botany, 26; 197-205.
Honda, G. 1999. A Report on Traditional Medicine of Turkish People (1997, 1998), Kyoto University, Kyoto. 43, 53, 74. pp
Hosokawa, K., Oikawa, Y. and Yamamura, S. 1998. Mass Propagation of Ornamental
Gentian in Liquid Medium. Plant Cell Reports, 17; 747-751.
Hosokawa, K., Matsuki, R., Oikawa, Y. and Yamamura, S. 2000. Production of
Transgenic Gentian Plants by Particle Bombardment of Suspension-culture Cells. Plant Cell Reports, 19; 454-458.
Jarry, H., Spengler, B., Wuttke, W. and Christoffel, V. 2006. In vitro assays for
bioactivity-guided isolation of endocrine active compounds in Vitex agnus-castus. Maturitas, 55S; S26–S36.
Jensen, S. R. and Schripsema, J. 2002. Chemotaxonomy and pharmacology of Gentianaceae. Gentianaceae- Systematics and Natural History, Struwe, L. &
Albert, V. (Eds.), Cambridge University Press.
Jiang, R., Wong, K., Chan, Y., Xu, H., But, P. P. and Shaw, P. 2005. Isolation of iridoid and secoiridoid glycosides and comparative study on Radix gentianae and related adulterants by HPLC analysis. Phytochemistry, 66(22); 2674-2680.
Jiang, Z., Liu, H., Liu, X., Shang, J., Zhao, J. and Yuan, C. 2010. Chemical composition of Gentiana pneumonanthe Pall. Natural Product Research 24(14); 1365-1369.
Keller, F. 1986. Gentiopicroside is Located in the Vacuoles of Root Protoplasts of Gentiana lutea. J. Plant Physiol., 122; 473-476.
Knorr, D., Miazga, S. M. and Teutonica, R. A. 1985. Immobilization and permeabilization of cultured plant cells. Food Technol, 39;139–142.
Knorr, D. and Teutonico, R. A. 1986. Chitosan immobilization and permeabilization of Amaranthus tricolor cells. J Agric Food Chem, 34;582–585.
Ko, F. N., Chu, C. C., Lin, C. N., Chang, C. C. and Teng, C. 1998. Isoorientin- 6''-O- glucoside, A Water-Soluble Antioxidant Isolated from Gentiana arisanensis.
Biochimica et Biophysica Acta, 1389; 89-90.
Krstic, D., Jankovic, T., Aljancic, I., Savikin-Fodulovic, K., Menkovic, N. and
Milosavljevic, S. 2004. Phytochemical investigation of Gentiana dinarica.
Biochemical Systematics and Ecology, 32; 937–941.
Kuo, S., Yen, M., Chung, M. and Lin, C. 1996. A Flavone C-Glycoside and an Aromatic Glucoside from Gentiana Species. Phytochemistry, 41(1); 309-312.
Kuzovkina, I. N., Guseva, A. V. , Alterman, I. E. and Karnachuk, R. A. 2001. Flavonoid Production in Transformed Scutellaria baicalensis Roots and Ways of Its Regulation. Russian Journal of Plant Physiology, 48(4); 448–452.
Küpeli, E., Aslan, M., Gürbüz, Đ. and Yesilada, E. 2004. Evaluation of in vivo Biological Activity Profile of Isoorientin. Z. Naturforsch. 59c, 787-790.
Kyte, L. 1987. Plants from test tubes. An Inroduction to Micropropagation, Timber Press, Portland, Oregon.
Liang, Y., Hu, J., Chen, H, Zhang, T. and Ito, Y. 2007. Preparative Isolation and
Purification of Four Compounds from Chinese Medicinal Herb Gentiana scabra Bunge by High-Speed Countercurrent Chromatography. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 30; 509-520.
Lila, M. A. 2005. Valuable secondary products from in vitro culture, In: Plant
Development and Biotechnology. Trigiano, R.N. and Gray, D. (eds), CRC Press, pp. 285-289, Oxford, U.K.
Lin, C., Kuo, S. and Chung, M. 1997. A New Flavone C-Clycoside and Antiplatelet and Vasorelaxing Flavones from Gentiana arisanensis. J. Nat. Prod., 60; 851-853.
Lin, C., Chen, C., Lee, H. and Lin, J. 2002. Prevention of cellular ROS damage by isovitexin and related flavonoids. Planta Medica, 68(4): 365-367.
Linsmaier, E. M. and Skoog, F. 1965. Organic Growth Factor Requirements of Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 18 (1); 100-127.
Lloyd, G. and McCown, B. H. 1980. Commercially Feasible Micropropagation of the Mountain Laurel, Kalmia latifolia Linn. by Using Shoot-tip Culture. Comb.
Proc. Intl. Plant Prop. Soc., 30; 421–427.
Mansoor, A. 1996. Entomological and biochemical studies on the etiology of malaria, malaria studies-I, PhD Thesis, Balochistan.
Mansoor, A., Zaidi, M.I. and Malghani, M.A.K. 1999. Biological efficacy of the
extracts and pure compounds of G. olivieri. Pakistan journal of Biological Sciences, 32: 105-109.
Mansoor, A. 2003. Toxicological Evaluation of the Extracts and Pure Compound of Gentiana olivieri. Pakistan Journal of Biological Sciences, 6 (23); 1949-1950.
Mansoor, A., Zaidi, M. I., Hyder, M. and Rasheed, R. 2004. Antihypertensive Effect of Gentiana olivieri. J. Med. Sci., 4 (3); 176-178.
Mantell, S. H. and Smith, H. 1984. Cultural factors that influence secondary metabolite accumulation in plant cell and tissue cultures, In: Plant Biotechnology. Mantell, S. H. and Smith, H. (eds), Cambridge Univ. Press, pp. 75–108, Cambridge.
Masteikova, R., Bernatoniene, J., Bernatoniene, R. and Velziene, S. 2008. Antiradical activities of the extract of Passiflora incarnata. Acta Poloniae Pharmaceutica- Drug Research, 65(5); 577- 583.
Memişoğlu, M. 2005. Ecballium elaterium Bitkisinde Hücre Süspansiyon Kültürü Tekniği ile Sekonder Metabolit (Kukurbitasin B) Üretimi, Doktora Tezi, Ankara.
Menkovic, N., Savikin-Fodulovic, K. Momcilovic, I. and Grubisic, D. 2000a.
Quantitative Determination of Secoiridoid and γ-Pyrone Compounds in Gentiana lutea Cultured in vitro. Planta Med., 66; 96-98.
Menkovic, N., Savikin-Fodulovic, K. and Savin, K. 2000b. Chemical Composition ans Seasonal Variation in the Amount of Secondary Compounds in Gentiana lutea Leaves and Flowers. Planta Medica, 66; 178-180.
Meyer, H. J. and van Staden, J. 1995. The in vitro production of an anthocyanin from callus cultures of Oxalis linearis. Plant Cell Tissue Org Cult, 40;55–58.
Mok, M. C., Gabelman, W. H. and Skoog, F. 1976. Carotenoid synthesis in tissue cultures of Daucus carota. J Am Soc Hortic Sci, 101;442–449.
Momcilovic, I., Grubisic, D. and Neskovic, M. 1997. Micropropagation of Four
Gentiana species (G. lutea, G. cruciata, G. purpurea and G. acaulis). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 49; 141-144.
Morgan, E. R., Butler, R. M. and Bicknell, R. A. 1997. In vitro Propagation of Gentiana cerina and Gentiana corymbifera. New Zealand Journal of Crop and
Horticultural Science, 25; 1-8.
Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15; 473-497.
Niiho, Y., Yamazaki, T., Nakajima, Y., Yamamoto, T., Ando, H., Hirai, Y., Toriizuka, K. and Ida, Y. 2006. Gastroprotective effects of bitter principles isolated from Gentian root and Swertia herb on experimentally-induced gastric lesions in rats.
Journal od Natural Medicine, 60: 82–88.
Odontuya, G., Hoult, J. R. S. and Houghton, P. J. 2005. Structure-activity relationship for antiinflammatory effect of luteolin antiinflammatory effect of luteolin.
Phytothreapy Research, 19; 782-786.
Öztürk, N., Başer, K. H. C., Aydın, S., Öztürk, Y. and Çalış, Đ. 2002. Effects of