ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
DOKTORA TEZĠ
HIYARDA (Cucumis sativus L.) TOHUM ĠRĠLĠĞĠ ĠLE DÜġÜK SICAKLIKTA ÇĠMLENME YETENEĞĠNĠN KARġILIKLI MELEZLEME VE GENOMĠK
BAĞLANTI ANALĠZLERĠYLE QTL HARĠTALANMASI
Metin YAĞCIOĞLU
BAHÇE BĠTKĠLERĠ ANABĠLĠM DALI
ANKARA 2018
ÖZET
Doktora Tezi
HIYARDA (Cucumis sativus L.) TOHUM ĠRĠLĠĞĠ ĠLE DÜġÜK SICAKLIKTA ÇĠMLENME YETENEĞĠNĠN KARġILIKLI MELEZLEME VE GENOMĠK BAĞLANTI
ANALĠZLERĠYLE QTL HARĠTALANMASI
Metin YAĞCIOĞLU
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı
DanıĢman: Prof. Dr. ġ. ġebnem ELLĠALTIOĞLU
Hıyar tropik orijinli, çimlenme yönünden düĢük sıcaklıklara hassas bir sebzedir. Yapılan bu çalıĢma hıyarda düĢük sıcaklıkta çimlenme yeteneği (CG) ve tohum iriliği özelliği olan; tohum uzunluğu (SL), tohum geniĢliği (SWI), 100 tohum ağırlığı ile ilgili QTL haritalama çalıĢması olup iki kısımdan oluĢmaktadır. ÇalıĢma düĢük sıcaklıklarda çimlenme yeteneğine ve iri tohum özelliğine sahip olan Coolgreen ile düĢük sıcaklıklarda çimlenme özelliğine sahip olmayan ve küçük tohumlu 7088D ebeveynlerinden elde edilen 135 adet RIL populasyonunda yapılmıĢtır.
DüĢük sıcaklıkta çimlenme özelliği 13 °C’de 10 gün boyunca karanlık ortamda çimlendirilerek elde edilmiĢtir. Tohum özellikleri ile ilgili veriler GiNA yazılımı ile elde edilmiĢtir. DüĢük sıcaklıkta çimlenme oranı ile ilgili sırasıyla kromozom 1, 2 ve 4’te qCG1.1, qCG2.1 ve qCG4.1 QTL gen bölgeleri tespit edilmiĢtir. Farklı yıl ve çevre koĢullarında yetiĢtirilen populasyonlardan elde edilen sonuçlara göre toplam fenotipik varyasyonun açıklanma oranı % 23.3-40.3 arasında bulunmuĢtur. qCG1.1 düĢük sıcaklıkta çimlenme yüzdesi ile ilgili ana QTL gen bölgesi olarak belirlenmiĢtir. Tohum uzunluğu, geniĢliği ve 100 tohum ağırlığı ile ilgili kromozom 3 ve 5’te qSL3.2, qSL5.1, qSL5.2, qSWI3.2, qSWI5.1, qSWI5.2, qSWE3.2, qSWE5.1 ve qSWE5.2 ana QTL gen bölgeleri olarak tespit edilmiĢtir. Farklı yıl ve çevre koĢullarında yetiĢtirilen populasyonlardan elde edilen 3. ve 5. kromozomdaki QTL’lerin toplam fenotipik varyasyonu açıklama oranı qSL % 23.4-60.6, qSWI % 33.9-51.5 ve qSWE % 26.5- 57.7 olarak bulunmuĢtur. Her özellik için tespit edilen QTL’lerin alanı, 602 adet F2:3
populasyonundan ilgili geni taĢıdığı düĢünülen rekombinant bireyler seçilerek daraltılmıĢtır. Bu çalıĢma sonunda her özelliği kontrol eden gen bölgelerinin tespiti markır destekli seleksiyon ile ıslah çalıĢmalarında etkili olarak kullanılabilecektir.
Kasım 2018, 251 sayfa
Anahtar Kelimeler: QTL haritalama, bi-parental bağlantı analizi, düĢük sıcaklıkta çimlenme yeteneği, tohum iriliği, hıyar, SNP markırları
ABSTRACT
Ph.D. Thesis
QTL MAPPING OF SEED SIZE AND COLD GERMINATION ABILITY IN CUCUMBER (Cucumis sativus L.) THROUGH BIPARENTAL LINKAGE ANALYSIS AND GENOME-
WIDE ASSOCIATION ANALYSIS
Metin YAĞCIOĞLU
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Horticulture
Supervisor: Prof. Dr. ġ. ġebnem ELLĠALTIOĞLU
Cucumber is of tropical origin and sensitive to low temperature for germination. This study is composed of two parts. First part is related to cold germination ability (CG). Second part includes seed size related traits which are 100 seed weight (SWE), seed length (SL), seed width (SWI). This study, was conducted QTL analysis for CG ability using a recombinant inbred line (RIL) population derived from the cross between the CG tolerant and large seeded variety Coolgreen, the cold sensitive and small seeded line 7088D. Both phenotypic data were collected from 135 RILs in five environments which were used in QTL analysis. Phenotypic data on CG ability in terms of germination rate were obtained at 13 °C during 10 days in dark condition.
Data related to seed traits were obtained with GiNA, high throughput method. Three QTL, qCG1.1, qCG2.1 and qCG4.1 on chromosomes 1, 2 and 4 were consistently detected across multiple environments, which could explain 23.3 to 40.3 % of observed total phenotypic variance. Major QTLs were detected for all seed size traits which are qSL3.2, qSL5.1, qSL5.2, qSWI3.2, qSWI5.1, qSWI5.2, qSWE3.2, qSWE5.1 and qSWE5.2 on chromosomes 3 and 5 were consistently detected across multiple environments, which could explain for qSL 23.4 to 60.6 %, qSWI 33.9 to 51.5 %, qSWE 26.5 to 57.7% observed total phenotypic variance. QTL regions for all traits were narrowed down, choosing recombinant individuals having related genes from 602 F2:3 families. In conclusion, related genes for all traits can be detected marker- assisted selection in breeding.
November 2018, 251 pages
Key Words: QTL mapping, biparental linkage analysis, low temperature germination ability, seed size, cucumber, SNP markers
TEġEKKÜR
Doktora eğitimim ve tez çalıĢmam boyunca beni destekleyen, karĢılaĢtığım güçlüklerde bana yol gösteren, kıymetli bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım danıĢman hocam Sayın Prof. Dr. ġ. ġebnem ELLĠALTIOĞLU’na (Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı) sonsuz teĢekkürü borç bilirim.
Tez savunma jürisinde yer alan hocalarım Sayın Prof. Dr. Ruhsar YANMAZ’a (Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı), Prof. Dr. Ertan Sait KURTAR’a (Selçuk Üniversitesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı), Prof. Dr. Yıldız AKA KAÇAR’a (Çukurova Üniversitesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı) ve Prof. Dr. Gölge SARIKAMIġ’a (Ankara Üniversitesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı) katkıları ve desteklerinden dolayı teĢekkürlerimi ve saygılarımı sunarım.
AraĢtırmamı gerçekleĢtirme olanağı sunan, tüm çalıĢma koĢulları, bilgi ve deneyimleri ile destek olan Wisconsin-Madison Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Yiqun WENG’e ve Weng Laboratuvarındaki tüm arkadaĢlarıma destekleri için teĢekkür ederim.
YaĢamımın her anında sevgilerini ve desteklerini esirgemeyen, her kararımda desteklerini hissettiğim ve bulunduğum yere gelmemde en büyük payın sahipleri olan kıymetli aileme teĢekkürlerin en büyüğünü borç bilirim.
Son olarak, bana hayatı anlamlı kılan ve her zaman arkamda olan sevgili eĢim ġeymanur YAĞCIOĞLU’na ve biricik kızlarım EKĠN ve BURÇĠN’e sonsuz teĢekkürü bir borç bilerek bu çalıĢmamı onlara ithaf ederim.
Bu tez çalıĢması, TÜRKĠYE BĠLĠMSEL ve TEKNOLOJĠK ARAġTIRMA KURUMU (TÜBĠTAK), 2015/2 Yurt DıĢı Doktora Sırası AraĢtırma Burs Programı (2214-A) kapsamında desteklenmiĢtir. Desteklerinden dolayı TÜBĠTAK’a teĢekkürlerimi sunarım.
Metin YAĞCIOĞLU Ankara, Kasım 2018
ĠÇĠNDEKĠLER
TEZ ONAY SAYFASI
ETĠK ... i
ÖZET ... ii
ABSTRACT ... iii
TEġEKKÜR ... iv
SĠMGELER DĠZĠNĠ ... viii
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ... x
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ ... xii
1. GĠRĠġ ... 1
2. KAYNAK ÖZETLERĠ ... 10
2.1 Moleküler Markır Sistemleri ve QTL Haritalama ... 10
2.2 DüĢük Sıcaklık Stresi ... 19
2.3 Tohum Özellikleri ve Abiyotik Stres ile Ġlgili ÇalıĢmalar ... 22
2.4 Hıyarda Yapılan Genetik ve QTL ÇalıĢmaları ... 31
3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 36
3.1 Materyal ... 36
3.2 Yöntem ... 39
3.2.1 Fenotipik verilerin toplanması ... 39
3.2.2 DNA izolasyonu ve saflığının belirlenmesi ... 43
3.2.3 PCR reaksiyonu ve poliakrilamid jel elektroforezi ... 44
3.2.4 Poliakrilamid jel elektroforezi ... 45
3.2.5 Kullanılan moleküler markırlar ... 46
3.2.6 Bağlantı haritasının oluĢturulması ve QTL analizi ... 54
4. BULGULAR ve TARTIġMA ... 55
4.1 DüĢük Sıcaklıkta Çimlenme Özelliği ile Ġlgili Bulgular ... 55
4.2 Tohum Özellikleri ile Ġlgili Bulgular ... 58
4.3 RIL Populasyonu Bağlantı Haritası ile Ġlgili Bulgular ... 70
4.4 RIL Populasyonu QTL Analizi ile Ġlgili Bulgular ... 71
4.4.1 DüĢük sıcaklıkta çimlenme yüzdesi ve kökçük uzunluğu ... 77
4.4.2 Tohum özellikleri ... 80
4.4.2.1 Tohum uzunluğu ... 81
4.4.2.2 Tohum geniĢliği ... 83
4.4.2.3 100 tohum ağırlığı ... 86
4.5 F2:3 Populasyonu Bağlantı Haritası ile Ġlgili Bulgular ... 88
4.5.1 DüĢük sıcaklıkta çimlenme yüzdesi ... 88
4.5.2 Tohum özellikleri ... 91
4.6 F2:3 Populasyonu QTL Analizi ile Ġlgili Bulgular ... 96
4.6.1 DüĢük sıcaklıkta çimlenme özelliği ... 96
4.6.2 Tohum özellikleri ... 97
5. SONUÇ ve ÖNERĠLER ... 104
KAYNAKLAR ... 108
EKLER ... 124 EK 1 RIL populasyonu (Coolgreen X 7088D) GBS yöntemi ile elde edilen
EK 2 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu 2017 yılı (GHG) veri setinden elde edilen tohum özellikleri ile ilgili elde edilen QTL bölgelerinin görünümü... 193 EK 3 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu 2016 yılı (HG) veri setinden
elde edilen tohum özellikleri ile ilgili elde edilen QTL bölgelerinin görünümü... 194 EK 4 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu 2015 yılı (GHG) veri setinden
elde edilen tohum özellikleri ile ilgili elde edilen QTL bölgelerinin görünümü... 195 EK 5 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu 2015 yılı (HG) veri setinden
elde edilen tohum özellikleri ile ilgili elde edilen QTL bölgelerinin görünümü... 196 EK 6 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu 2015 yılı (GHM) veri setinden
elde edilen tohum özellikleri ile ilgili elde edilen QTL bölgelerinin görünümü... 197 EK 7 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu 2015 yılı (HM) veri setinden
elde edilen tohum özellikleri ile ilgili elde edilen QTL bölgelerinin görünümü... 198 EK 8 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu tohum uzunluğu ile ilgili 2016
ve 2015 yılı (H, GHG) veri setinden kromozom 3’te MQM yöntemine göre elde edilen QTL bölgelerinin görünümü ... 199 EK 10 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu tohum geniĢliği ile ilgili 2016 ve
2015 yılı (H, GHG) veri setinden kromozom 3’te MQM yöntemine göre elde edilen QTL bölgelerinin görünümü ... 201 EK 11 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu tohum geniĢliği ile ilgili 2016 ve
2015 yılı (H, GHG) veri setinden kromozom 5’te MQM yöntemine göre elde edilen QTL bölgelerinin görünümü ... 202 EK 12 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu 100 tohum ağırlığı ile ilgili
2016 ve 2015 yılı (H, GHG) veri setinden kromozom 3’te MQM yöntemine göre elde edilen QTL bölgelerinin görünümü ... 203 EK 13 Coolgreen x 7088D RIL populasyonu 100 tohum ağırlığı ile ilgili
2016 ve 2015 yılı (H, GHG) veri setinden kromozom 5’te MQM yöntemine göre elde edilen QTL bölgelerinin görünümü ... 204 EK 14 DüĢük sıcaklıkta çimlenme yüzdesi ile ilgili kromozom 1’de tespit
edilen aday genlerin listesi... 205 EK 15 Tohum uzunluğu ile ilgili kromozom 3’te tespit edilen aday genlerin
listesi ... 207 EK 16 Tohum geniĢliği ile ilgili kromozom 3’te tespit edilen aday genlerin
listesi ... 214 EK 17 Tohum ağırlığı ile ilgili kromozom 3’te tespit edilen aday genlerin
listesi ... 220 EK 18 Tohum uzunluğu ve geniĢliği ile ilgili kromozom 5’te tespit edilen ilk
bölgenin aday genlerin listesi ... 223 EK 19 Tohum ağırlığı ile ilgili kromozom 5’te tespit edilen ilk bölgenin aday
genlerin listesi ... 229 EK 20 Tohum uzunluğu ile ilgili kromozom 5’te tespit edilen ikinci bölgenin
aday genlerin listesi ... 233
EK 21 Tohum geniĢliği ile ilgili kromozom 5’te tespit edilen ikinci bölgenin aday genlerin listesi ... 234 ÖZGEÇMĠġ ... 235
SĠMGELER DĠZĠNĠ
∼ yaklaĢık
oC santigrat
> büyük
< küçük
≥ büyük eĢit
% yüzde
$ dolar
KISALTMALAR
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (ÇoğaltılmıĢ Parça Uzunluk Polimorfizmi)
AP Amonyum Persülfat
BC Back Cross (Geri Melez) BG Bağlantı Grubu
bp Base pair (Baz Çifti)
Ca Kalsiyum
CAPs Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (ÇoğaltılmıĢ DNA Dizilerinin Enzimle Kesilmesi)
CIM Composite Interval Mapping (BileĢik Aralık Haritalama) cM Centimorgan (Santimorgan)
CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide,
dCAPs Derived Cleaved Amplified Polymorphic (Türetilerek ÇoğaltılmıĢ DNA Dizilerinin Enzimle Kesilmesi)
DH Double Haploid (KatlanmıĢ Haploid)
dk Dakika
DNA Deoksiribo Nükleik Asit
EDTA Etilen Diamine Tetra Asetik Asit
FAO Food and Agriculture Organization (BirleĢmiĢ Milletler Gıda ve Tarım Örgütü)
Fe Demir
g Gram
GBS Genotyping by Sequencing (Dizileme ile Genotipleme) IL Introgression Lines (Ġntrogresyon Hatları)
IM Interval Mapping (Aralık Haritalama)
InDel Insertion-Deletion Polymorphisms (Ekleme-Çıkarma Polimorfizmi) ISSR Inter Simple Sequence Repeats (Basit Dizi Tekrarları Arası)
K Potasyum
kb Kilobase
kcal Kilokalori
kg Kilogram
LG Linkage Group (Bağlantı Grubu)
LOD Logarithm of the Odds (Göreceli Risk Oranları Logaritması)
M Morgan
MAS Marker Assisted Selection (Markır Destekli Seleksiyon)
Mbp Mega Base Pair
Mg Magnezyum
mg Miligram
MIM Multiple Interval Mapping (Çoklu Aralık Haritalama) mL Mililitre
mm Milimetre
MQM Multiple-QTL Mapping (Çoklu-QTL Haritalama)
Na Sodyum
ND Nanodrop
ng Nanogram
NGS Next Generation Sequencing (Yeni Nesil Sekanslama; YNS) NIL Near isogenic lines (Yakın Ġzogenik Hatlar)
P Fosfor
PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforezi
PCR Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) QTL Quantitative Trait Locus (Kantitatif Özellik Lokusu)
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (Rastgele ÇoğaltılmıĢ Polimorfik DNA)
RE Restriksiyon Enzimi RF Rekombinasyon Frekansı
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi)
RIL Recombinant Inbred Line (Rekombinant KendilenmiĢ Hat) SCAR Sequence Characterized Amplified Region
SIM Simple Interval Mapping (Basit Aralık Haritalama) SMA Single Marker Analysis (Tek Markır Analizi)
sn Saniye
SNP Single Nucleotide Polymorphism (Tek Nükleotid Polimorfizmi) SRAP Sequence-Related Amplified Polymorphism
SSR Simple Sequence Repeats (Basit Dizi Tekrarları) STS Sequence-Tagged Sites (Dizisi EtiketlenmiĢ Bölgeler) TBE Tris-borate-EDTA
TEMED Tetramethylethylenediamine TÜĠK Türkiye Ġstatistik Kurumu
UV Ultraviyole
V Volt
Zn Çinko
μL Mikrolitre
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
ġekil 1.1 Dünya hıyar ihracat rakamları (https://www.trademap.org/ 2017) ... 2
ġekil 1.2 Dünya hıyar ithalat rakamları (https://www.trademap.org/ 2017) ... 2
ġekil 1.3. Hıyar bitkisinin anavatanı ve tahmini yayılıĢ güzargahı ... 3
ġekil 2.1 QTL haritalama metodolojisi (Nadeem vd. 2017) ... 14
ġekil 2.2 RIL haritalama populasyonunun Ģematik gösterimi (Kutlu 2014’den değiĢtirilerek) ... 16
ġekil 3.1.a Coolgren (A), b. 7088D (B), c. F1 (C) bitkilerindeki tohum uzunluğu ve geniĢliğindeki varyasyon ... 36
ġekil 3.2. Walnut Street sera koĢullarından görünüm ... 38
ġekil 3.3. Hancock arazi koĢullarından görünüm ... 39
ġekil 3.4 Her genotipe ait tohumların sayılması ve petri kaplarının etiketlenmesi ... 40
ġekil 3.5 GiNA yazılımıyla tohum uzunluğu ve geniĢliği ile ilgili verilerin toplanması ... 41
ġekil 3.6 DüĢük sıcaklıkta çimlenme testi ve büyütme kabininden bir görünüm ... 42
ġekil 3.7 ImageJ programı için kullanılan arka plandan bir görünüm ... 42
ġekil 3.8 DNA izolasyonu için alınan yaprak örneklerinin öğütücü cam bilyalar ile toz haline getirilmesi ... 43
ġekil 3.9 Bio-Rad T100 PCR cihazı ... 44
ġekil 3.10 ÇalıĢmada kullanılan primerlere ait örnek jel görüntüsü ... 46
ġekil 3.11 Coolgreen X 7088D RIL populasyonunda 2780 SNP ve 55 SSR markırların kromozomlar üzerindeki yerleĢimi... 49
ġekil 4.1a. Coolgreen (A), b.7088D (B), c.F1 (C), d.F2:3 (D) populasyonunda tohumların düĢük sıcaklıkta çimlenme durumları ... 55
ġekil 4.2 Ebeveyn hatlar ve F1 tohumlarının günlere göre düĢük sıcaklıkta çimlenme yüzdesi değiĢimi ... 56
ġekil 4.3 RIL populasyonlarında tohum uzunluğu ile ilgili fenotipik verilerin normal dağılım grafiği ... 61
ġekil 4.4 RIL populasyonlarında tohum geniĢliği ile ilgili fenotipik verilerin normal dağılım grafiği ... 62
ġekil 4.5 RIL populasyonlarında 100 tohum ağırlığı ile ilgili fenotipik verilerin normal dağılım grafiği ... 63
ġekil 4.6 F2:3 populasyonunda tohum uzunluğu, geniĢliği ve 100 tohum ağırlığı ile ilgili fenotipik verilerin normal dağılım grafiği ... 64
ġekil 4.7 RIL populasyonunda tohum uzunluğu ile ilgili varyasyonu gösteren kutu grafiği (box plot) ... 65
ġekil 4.8 RIL populasyonunda tohum geniĢliği ile ilgili varyasyonu gösteren kutu grafiği (box plot) ... 66
ġekil 4.9 RIL populasyonunda 100 tohum ağırlığı ile ilgili varyasyonu gösteren kutu grafiği (box plot) ... 67
ġekil 4.10 Coolgreen x 7088D RIL populasyonunda düĢük sıcaklıkta çimlenme yüzdesi ile ilgili elde edilen QTL bölgeleri ... 77
ġekil 4.11 Coolgreen x 7088D RIL populasyonunda kökçük uzunluğu ile ilgili elde edilen QTL bölgeleri ... 79
ġekil 4.12 Coolgreen x 7088D RIL populasyonunda tohum uzunluğu ile ilgili elde edilen QTL bölgeleri ... 81
ġekil 4.13 Coolgreen x 7088D RIL populasyonunda tohum geniĢliği ile ilgili elde edilen QTL bölgeleri ... 84 ġekil 4.14 Coolgreen x 7088D RIL populasyonunda 100 tohum ağırlığı ile ilgili
elde edilen QTL bölgeleri ... 86 ġekil 4.15 67 adet F2:3 populasyonunda düĢük sıcaklıkta çimlenme yüzdesi ile
ilgili elde edilen bağlantı haritası ... 90 ġekil 4.16 21 adet F2:3 populasyonunda düĢük sıcaklıkta çimlenme yüzdesi ile
ilgili elde edilen bağlantı haritası ... 91 ġekil 4.17 95 adet F2:3 populasyonunda tohum özellikleri ile ilgili elde edilen
bağlantı haritası ... 93 ġekil 4.18 134 adet F2:3 populasyonunda tohum özellikleri ile ilgili elde edilen
bağlantı haritası ... 94 ġekil 4.19 73 adet F2:3 populasyonunda tohum özellikleri ile ilgili elde edilen
bağlantı haritası ... 96 ġekil 4.20 F2:3 populasyonunda düĢük sıcaklıkta çimlenme yüzdesi ile ilgili
kromozom 1’de elde edilen QTL bölgesi ... 97 ġekil 4.21 F2:3 populasyonunda tohum uzunluğu ile ilgili kromozom 3’te elde
edilen QTL bölgesi ... 98 ġekil 4.22 F2:3 populasyonunda tohum geniĢliği ile ilgili kromozom 3’te elde
edilen QTL bölgesi ... 99 ġekil 4.23 F2:3 populasyonunda 100 tohum ağırlığı ile ilgili kromozom 3’te elde
edilen QTL bölgesi ... 100 ġekil 4.24 F2:3 populasyonunda tohum uzunluğu ile ilgili kromozom 5’te elde
edilen QTL bölgesi ... 101 ġekil 4.25 F2:3 populasyonunda tohum geniĢliği ile ilgili kromozom 5’te elde
edilen QTL bölgesi ... 101 ġekil 4.26 F2:3 populasyonunda 100 tohum ağırlığı ile ilgili kromozom 5’te elde
edilen QTL bölgesi ... 102 ġekil 4.27 F2:3 populasyonunda tohum uzunluğu ile ilgili kromozom 5 ikinci
bölgede elde edilen QTL bölgesi ... 103
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ
Çizelge 1.1 Kabuğu soyulmamıĢ 100 g hıyarın besin içeriği (https://www.usda.gov/ 2016a) ... 6 Çizelge 2.1 Yaygın olarak kullanılan bazı markır sistemlerinin özellikleri ... 11 Çizelge 3.1 Ġncelenen özellikler açısından 7088D x Coolgreen RIL ve F2:3
populasyonunun farklı çevresel koĢullarda yetiĢtirlmesi ... 37 Çizelge 3.2 dCAPs markırı kesim enzimi ve sıcaklık istekleri ... 45 Çizelge 3.3 Coolgreen X 7088D RIL populasyonunda kullanılan 55 adet SSR
markırın dizilimleri ... 47 Çizelge 3.4 Coolgreen X 7088D RIL populasyonu bağlantı analizinde kullanılan
markır sayıları ... 48 Çizelge 3.5 F2:3 populasyonunda hedef QTL’lerin alanını daraltmak için
geliĢtirilen markırların isimleri ve bilgileri ... 50 Çizelge 4.1 Ebeveyn hatlar, F1 ve F2:3 populasyonunun çimlenme yüzdesi ve
kökçük uzunluğu ile ilgili ortalama ve standart sapma değerleri ... 57 Çizelge 4.2 RIL populasyonu düĢük sıcaklıkta çimlenme yüzdesi ve kökçük
uzunluğu ile ilgili Pearson korelasyon analiz sonucu ... 57 Çizelge 4.3 Ebeveyn hatlar, F1 ve F2:3 populasyonunun tohum özellikleri ile ilgili
ortalama ve standart sapma değerleri ... 58 Çizelge 4.4 RIL populasyonu tohum uzunluğu, geniĢliği ve 100 tohum ağırlığı
ile ilgili tanımlayıcı istatistik değerleri ... 60 Çizelge 4.5 RIL ve F2:3 populasyonlarındaki tohum özellkleri ile ilgili Pearson
korelasyon analiz sonucu ... 68 Çizelge 4.6 RIL populasyonu tohum uzunluğu, geniĢliği, 100 tohum ağırlığı ve
düĢük sıcaklıkta çimlenme özellikleri ile ilgili QTL sonuçları ... 72
1. GĠRĠġ
Cucurbitaceae (kabakgiller) familyası Cucumis (hıyar, kavun, acur), Cucurbita (sakız kabağı, bal kabağı, süs kabağı, kestane kabağı), Citrullus (karpuz), Lagenaria (su kabağı) gibi ekonomik olarak önemli sebzelerin olduğu 134 cins ve 965 türden oluĢmaktadır (http://www.theplantlist.org 2013). Cucumis L. cinsine ait sıcak bölgelerde yayılıĢ gösteren 30 tür olmasına rağmen ülkemizde Cucumis melo L. (kavun) ve Cucumis sativus L. (hıyar) yaygın olarak yetiĢtirilmektedir (Engin 1991).
Dünya’da tropik ve subtropik bölgelerde yetiĢtiriciliği yapılabilen hıyarın (Robinson ve Decker-Walters 1999) 2016 yılı dünya hıyar üretimi 80.616.692 ton olup, üretimde ilk üç sırayı 61.899.582 ton ile Çin, 1.992.968 ton ile Rusya, 1.811.681 ton ile Türkiye izlemektedir (http://www.fao.org/faostat/en/#home 2016b). Ülkemizde ise; baĢta Akdeniz ve Ege bölgesi olmak üzere her bölgede üretilmekte olup, 2017 yılı toplam hıyar üretimimiz 1.827.782 ton olarak belirlenmiĢtir. Bu üretimin 1.687.927 tonu sofralık, 139.855 tonu turĢuluk olarak değerlendirilmektedir. Bu üretimin yaklaĢık % 61’i örtü altı üretimden elde edilmektedir (http://www.tuik.gov.tr/Start.do 2017).
Dünyada Taze ve dondurulmuĢ sofralık ve turĢuluk hıyar ihracat rakamlarına bakıldığında ilk beĢ sırada sırası ile 635.240.000 $ ile Ġspanya, 485.360.000 $ ile Meksika, 482.643.000 $ ile Hollanda, 228.238.000 $ ile Kanada ve 59.457.000 $ ile Amerika BirleĢik tevletleri yer almaktadır. Ülkemiz ise dünya ihracatında 33.825.000
$’lık pazar payı ile 8. sırada yer almaktadır (ġekil 1.1) (https://www.trademap.org/
2017).
Taze ve dondurulmuĢ sofralık ve turĢuluk hıyar ithalat rakamlarında ise ilk beĢ ülke sırası ile 731.618.000 $ ile Amerika BirleĢik Devletleri, 545.993.000 $ ile Almanya, 183.535.000 $ ile BirleĢik Krallık, 146.484.000 $ ile Rusya Federasyonu ve 132.080.000 $ ile Hollanda’dır (ġekil 1.2) (https://www.trademap.org/ 2017).
ġekil 1.1 Dünya hıyar ihracat rakamları (https://www.trademap.org/ 2017)
ġekil 1.2 Dünya hıyar ithalat rakamları (https://www.trademap.org/ 2017)
Hıyar bitkisi; kültürü yapılan (C. s. var. sativus), yarı yabani olan Xishuangbanna (C. s.
var. xishuangbannanesis), Sikkim (C. s. var. sikkimensis) ve yabani hıyar (C.s. var.
hardwickii) olmak üzere 4 varyete olarak tanımlanmıĢtır (Royle 1839, Hooker 1876, Qi ve Yuan 1983). C. sativus var. hardwickii kültürü yapılan hıyar bitkisinin atası olarak bilinmekte olup kökeninin Himalayalar ve yakın bölgelerdeki dağların doğu kuĢakları olduğuna inanılmaktadır (Zohary 2012, Yang vd. 2014a). Yabani hıyar bitkisinin en az 3000 yıl önce Hintliler tarafından Hint-Ganj ovasında kültüre alındığı fosil ve yazınsal kanıtlarda belirtilmektedir (De Candolle 1886). Hıyarın Hindistan’dan Asya’nın geri kalanına ve Avrupa’ya insanlar aracılığıyla gittiği Amerika’ya ise muhtemelen koloniler tarafından ulaĢtığı düĢünülmektedir (Nayar ve More 1998, Robinson ve Decker-Walters 1999) (ġekil 1.3).
ġekil 1.3. Hıyar bitkisinin anavatanı ve tahmini yayılıĢ güzargahı
Dünya’nın çeĢitli gen bankalarından toplanan toplam 3342 hıyar aksesyonu 23 polimorfik SSR markı ile taranmıĢ ve bu germplazmın coğrafik olarak a) Çin, b) Amerika, Avrupa, Merkez ve Batı Asya ve c) Hindistan ve Xishuangbanna (Güneybatı
Hıyar; ılıman iklim koĢullarında yetiĢebilen, yetiĢmesi için optimum 30 oC gündüz ve 18-21 oC gece sıcaklığı isteyen termofilik bir sebzedir. Optimum verim için yüksek yoğunlukta güneĢ ıĢığına ihtiyaç duyar. Bazı çeĢitler gün uzunluğuna hassas olup, kısa gün uzunluğu genellikle vejetatif büyümeyi ve diĢi çiçek oluĢumunu tetiklemektedir. Ġyi drene olmuĢ ve havalanmıĢ pH 6.0-7.0 arası kumlu, siltli, killi-tınlı ve organik maddece zengin topraklarda iyi yetiĢmektedir (Lim 2012).
Hıyar meyvesi; farklı renklerde, Ģekilde, uzunlukta ve çapta olmakla birlikte meyveleri olgunaĢmadan önce hasat edilmektedir (Robinson ve Decker-Walters 1999).
Çoğunlukla taze tüketim (slicer) ve turĢu sanayi (pickling) için yetiĢtirilmektedir (Nayar ve More 1998, Robinson ve Decker-Walters 1999). Küçük meyveli çeĢitlerin genç meyveleri korniĢon (gherkin) olarak adlandırılmaktadır (Lim 2012). Dünya üzerinde farklı tercih ve tüketim alıĢkanlıklarına göre üretimi yaygın olarak yapılan çeĢitli market tipi hıyarlar vardır. Bunlar; Kuzey Amerika turĢuluk tip (North American processing type), Kuzey Amerika sofralık tip (Nort American slicing type), Kuzey Çin sofralık tip (Northern China fresh market type) ve Avrupa sera tipi (European greenhouse type) olarak belirtilmektedir (Wang 2017).
Hıyar bitkisi; sülükleri olan sürünücü ya da tırmanıcı özelliğe sahip, yaprakları tüylü tek yıllık bir sebzedir (Robinson ve Decker-Walters 1999, Lim 2012). Çiçek yapısı çeĢitlere göre farklılık göstermekle birlikte, bazı çeĢitler sadece diĢi çiçek (gynoecious), bazı çeĢitler diĢi ve erkek çiçeklerden (monoecious), bazı çeĢitler ise çok sayıda erkek ve az sayıda hermafrodit (andromonoecious) çiçeklerden oluĢmaktadır (Robinson ve Decker- Walters 1999). Sadece diĢi çiçeklerin olduğu çeĢitler örtü altı üretiminde yaygın olarak kullanılmakla birlikte, erkek çiçeğe gereksinim duymadan partenokarpik meyve oluĢumu meydana gelmektedir (Bayraktar 1970, Baloğlu 2016).
Taze ve turĢuluk tüketiminin yanı sıra hıyar, besin değerleri ve tıbbi özelliklerinden dolayı model bir bitkidir (Nayar ve More 1998, Robinson ve Decker-Walters 1999).
YatıĢtırıcı, temizleyici ve yumuĢatıcı özelliklerinden dolayı kozmetik sanayi için (Wang vd. 2007), düĢük Ģeker içeriği ve idrar söktürücü özelliğinden dolayı insan sağlığı için (Nayar ve More 1998) kullanılmaktadır. Ġçerdiği enzimler sayesinde kan pıhtılaĢması ve
yaraların iyileĢmesinde yardımcı olabilmektedir (Nafeesa vd. 2015). Steroid içeriğinden dolayı Cucurbitacinler pestisit olarak kullanılmaktadır (Wang vd. 2007). Ayrıca Cucurbitacin-C yalnızca kültürü yapılan hıyar bitkisinde tespit edilmiĢtir (Enslin ve Rehm 1958). Kabakgiller içerisinde antioksidan aktivesi açısından Cucumis sativus, Citrullus colocynthis ve Momordica charantia türleri incelenmiĢ ve en yüksek antioksidan aktivite içeriğinin hıyar bitkisinde olduğu saptanmıĢtır (Ibrahim vd. 2010).
Yapılan çalıĢmalarda 100 g hıyar (C. sativus) meyvesinin besin değeri çizelge 1.1’deki gibi belirlenmiĢtir (https://www.usda.gov/ 2016a).
Ekonomik olarak önemli olan kabakgiller familyasında kavun (2n=24), kabak (2n=40) ve karpuza (2n=22) göre, hıyar bitkisi (2n=14) daha az kromozoma sahiptir (Nayar ve More 1998, Robinson ve Decker-Walters 1999). Tahmin edilen genom büyüklüğü ise 367 Mb olarak tespit edilmiĢ (Arumuganathan ve Earle 1991) ve genomu dizilenen yedinci model bitki olmuĢtur (Huang vd. 2009).
Hıyar bitkisinde; yüksek çözünürlüklü genetik haritalama, tüm genom analizi, bazı özelliklerle ilgili aday genlerin tanımlaması, QTL (quantitative trait loci) haritalama ve bağlantı haritalama çalıĢmalarında moleküler markır sistemleri etkin olarak kullanılmaktadır. SRAP markırı (Yeboah vd. 2007, Meng vd. 2012), RAPD ve SCAR markırı (Ding vd. 2007), SSR markırı (Fukino vd. 2008, Zhang vd. 2008, Watcharawongpaiboon ve Chunwongse 2008, Weng vd. 2010, Li vd. 2011a, Miao vd.
2011a, Amano vd. 2013), AFLP markırı (Witkowicz vd. 2003, Bae vd. 2006), SSR, CAPs, dCAPs ve InDel (Miao vd. 2016), SNP markırı (Wang vd. 2018) yaygın olarak kullanılmaktadır.
Çizelge 1.1 Kabuğu soyulmamıĢ 100 g hıyarın besin içeriği (https://www.usda.gov/2016a)
BileĢen Birim Miktar
Su g 95.23
Enerji kcal 15
Protein g 0.65
Toplam yağ g 0.11
Karbonhidrat g 3.63
Toplam lif g 0.5
Toplam Ģeker g 1.67
Mineral
Ca mg 16
Fe mg 0.28
Mg mg 13
P mg 24
K mg 147
Na mg 2
Zn mg 0.2
Vitamin
Vitamin C mg 2.8
Tiamin mg 0.027
Riboflavin mg 0.033
Niasin mg 0.098
Vitamin B6 mg 0.04
Folik asit µg 7
Vitamin B12 µg 0
Vitamin E mg 0.03
Vitamin K µg 16.4
Yağ
DoymuĢ yağ asitleri g 0.037
Tekli doymamıĢ yağ asitleri g 0.005
Çoklu doymamıĢ yağ asitleri g 0.032
Trans yağ asitleri g 0
Kolesterol mg 0
Diğer
Kafein mg 0
Biyotik ve abiyotik stresler dünyada bitki üretimini kısıtlayan önemli faktörlerdendir.
Zararlı ve patojenler biyotik stres faktörleri iken, kuraklık, sıcaklık, tuzluluk, soğuk, kirlilik ve toprak pH’sı abiyotik stres faktörleri olarak tanımlanmaktadır (Oerke vd.
2001, Bashier vd. 2007).
DüĢük sıcaklık stresi tarımsal üretimi kısıtlayan en önemli abiyotik stres faktörlerinden biridir (Perveen vd. 2013). Toprak sıcaklığının istenilen değerlerde olmaması tohumlarda çimlenme ve fide oluĢumunu olumsuz yönde etkilemekte bu da üretimi azaltmaktadır (Wehner ve Kozik 2007).
DüĢük sıcaklığın etkisini azaltmak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biri örtü altında yetiĢtiricilik ve ısıtma yapmaktır. Özellikle kıĢ aylarında bitkilerin düĢük sıcaklıktan etkilenmemesi için sera içi sıcaklığı yaklaĢık 10 °C’ye getirmek gerekmektedir. Bu durum üretici açısından yüksek maliyetli bir uygulama olup üretim maliyetlerini artırmaktadır.
Hıyar tropikal iklimlere özgü bir bitki olmasına rağmen, dünyada hemen hemen her yerde yetiĢtirilmektedir. Hıyar bitkisi normal koĢullarda 24-28 °C sıcaklıkta çimlenen, düĢük sıcaklıklara hassas bir bitkidir (Staub ve Wehner 1996). DüĢük sıcaklıklarda çimlenme yeteneği erkenci ürün elde edebilmek için önemli bir genetik özelliktir.
Erkenci hıyar üretimi için en iyi stratejilerden biri düĢük sıcaklarda çimlenme kabiliyetine sahip hıyar çeĢitlerinin geliĢtirilmesidir. Erken dönemde yetiĢtirilebilen hıyar fideleri, ürünün hasat süresini ve taze olarak toplanan turĢuluk hıyarların yetiĢtirme sezonunun uzamasına yardımcı olabilmektedir. DüĢük sıcaklıkta çimlenme yeteneği, erken hasat olasılığı ve hastalıklardan kaçınmada etkili olabilmektedir (Kłosińska vd. 2013).
Kuzey bölgelerde yetiĢtirme sezonunun kısalığı taze hıyar üretimini sınırlamaktadır.
Ancak erken ekim yapmak toprak sıcaklığının düĢük olmasından dolayı tohumun çimlenmesini olumsuz etkilediğinden dolayı kalıcı bir çözüm değildir. Bu nedenlerden dolayı birçok hıyar ıslah programında, düĢük sıcaklıklarda çimlenme yeteneği yüksek
Eğer hıyarda düĢük sıcaklıklarda çimlenme yeteğine sahip çeĢitler fide aĢamasındaki düĢük sıcaklığa da tolerant olursa bu durum erken ilkbaharda uniform bir bitki geliĢiminin yanı sıra yetiĢtirme sezonunun da uzamasına olanak sağlayabilmektedir (Wehner 1984).
Tüm bu nedenlerden dolayı genetik kaynakların taranması ve düĢük sıcaklığa tolerant bireylerin belirlenerek çeĢit ıslahında değerlendirilmesi son derece önem arz etmektedir.
Tarama (screening) çalıĢmaları aynı zamanda ülkesel gen havuzlarının değerlendirilmesi açısından da son derece önemlidir. Gen havuzlarının hızlıca taranmasında istenilen karakter ile morfolojik bağlantılı özelliklerin bulunması büyük avantaj sağlamaktadır. Karpuzda önceden yapılan çalıĢmalarda tohum iriliği ve kotiledon büyüklüğü ile tuza tolerans arasında pozitif bir korelasyon bulunduğu belirtilmiĢtir (YaĢar vd. 2011, Üzal ve YaĢar 2017).
QTL haritalama çalıĢmaları, Markır Destekli Seleksiyon (MAS) için temel oluĢturmaktadır (Soller 1991). Klasik sebze ıslahında verim, hastalık ve zararlılara dayanaklılık, biyotik ve abiyotik stres faktörleri gibi çok gen tarafından kontrol edilen özelliklerin ıslahı uzun zaman almakta ve iĢ gücü ihtiyacının artmasına neden olmaktadır. Bitki biyoteknolojisinde, moleküler markır tekniklerindeki artıĢ ve bu yöntemlerin yaygın olarak kullanımı iĢ gücü ve zamana olan ihtiyacın azalmasında önemli bir etkendir. Markır destekli seleksiyon ile ilgili fenotipik özellik, klasik ıslah çalıĢmalarına nazaran daha kısa sürede ve daha az iĢgücü ile belirlenebilmektedir (Gupta ve Rustgi 2004). Ġstenilen özelliğin varlığı, gen veya gen bölgesini gösteren moleküler markırların belirlenmesi markır destekli seleksiyonun uygulanabilmesi için elzemdir.
Bitkilerde ekonomik olarak önemli olan fenotipik özellikler büyük çoğunlukla çoklu gen bölgeleri tarafından kontrol edilmekte olup, çevresel faktörler tarafından etkilenmektedir. Bu özelliklerin seçiminde markır destekli seleksiyon yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır (Göl 2015, Kumar vd. 2015).
Abiyotik strese dayanım tek genle değil birden fazla genin ortaklaĢa etkileri ile kontrol edilmektedir. Bu nedenle tek bir markır geliĢtirmek yeterli olmayıp etkili gen bölgesinin tanımlanması gerekmektedir. Bitkilerde verim ve verim unsurları, hastalık ve zararlılara dayanaklılık, çiçeklenme zamanı gibi birçok özellik kantitatif olarak kontrol edilmekte olup QTL terimi buradan gelmektedir (ĠĢçi 2008).
Bu çalıĢmanın nihai hedefleri; hıyar ıslahında düĢük sıcaklıklarda çimlenme yeteneğine sahip hatların seçimi ile 100 tohum ağırlığı, tohum uzuluğu, tohum geniĢliği ile ilgili gen bölgelerinin tespiti ve bağlantılı markırların keĢfidir. Fakat hıyarda düĢük sıcaklıklarda çimlenme yeteneğinin genetik mekanizması tam olarak anlaĢılamamıĢ ve markır destekli seleksiyonda kullanılacak moleküler markırlar henüz belirlenmemiĢtir.
Bu markırların keĢfi; gen havuzunda varyasyona sahip yerel populasyonların ve çekirdek koleksiyonlarının markır destekli seleksiyon yardımıyla düĢük sıcaklık toleransı olan hıyar genotiplerinin belirlenerek ıslah programlarında kullanılmasına imkan sağlayacaktır. Planlanan tez çalıĢması düĢük sıcaklıkta çimlenme özelliği ve tohum iriliği ile ilgili özellikler olmak üzere iki ana kısımdan oluĢmaktadır. Bu ana hedefe yönelik olarak tezin amacı; hıyarda düĢük sıcaklıkta çimlenme özelliklerinden olan düĢük sıcaklıkta çimlenme oranı ile kökçük uzunluğu ve tohum iriliği özelliklerinden olan tohum uzunluğu, geniĢliği ve 100 tohum ağırlığı ile ilgili QTL gen bölgelerinin belirlenmesi ve aday genlerin tespit edilmesidir.
2. KAYNAK ÖZETLERĠ
2.1 Moleküler Markır Sistemleri ve QTL Haritalama
Bitkilerin tanımlanmasında morfolojik, biyokimyasal ve moleküler olmak üzere üç gruba ayrılan markır yöntemlerinden yararlanılmaktadır. Morfolojik markırlar;
bireylerin ayrımında kullanılan gözleme dayalı uygulaması kolay ve ucuz olan bir sistemdir. DüĢük polimorfizm göstermesi, çevresel koĢullardan etkilenmesi ve bitkinin büyüme dönemlerindeki değiĢimlerden etkilenmesi morfolojik markırların dezavantajları olarak belirtilmektedir (Eagles vd. 2001). Biyokimyasal markırlar;
organizmalar arasındaki polimorfizmi protein ve protein düzeyinde belirleyen markırlar olup izozim ve allozimler en yaygın olarak kullanılan biyokimsal markırlardır (Staub vd. 1982). Polimorfizmin düĢük olması ve çevresel faktörlerden etkilenmesi biyokimyasal markır sistemlerinin dezavantajıdır (Mondini vd. 2009). Moleküler markırlar ise; DNA düzeyinde polimorfizim gösteren, genomda oluĢan mutasyonlar, baz eklenmesi veya silinmesi, DNA replikasyonu sırasında meydana gelen hatalar sonucunda oluĢan, çevresel faktörlerden etkilenmeyen, kodominant ve dominant yapıda olan markır sistemleridir (Williams vd. 1990, Collard vd. 2005). Birçok moleküler markır sistemi yaygın bir Ģekilde bitki türlerinde kullanılmakla birlikte her sistemin kendi arasında avantaj ve dezavantajları bulunmakta olup çizelge 2.1’de derlenerek bir araya getirilmiĢtir.
Canlının herhangi bir kısmından alınan az miktardaki doku parçası tüm genomun analizi için gerekli olan DNA’yı elde etmede yeterlidir (Botstein vd. 1980). Moleküler markırlar, canlı genomunda rastgele bir gen bölgesi ya da belirli bir gen bölgesi ile iliĢkili DNA parçası olarak adlandırılmaktadır. Bir canlı grubunda bir özelliğin veya genin birden farklı allelik formları bulunmaktadır. Moleküler markırlar, DNA’daki polimorfik bölgerin tespit edilmesi prensibine dayanmaktadır (Yorgancılar vd. 2015).
Moleküler markırlar çevresel koĢullardan etkilenmez, kodominant veya dominant özelikte olabilir ve tüm dokularda ortaya çıkabilirler (Wiliams vd. 1990).
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) DNA’nın nanogram boyutlarındaki miktarının enzimatik in vitro çoğaltım yöntemi ile milyonlarca kez kopyalanması iĢlemi olarak
tanımlanmaktadır (Weising vd. 1995). PCR’ın keĢfi ile birlikte (Mullis ve Faloona 1987) farklı organizmalarda farklı amaçlarda kullanılması, hızlı ve basit bir yöntem olması moleküler biyolojide yeni geliĢmelere neden olmuĢtur (Weising vd. 1995).
PCR’a dayalı moleküler tekniklerden olan mikrosatellitler (SSR-Simple Sequence Repeats) canlı organizma genomunda genellikle 1-6 baz çifti (bp) uzunluğunda olan DNA tekrarlarıdır. PCR temelli olan bu markır sistemi; DNA replikasyonu sırasında oluĢan yanlıĢ baz eĢlemesi, dizi atlama ve eĢit olmayan parça değiĢimi ile polimorfizimi oluĢturmakta ve polimorfizm jel elektroforeziyle tespit edilmektedir (Matsuoka vd.
2002). Kodominant bir markır olması, canlı genomunda bol ve farklı yerlerde bulunması, tekrarlanabilirliği, yüksek polimorfizm içermesi, az DNA gerektirmesi ve bilgilendirici bir markır olması gen haritalama çalıĢmalarında ve populasyon genetiğinde etkin olarak kullanılmasına neden olmaktadır (Powell vd. 1996).
Aynı türe ait bireylerin genomları arasında görülen tek nükleotid farklılıkları Single Nucleotide Polymorphism (SNP) olarak adlandırılmaktadır. Bir DNA dizisine bir veya birden fazla nükleotid eklenmesi (insersiyon) veya silinmesi (delesyon) sonucu meydana gelen nükleotid farklılıkları SNP’lerin oluĢmasında neden olan baĢlıca etmenlerdir (Twyman 2005). Canlı genomunda en çok rastlanan farklılık olan SNP’ler, populasyon içerisindeki bireylerde doğal olarak allel alternatiflerinin meydana gelmesine neden olmaktadır (Liao ve Lee 2010).
Çizelge 2.1 Yaygın olarak kullanılan bazı markır sistemlerinin özellikleri
Markır Sistemi
PCR gereksinimi
Polimorfizim seviyesi
Dominantlık
durumu Maliyet Yeniden
üretebilirlik
Dizileme gereksinimi
RAPD Evet Çok yüksek Dominant DüĢük Yüksek Yok
RFLP Hayır Orta Kodominant Yüksek Yüksek Evet
AFLP Evet Yüksek Dominant Yüksek Orta Yok
SSR Evet Yüksek Kodominant Yüksek Yüksek Evet
ISSR Evet Yüksek Dominant Yüksek Orta-Yüksek Yok
SNP Evet Yüksek Kodominant DeğiĢken Yüksek Evet
CAPS Evet Yüksek Kodominant DüĢük Yüksek Evet
dCAPS Evet Yüksek Kodominant DeğiĢken Yüksek Evet
InDel Evet Yüksek Kodominant DüĢük Yüksek Evet
DNA molekülünde meydana gelen insersiyon ve delesyon (InDel) olayları sonucu oluĢan farklılıkların tespitinde InDel markır sistemi kullanılmaktadır. Ko-dominant markır sistemi olan InDel kolayca tespit edilebilen, iĢ gücü ve zaman tasarrufu sağlayan bir markır sistemidir. Ayrıca fragment uzunluğu farklılığını tespit edebilen, agaroz jelde görüntülenebilen ve haritalama populasyonlarında düĢük maliyetli bir sistem olması sebebiyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca InDel markırları bitkilerin genetik analizinde etkili bir Ģekilde kullanılan, SSR ve SNP markırları gibi sekans tabanlı sistemlerin önemli bir tamamlayıcısı olarak baĢvurulan bir sistemdir (Das vd. 2015).
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) markırları; haritalama populasyonlarında bireyler arasındaki polimorfizmi belirlemek amacıyla, aynı büyüklükteki DNA’nın restriksiyon enzimleri ile kesilmesi sonucu oluĢmaktadır. Farklı noktalardan kesilen DNA parçaları büyüklüğüne göre farklı bantlar oluĢturmakta ve böylece polimorfizm ortaya çıkmaktadır. CAPS markırı kodominant ve lokus spesifiktir. Bireyler arası kolay skorlanır ve yorumlanır ayrıca bir radyoaktif boyama gerektirmez. Bu markırı geliĢtirmek için ilgili bölgenin sekans bilgisine ihtiyaç duyulmaktadır (Konieczny ve Ausubel 1993).
Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (dCAPS) markırları, CAPS markırlarının modifiye edilmiĢ halidir ve ebeveynler arası tek nükleotid farklılığını veya mutasyonu belirlemek için kullanılır. Bu markır sisteminde tasarlanan primer, ebeveynler arasında bir veya birden fazla eĢleĢmeyen nükleotit farklılığının kesim enzimleri tarafından kesilmesiyle polimorfizm oluĢmaktadır. dCAPs markırı kolay, ucuz, PCR ile yapılabilen ve jel elektroforezi ile görüntülenebilen bir sistemdir (Neff vd. 1998).
Mayoz bölünmenin profaz I safhasında meydana gelen, çift halde bulunan homolog kromozomların kardeĢ olmayan kromatidleri arasında yaptığı parça değiĢimine krossing-over adı verilmektedir. Dünya üzerinde bütün canlılarda meydana gelen çeĢitliliğin kaynağı bu parça değiĢimidir. Mendel yasalarına göre, kromozomlar üzerinde bulunan genler birbirinden bağımsız olarak gamet hücrelerine geçmektedirler.
Thomas Hunt Morgan sirke sinekleri üzerinde yaptığı araĢtırmada; sineklerdeki kanat özellikleri ve göz renginin mendel kuralından farklı olduğunu fark etmiĢ ve genetik linkage (bağlantı) kavramı ilk kez ortaya çıkmıĢtır (Morgan 1910, Morgan 1911).
Kromozomlar üzerinde birbirine yakın olan genler parça değiĢimi sırasında birlikte hareket ediyorsa bu genlere ‘bağlı gen’ (linked gene), bu genlerin oluĢturduğu gruba
‘bağlantı grubu’ (linkage group) ve bu olaya ise ‘linkage’ adı verilmektedir (Erensayın 2000).
Yeni gametlerin oluĢumu esnasında krossing-over meydana gelmiĢ ise oluĢacak yeni gametlerden bazıları ebeveynlere benzeyecek (parental), bazıları ise ebeveynlerden farklı (rekombinant) olacaktır. Bu durum ise rekombinasyon olarak tanımlanmaktadır.
Rekombinasyon sonucu ebeveynlere benzeyen bireylerin sayısı benzemeyenlere göre sayıca daha fazla olmaktadır. Rekombinant bireylerin toplam birey sayısına oranı rekombinasyon frekansını ‘RF’ (krossing-over oranı) vermektedir ve bu oran θ ile gösterilmektedir (Sturtevant 1913, ÖzĢensoy ve Kurar 2013). RF eğer % 0-50 arasında ise iki gen birbirine bağlı (linked) ve aynı grupta, eğer θ > % 50 ise bu iki gen arasında bağlantı yok ve farklı grup veya kromozomda bulunmaktadırlar (Sturtevant 1913, Beckmann 1994, Griffiths vd. 2005).
Kromozomlar üzerinde, genlerin ve markırların bulunduğu yerlerin tespiti ve birbirleri ile olan uzaklıklarının belirlenmesine genetik haritalama denilmektedir (ÖzĢensoy ve Kurar 2013). Bir kromozom üzerinde bulunan genler arası mesafe azaldıkça bu genler arası krossing-over olma olasılığı azalmakta, mesafe artıkça bu olasılık artmaktadır.
Bağlı genlerin kromozomlar üzerindeki diziliĢlerinin ve bu genler arası mesafenin hesaplanmasıyla genetik bağlantı haritaları oluĢturulmaktadır (Passarge 2000). Bağlantı haritalarındaki genlerin birbirleri arasındaki mesafe harita birimi olarak ifade edilir ve Thomas Hunt Morgan’a ithafen (M) olarak belirtilmektedir. 1 centimorgan (cM) % 1 (0.01 θ) rekombinasyon frekansı olarak ifade edilmektedir. 1 cM fiziksel olarak 1 milyon baz çiftini tanımlamaktadır (Liu 1998, Kappes 1999, ÖzĢensoy ve Kurar 2013).
Ġki gen lokusunun birbirine bağlı olma olasılığının, bağlı olmama olasılığına oranı
1955). LOD skor 3 ve üzerinde ise aranılan genin test edilen kromozom lokusundaki markıra bağlantı gösterme olasılığı anlamlı olarak kabul edilirken, 2 ve aĢağı değerler bağlantı olmadığını belirtmektedir (Akarsu ve Lüleci 2002).
QTL haritalama için gerekli olan aĢamalar Dhingani vd. tarafından aĢağıdaki gibi belirlenmiĢtir:
1- Fenotipik olarak birbirine zıt iki ebeveynden uygun haritalama populasyonunun geliĢtirilmesi ( örneğin: hastalığa dayanıklı ve hassas ebeveynlerin seçimi), 2- Uygun markır sisteminin seçimi ve doygun bağlantı haritasının geliĢtirilmesi, 3- Haritalama populasyonunun markırlar ile taranması ve genotipik verilerin
toplanması,
4- Genotipik ve fenotipik verileri kullanarak bağlantı analizini gerçekleĢtirmek için uygun istatistiksel programların kullanılması (Dhingani vd. 2015).
QTL haritalamanın tüm aĢamaları Nadeem vd.’nin yapmıĢ olduğu çalıĢmadan uyarlanarak Ģekil 2.1’de belirtilmiĢtir.
ġekil 2.1 QTL haritalama metodolojisi (Nadeem vd. 2017)
QTL Haritalama
Birbirinden farklı ebeveynlerin
seçimi
Haritalama populasyonunu n oluşturulması
Fenotipik verilerin toplanması
Genotipik verilerin toplanması Genetik haritanın
oluşturulması QTL bölgelerinin
tanımlanması
QTL bölgelerin doğrulanması
Kontrollü melezleme ile elde edilen (ebeveynlerin belli olduğu) ve doğada hiçbir müdahale olmadan elde edilen populasyonlar (ebeveynleri belli olmayan) olmak üzere iki populasyon türü genetik linkage analizlerinde haritalama populasyonu olarak kullanılmaktadır. Kontrollü populasyonda ebeveynlerin fenotipik ve genotipik olarak birbirinden farklı özelliklere sahip olması gereklidir (ÖzĢensoy ve Kurar 2013).
Haritalama populasyonları; F1’lerin kendilenmesiyle elde edilen F2 populasyonu, F1’lerin ebeveynlerden biri ile geri melezlenmesi ile elde edilen geri melez (BC) populasyonu, F2 bitkilerinin 7-8 generasyon kendilenmesi ile eldilen (ġekil 2.2) rekombinant kendilenmiĢ hatları (RILs), geri melez populasyonunun en az 6 kez seçilen ebeveyn ile melezlenmesinin ardından elde edilen geri melezin kendilenmesiyle oluĢan yakın izogenik hatları (NILs) ve F1’in polenlerinin katlanmasıyla elde edilen katlanmıĢ haploid (DH) hatlardan oluĢmaktadır (Babu vd. 2004, Glover vd. 2004, Dhingani vd.
2015).
Haritalama populasyonunun seçimi; bağlantı haritasının baĢarısına, çalıĢmanın amacına, moleküler markırın dominant ya da kodominant olmasına, zamana ve kaynakların varlığına göre değiĢiklik göstermektedir. F2, RIL, NIL, BC ve DH populasyonları bitki türlerinde haritalama populasyonu olarak kullanılabilir ve her populasyon tipinin avantaj ve dezavantajı vardır (Paterson 1996).
F2 populasyonunun en önemli avantajı; spesifik lokusta eklemeli (additive) ve baskın (dominance) gen etkisinin ölçülebilir olması ve ayrıca bu populasyonun kısa bir zamanda kolay bir Ģekilde oluĢturulmasıdır. RIL ve DH populasyonlarının avantajı ise;
genetik değiĢime gereksinim duyulmaksızın homozigot hatların çoğaltılması ve homozigot lokuslara sahip olmasından dolayı eklemeli gen etkisinin ölçülebilmesidir.
RIL ve NIL populasyonlarının dezavantajı ise; populasyonların geliĢtirilebilmesi için uzun zamana gereksinim duymasıdır. F2 ve BC populasyonları genetik yapılarının heterezigot olması, tohumla aynı genetik yapıya sahip bitkilerin yeniden üretilememesinden dolayı geçici populasyonlar olarak isimlendirilmektedir. Bunların aksine; RIL, NIL ve DH populasyonları kalıcı populasyonlardır ve yeniden üretilip çoğaltılabilirler (He vd. 2001).
ġekil 2.2 RIL haritalama populasyonunun Ģematik gösterimi (Kutlu 2014’den değiĢtirilerek)
Moleküler markırların seçimi; haritalama populasyonunun yapısına göre avantaj ve dezavantajlar sağlamaktadır. Kodominant markırlar, dominant markırlarla kıyaslandığında F2 populasyonunda daha fazla genetik bilgi elde edilmesine olanak sağlamaktadır. RIL, NIL ve DH populasyonlarının tüm lokusları neredeyse homozigot olmasından dolayı dominant markırlar, kodominant markırlar kadar bilgi elde edilmesine imkan vermektedir (Burr vd. 1988, Dhingani vd. 2015). BC populasyonunda tekrarlanan ebeveynin (recurrent) genetik yapısının homozigot, donör ile tekrarlanan ebeveynin farklı allellere sahip olması durumunda dominant markırlar kullanılabilmektedir (Reiter vd. 1992).
Bitkilerde kalitatif ve kantitatif olmak üzere iki tip kalıtımsal özellik bulunmaktadır.
Kantitatif karakterler sürekli varyasyon gösterirken, kalitatif karakterler sürekli varyasyon göstermezler. Kalitatif karakterler genellikle tek veya birkaç gen tarafından kontrol edilirken, kantitatif karakterler çok gen tarafından kontrol edilmektedir (Khan 2015). Verim, kalite, hastalıklara dayanıklılık gibi birçok tarımsal özellik çok gen tarafından kontrol edilmektedir. Bu genler 1949 yılında Mather tarafından poligen olarak isimlendirilmiĢtir (Mather 1949). Poligenler tarafından kontrol edilen özellikler ilk defa Gelderman tarafından QTL (kantitatif özellik lokusu) olarak isimlendirilmiĢtir (Gelderman 1975).
QTL haritalamanın amaçları aĢağıdaki gibi tanımlanabilir (Khan 2015):
1- AraĢtırılan kantitatif özelliği etkileyen gen bölgelerini tanımlamak ya da bu özellik üzerindeki etkisini analiz etmek,
2- QTL bölgelerinin araĢtırılan özellik üzerindeki etkisini analiz etmek,
3- Kantitatif özellikteki varyasyon miktarının ne kadarının belirlenen spesifik gen bölgesi tarafından etkilendiğini tespit etmek,
4- Tespit edilen QTL gen bölgelerinin hangi tip gen etkisi (eklemeli, dominant) tarafından etkilendiğini belirlemek,
5- AraĢtırılan özelliğin hangi alleller tarafından etkilendiğini saptamak
QTL haritalama çoğunlukla fenotipik varyasyondan sorumlu genetik bölgenin belirlenmesi için kullanılmaktadır (Wang 2017). Geleneksel QTL haritalama yöntemleri; Composite Interval Mapping (BileĢik aralık haritalama), Multiple–QTL Mapping (Çoklu-QTL Haritalama), Simple Interval Mapping (Basit Aralık Haritalama) ve Single Marker Analysis (Tek Markır Analizi) Ģeklinde sıralanabilir.
Basit aralık haritalama yöntemi (SIM) fenotip ile genotip arasındaki korelasyonun tek markır aralığındaki olasılığını test edilerek belirlenirken, BileĢik Aralık Haritalama (CIM) yönteminde her bir markır, kalan diğer markırları kofaktör olarak değerlendirerek doğrusal regresyon hesabı ile tespit edilmektedir (Wang 2017). CIM metodu en yaygın olarak kullanılan yöntem olup, doygun olmayan bağlantı haritalarında QTL bölgesinin tespitine ve ekstra bilgi elde edilmesine olanak sağlamaktadır (Zeng 1994, Zeng vd. 1999).
Çoklu-QTL Haritalama (MQM) yöntemi; maksimum olasılık (ML), sınırlandırılmıĢ maksimum olasılık (REML) algoritmalarını ve geri eleme (backward elimination) stratejisini kullanarak QTL bölgelerini tespit etmektedir (Arends vd. 2010, Arends vd.
2014). CIM yöntemi ile kıyaslandığında MQM birden çok QTL bölgesinin tespitinde güçlü bir yöntemdir. Ayrıca görünen fakat var olmayan (ghost) QTL bölgelerini azaltmada etkili bir yöntemdir (Wang 2017).
Tek Markır Analizi (SMA) markır regresyonu kullanılarak QTL bölgelerinin tespitini yapan basit bir yöntemdir. Her markır genotiplerine göre gruplandırılıp fenotipik ortalama ile F-testi yapılarak iliĢkili markır tespit edilir. Bu analizde bağlantı haritasına ihtiyaç yoktur. Bu yüzden aday genlerin tespiti için önemli markırların belirlenmesinde avantajlı bir yöntemdir (Wang 2017).
Yeni nesil sekanslama (Next Generation Sequencing-NGS) teknolojisi kullanılarak, genomik ve bitki ıslahı çalıĢmalarında yaygın olarak kullanılan dizileme tabanlı genotipleme analizlerinde yeni teknikler geliĢtirilmektedir (Göl 2015). Sekanslama ile genotipleme (Genotyping by Sequencing) GBS yöntemi bu tekniklerden biri olup, çok sayıda markır ile genetik çalıĢmalarda kullanılmaktadır (Kumar vd. 2012). Sekanslama
ile genotipleme (GBS) yöntemi, DNA fragmentlerinin kesim (restriksiyon) enzimleri ile kesilmesi sonucu elde edilen genomik parçaların yeni nesil dizileme teknolojisi ile sekanslanması esasına dayanmaktadır (Elshire vd. 2011, Kumar vd. 2012). Bu yöntem ile elde edilen SNP markırları ile yüksek doygunlukta bağlantı haritalarının oluĢturulması günümüzde yaygın olarak kullanılmaktadır (He vd. 2014).
Bitkilerde GBS yöntemiyle bağlantı haritası elde etmek için; haritalama populasyonunun oluĢturulması, NGS yöntemi ile yüksek çözünürlükte sekanslamanın yapılması, SNP markırlarının belirlenmesi, genotipleme ve bağlantı haritasının oluĢturulması aĢamaları takip edilmelidir (Deschamps vd. 2012).
Huang vd. (2009) tarafından genomu dizilenen ilk kabakgil ‘9930’ olarak isimlendirilen (Northern China fresh market type) hıyar hattıdır. Sanger ve Solexa ileri nesil sekanslama teknolojilerinin birleĢimi ile oluĢturulan ilk taslak dizileme 243.5 Mb olarak tespit edilmiĢ V1.0 olarak tanımlanmıĢtır (9930 draft genome assembly). Li vd. (2011b) Illumina GAII sekanslama sistemi ile ilk versiyonunu geliĢtirerek 9930 V2.0’yi oluĢturmuĢlardır (9930 genome assembly V2.0). Bu dizilemeye ek olarak ‘Gy14’
(North American pickling type) hattının genom dizilemesi Roche/454 teknolojisi kullanılarak 193Mb olarak tespit edilmiĢ olup, Gy14 assembly V1.0 olarak isimlendirilmiĢtir (Yang vd. 2012a).
2.2 DüĢük Sıcaklık Stresi
Domateste yapılan bir çalıĢmada RFLP markırları kullanılarak tohumların düĢük sıcaklıkta çimlenme yeteneğiyle ilgili QTL bölgeleri belirlenmeye çalıĢılmıĢ, çalıĢmada 119 BC1 domates tohumu ve 151 adet RFLP markırı kullanılarak 1. ve 4. kromozomda toplam 5 QTL bölgesi tespit edilmiĢtir (Foolad vd. 1998).
Foolad vd. (1999), domates üzerinde yaptıkları çalıĢmada tohumların tuz stresi ve düĢük sıcaklıkta çimlenme yeteneği ile ilgili QTL bölgelerini bulmayı amaçlamıĢlar, çalıĢmada
domates tohumlarını 11 °C’de çimlendirmiĢlerdir. ÇalıĢmanın sonunda domatesin 1, 4 ve 8. kromozomlarında toplam altı adet QTL bölgesi tespit ettiklerini bildirmiĢlerdir.
Teng vd. (2001), double haploid çeltik hatları ile 15 °C’de düĢük sıcaklıkta çimlenme yeteneğini araĢtırmıĢlardır. ÇalıĢmanın 8-11. günleri arasında kromozom 9’da ve eklemeli gen etkisi pozitif, 12-16 günleri arası kromozom 4’de ve eklemeli gen etkisi negatif olarak tespit edilmiĢtir. ÇalıĢmanın sonunda tespit edilen bu 2 QTL’in farklı aĢamalarda tespit edilmesinden dolayı düĢük sıcaklıkta çimlenme yeteneğinin komplex bir özellik olduğunu bildirmiĢlerdir.
Çeltikte yapılan bir çalıĢmada 191 RIL populasyonu ve 181 adet SSR markırı kullanarak çeltik tohumlarının 9 °C’de çimlenme yeteneği araĢtırılmıĢtır. ÇalıĢmanın sonunda çeltiğin 1, 3, 4, 6, 8 ve 10. kromozomlarda QTL bölgeleri tespit edilmiĢtir (Andaya ve Mackill 2003). Çeltikte yapılan baĢka bir çalıĢmada 269 RIL populasyonu ve 198 markır kullanılmıĢtır. Çeltik tohumları 10 °C’de çimlendirilmiĢ ve 10. ve 13. gün gözlemler alınarak QTL bölgeleri belirlenmeye çalıĢılmıĢtır. ÇalıĢmanın sonunda 10 °C ve 10. günde 3, 7 ve 10. kromozomlarda, 10 °C ve 13. günde 3. ve 11. kromozomlarda QTL bölgeleri bulduklarını belirtmiĢlerdir (Zhang vd. 2005).
Chen vd. (2006), 198 adet double haploid çeltik hattında 140 adet SSR markırı ile düĢük sıcaklıkta çimlenme oranı üzerine çalıĢmıĢlardır. Çimlenme sıcaklığını 15 °C olacak Ģekilde belirlemiĢlerdir. ÇalıĢma sonunda kromozom 3 ve 10’da QTL gen bölgelerini tespit etmiĢlerdir. Kromozom 3, % 12.6 kromozom 10 ise % 12.9 olarak fenotipik varyansı açıklamıĢtır. Ana QTL gen bölgesi olarak 10. kromozomu belirlemiĢlerdir.
Çeltikte yapılan baĢka bir çalıĢmada düĢük sıcaklıkta çimlenme gücü ve çimlenme gücü indeksi üzerinde çalıĢılmıĢtır. DüĢük sıcaklıkta çimlenme testini 14 °C’de uygulamıĢlar ve 7. 11. 14. ve 17. günlerde ölçüm yapmıĢlardır. ÇalıĢmada 200 adet F2:3 populasyonu ve ebeveynleri kullanarak SSR markırları ile QTL bölgelerini tespit etmeyi amaçlamıĢlardır. Kromozom 2 ve 7’de her iki özellik için QTL’ler belirlenmiĢ ve fenotipik varyasyonun % 6.3 ile 14.2 arasında açıklandığını bildirmiĢlerdir. ÇalıĢmanın
sonunda ilgili özelliklerin çok gen tarafından kontrol edildiğini ve ilgili genin kısmi dominant olduğunu bildirmiĢlerdir (Han vd. 2006).
Çeltik bitkisinde yapılan bir çalıĢmada düĢük sıcaklıkta çimlenme yeteneğini belirlemek için çimlenme oranı, çimlenme indeksi ve ortalama çimlenme zamanı üzerinde çalıĢılmıĢtır. ÇalıĢmada 71 adet RIL populasyonu ve genetik haritalama için RFLP markırı kullanılmıĢtır. ÇalıĢma sonucunda kromozom 2 ve 11’de çimlenme oranı ve çimlenme indeksi ile ilgili QTL gen bölgeleri belirlenmiĢtir (Ji vd. 2009).
Wang vd. (2011), çeltik bitkisinde çimlenme ve fide aĢamasında soğuk toleransı etkileyen QTL gen bölgelerini saptamaya çalıĢmıĢtır. ÇalıĢmada F10 kademesinde 227 adet RIL populasyonu ve QTL gen bölgelerinin tespitinde multiple inverval mapping (MIM) yöntemini kullanmıĢlardır. Kromozom 3, 8, 11 ve 12’de toplamda 7 adet QTL gen bölgesi belirlenmiĢtir. Fenotipik verilerdeki varyasyon bu QTL gen bölgelerini % 5.5 ile 22.4 oranında açıklamıĢtır. ÇalıĢmanın sonunda çimlenme ve fide aĢaması ile soğuğa tolerans arasında önemli bir iliĢki olmadığını saptamıĢlardır.
Çeltikte yapılan baĢka bir çalıĢmada fide döneminde soğuğa tolerans üzerine çalıĢılmıĢtır. ÇalıĢmada F7 kademesinde 123 adet RIL populasyonu kullanılmıĢtır.
Soğuğa tolerans 8 °C ve 18 günde test edilmiĢtir. ÇalıĢmanın sonunda kromozom 1’de 2 adet, kromozom 2, 4, 10 ve 11’de 1’er adet olmak üzere toplamda 6 QTL bölgesi belirlenmiĢtir. Fenotipik vasyasyonun bu QTL gen bölgelerini % 6.1 ile 16.5 arasında açıkladığı bildirilmiĢtir (Kim vd. 2014).
Knoll vd. (2008), sorgum bitkisinde düĢük sıcaklığa tolerans üzerine yaptıkları çalıĢmada 153 RIL populasyonu ve QTL gen bölgelerini belirlemek için SMA, SIM ve CIM modellerini kullanmıĢlardır. ÇalıĢma sonunda çimlenme yeteneği ile ilgili 2 QTL gen bölgesi belirlemiĢlerdir.
Sorgum bitkisinde yapılan baĢka bir çalıĢmada soğuk koĢullarda çimlenme yeteneği, tarla çıkıĢı ve çimlenme gücü üzerine çalıĢılmıĢtır. ÇalıĢmada F kademesinde 171
adet RIL populasyonu ve 141 adet SSR markırı ile QTL gen bölgeleri belirlenmeye çalıĢılmıĢtır. Her özellik için en az 2 QTL gen bölgesi tespit edilmiĢ ancak en yüksek LOD skorunun düĢük sıcaklıkta çimlenme yeteneğinde elde edildiği bildirilmiĢtir (Burow vd. 2011).
Mısır bitkisinde yapılan bir çalıĢmada 243 adet RIL populasyonu üzerinde düĢük sıcaklıkta çimlenme yeteneği üzerine çalıĢılmıĢtır. ÇalıĢmada 12 °C’de 16 saat ve 18
°C’de 8 saat düĢük sıcaklıkta çimlendirme yapılmıĢtır. ÇalıĢma sonunda kromozom 4, 5, 6, 7 ve 9’da QTL gen bölgeleri belirlenmiĢ ve fenotipik varyasyon % 3.39 ile 11.29 arasında açıklanmıĢtır (Hu vd. 2016).
2.3 Tohum Özellikleri ve Abiyotik Stres ile Ġlgili ÇalıĢmalar
MaĢ fasulyesi ve nohutta yapılan bir çalıĢmada araĢtırıcılar tohum ağırlığı üzerine çalıĢmıĢlardır. ÇalıĢmada RFLP markırları kullanılmıĢtır. MaĢ fasulyesinde birbirinden bağımsız 4 QTL gen bölgesi belirlenmiĢ ve fenotipik varyasyonun % 49.7’si açıklanmıĢ, nohutta ise 2 QTL gen bölgesi belirlenmiĢ ve fenotipik varyasyonun % 52.7’si açıklanmıĢtır (Fatokun vd. 1992).
Soya fasulyesinde yapılan bir çalıĢmada iki farklı populasyonda tohum ağırlığı ile ilgili moleküler markırları tespit edilmeye çalıĢılmıĢtır. ÇalıĢmada F4 kademesinde 120 adet ve F2 kademesinde 111 adet bitki kullanılmıĢtır. RFLP markırları ile yapılan taramada 973 cM ve 1600 cM uzunluğunda harita uzunluğu elde edilmiĢtir. Ġlgili markırların tespiti SMA yöntemi ile yapılmıĢ ve ilk populasyonda fenotipik varyasyonun % 73’ü, ikinci populasyonda ise fenotipik varyasyonun % 74’ü açıklanmıĢtır. ÇalıĢma sonunda farklı yıl ve çevre koĢullarında benzer sonuçları elde edilmiĢ ve SMA modelinin soya fasulyesinde uygulanabilir olduğu bildirilmiĢtir (Mian vd. 1996).
Soya fasulyesinde yapılan baĢka bir çalıĢmada tohum Ģekli ile ilgili özellikler üzerine çalıĢılmıĢtır. Üç farklı F7 kademesindeki RIL populasyonunda tohum kalınlığı, tohum uzunluğu, tohum geniĢliği ve tohum hacmi üzerinde çalıĢılmıĢtır. ÇalıĢma sonunda 10
