ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
DOKTORA TEZĠ
ASMANIN KÜLLEME (Erysiphe necator) HASTALIĞINA FARKLI TOLERANS SEVĠYELERĠNDE TEPKĠSĠNĠN WRKY1, DHN1a VE Myc2 GEN
ĠFADELERĠNDE REAL-TĠME PCR ĠLE BELĠRLENMESĠ VE METĠL JASMONATIN ETKĠSĠ
Nur ARSLAN
BAHÇE BĠTKĠLERĠ ANABĠLĠM DALI
ANKARA 2018
Her hakkı saklıdır
ii ÖZET
Doktora Tezi
ASMANIN KÜLLEME (Erysiphe necator) HASTALIĞINA FARKLI TOLERANS SEVĠYELERĠNDE TEPKĠSĠNĠN WRKY1, DHN1a VE Myc2 GEN ĠFADELERĠNDE
REAL-TĠME PCR ĠLE BELĠRLENMESĠ VE METĠL JASMONATIN ETKĠSĠ Nur ARSLAN
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı DanıĢman: Doç. Dr. Murat AKKURT
Asma sofralık, Ģaraplık ve kurutmalık ürün olarak en çok tüketilen bahçe bitkileri arasında yer almaktadır. Külleme (Eryshpe necator) Dünya bağcılığını tehdit eden ve önemli verim ve kalite kayıplarına yol açan bir hastalıktır. Külleme hastalığına Vitis vinifera L. türüne ait çeĢitlerin tamamına yakını duyarlıdır. Bu çalıĢmada, Boğazkere (Vitis vinifera L. küllemeye hassas), Cabernet Sauvignon (Vitis vinifera L. küllemeye hassas), Regent (Hibrit Vitis vinifera L. küllemeye tolerant) ve Kishmish Vatkana (Vitis vinifera L. küllemeye Tolerant) çeĢitlerinin, külleme ve külleme + MeJa uygulamaları sonrası transkripsiyon faktörü genlerden Myc2, WRKY1 ve DHN1a‘nın Real-time PCR ile gen ifade seviyelerinin belirlenmesi amaçlanmıĢtır. AraĢtırmada karĢılaĢtırdığımız hassas ve tolerant çeĢitlere ait dal çelikleri köklendirilmelerinin ardından, doğal ortamdan alınan külleme etmeni ile inoküle edilmiĢtir ve ardından 50µM MeJa uygulaması gerçekleĢtirilmiĢtir. ÇeĢitlere ait yaprak örnekleri uygulamaların ardından 0., 6., 12., 24., 48., 72., 96. ve 120. saatlerde toplanmıĢtır.
Külleme ve külleme + MeJa uygulamalarının Real-time PCR analizleri WRKY1, DHN1a, Myc2 genlerinde gerçekleĢtirilmiĢtir. Actin1 geni referans gen olarak kullanılmıĢtır. AraĢtırma sonucunda hassas ve tolerant çeĢitlerin farklı mekanizmaları kullandığı ve transkripsiyon faktörü genlerin külleme etmeni ve MeJa varlığında uyarıldığı görülmüĢtür. Külleme etmeninin 3 gende ve 4 çeĢitte farklı ifadeler gösterdiği ve MeJa uygulamasının Erysiphe necator üzerinde etkili bir uyarıcı olduğu belirlenmiĢtir.
Haziran 2018, 161 sayfa
Anahtar Kelimeler: Erysiphe necator, MeJa, gen ifadesi, Real-time PCR, WRKY1, DHN1a, Myc2, Vitis vinifera L.
iii ABSTRACT
Ph. D. Thesis
DETERMĠNATĠON ĠN WRKY, DHN1a AND Myc2 GENE EXPRESSĠON WĠTH REAL-TĠME PCR ĠN RESPONSE FROM THE DĠFFERENT TOLERANCE LEVEL
OF POWDERY MĠLDEW (Eryshpe necator) DĠSEASE ĠN GRAPEVĠNE AND EFFECT OF METHYL JASMONATE
Nur ARSLAN Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Horticulture
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Murat AKKURT
Grape is globally among the most consumed horticulture as table grapes, wine and dried. Powdery mildew (Erysiphe necator) is a disease that threatens the world of viticulture and leads to significant yield and quality losses. Almost all of Vitis vinifera L. species is susceptible in Powdery mildew. In this study, Bogazkere (Vitis vinifera L.
Powdery mildew susceptible genotype), Cabernet Sauvignon (Vitis vinifera L. Powdery mildew susceptible genotype), Regent (Hibrit Vitis vinifera L. Powdery mildew resistant genotype) and Kishmish Vatkania (Vitis vinifera L. Powdery mildew resistant genotype) varieties were made with the aim of determining at gene expression levels by Real-time PCR of Myc2, WRKY1 and DHN1a, which are transcription factor genes after Powdery mildew and Powdery mildew + MeJa treatments. After cuttings of the susceptible and resistant genotype which we compared in the study were rooted, they were inoculated with Powdery mildew agent from the natural environment and then 50 μM MeJa treatment was carried out. Leaf samples of varieties were collected at 0., 6., 12., 24., 48., 72., 96. and 120. hours after treatments.
Real-time PCR analyzes of the Powdery mildew and Powdery mildew + MeJa treatments were investigated in the WRKY1, DHN1a, Myc2 genes. Actin1 gene was used as housekeeping gene. It has been shown that susceptible and resistant genotypes use different mechanisms and that transcription factor genes are stimulating in the presence of Powdery mildew agent and MeJa. Gen expressions of 3 genes and 4 varieties are different the Powdery mildew agent and MeJa treatment is an effective elicitor on Erysiphe necator.
June 2018, 161 pages
Key Words: Erysiphe necator, MeJa, gene expression, Real-time PCR, WRKY1, DHN1a, Myc2, Vitis vinifera L.
iv TEġEKKÜR
Tez çalıĢmamın her aĢamasında değerli bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyerek, sonsuz destek ve sabır gösteren, akademik ortamda olduğu kadar sosyal iliĢkilerde de engin fikirleriyle yetiĢme ve geliĢmeme katkıda bulunan Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü‘nde görev yapan danıĢman hocam sayın Doç. Dr.
Murat AKKURT‘a içtenlikle teĢekkür ederim. Ayrıca Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü‘nde görev yapan değerli TĠK üyem Prof. Dr. Birhan KUNTER ve Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü‘nde görev yapan değerli TĠK üyem Prof. Dr. Fikret DEMĠRCĠ hocalarıma ne zaman yardımlarını istesem yardımlarını esirgemedikleri ve değerli bilgi ve tecrübelerini benimle paylaĢtıkları için teĢekkür ederim. Tezimin yazımı sırasında emeği geçen ve hiçbir zaman kıymetli yardım ve desteğini esirgemeyen sevgili arkadaĢım Uzm. Dr. Bio. Esra Gündüzer‘e, yaĢamımın her aĢamasında ve beni bugünlere getiren, birçok fedakârlık göstererek sevgi ve anlayıĢ ile beni destekleyen hayat kaynağım sevgili ailem Rahmiye ve Mustafa YILDIRIM ile Hamiyet ve Enver ARSLAN‘a, kardeĢim Kutay ARSLAN‘a en derin duygularımla teĢekkür ederim. En özel teĢekkürlerimi ise beni tanıdığı günden beri sabırla bu tezi bitirmemi bekleyen, bana huzurlu bir çalıĢma ortamı sağlayan, bana her konuda yardımcı olan, pek çok fedakârlığa katlanan ve sabırla tezimin bitmesini bekleyen eĢim Avukat Ġldeniz ARSLAN‘a sunuyorum. Bu tezin her aĢamasında yukarıda geçen her bir bireyle çok güzel ve özel anılar paylaĢtım, herkese en içten duygularımla sonsuz teĢekkürler.
Nur ARSLAN
Ankara, Haziran 2018
v
ĠÇĠNDEKĠLER
TEZ ONAY SAYFASI
ETĠK ... i
ÖZET ... ii
ABSTRACT ... iii
TEġEKKÜR ... iv
SĠMGELER DĠZĠNĠ ... vii
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ... viii
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ ... xi
1. GĠRĠġ ... 1
1.1 Külleme Etmeni Erysiphe necator ... 1
1.2 Jasmonik Asit Türevi Metil Jasmonat Fitohormonu ... 4
1.3 Transkripsiyon Faktörü Genler ... 8
1.3.1 Myc2 geni (Myelo Cytomatosis 2) ... 9
1.3.2 WRKY1 geni ... 13
1.3.3 Dehidrin geni ... 17
2. KAYNAK ÖZETLERĠ ... 21
3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 45
3.1 Bitki Materyalinin Temini ve Dikim için Hazırlanması ... 45
3.2 Erysiphe necator Ġnokülasyonu ve Metil Jasmonat Uygulamaları ... 48
3.3 RNA izolasyonu ve RNA saflık ve miktar tayini ... 49
3.4 cDNA (Komplementer DNA) Sentezi ... 50
3.5 Primer Dizaynı ve Real-time PCR Reaksiyonu ... 51
3.6 Normalizasyon ve Ġstatistiksel Analizler ... 53
4. ARAġTIRMA BULGULARI VE TARTIġMA ... 54
4.1 Erysiphe necator ve MeJa Uygulamaları sonrası ... 54
4.2 RNA Ġzolasyonu ve cDNA Sentezi ... 57
4.3 Real-time PCR Reaksiyonu ... 60
4.4 Normalizasyon ve Ġstatistiksel Analizler ... 65
4.4.1 Boğazkere çeĢidinin gen ifade seviyeleri ... 65
4.4.1.1 Boğazkere çeĢidinin Myc2 gen ifade seviyeleri ... 65
4.4.1.3 Boğazkere çeĢidinin DHN1a gen ifade seviyeleri ... 71
vi
4.4.2 Regent ÇeĢidinin Gen Ġfade Seviyeleri ... 74
4.4.2.1 Regent çeĢidinin Myc2 gen ifade seviyeleri ... 74
4.4.2.2 Regent çeĢidinin WRKY1 gen ifade seviyeleri ... 77
4.4.3 Kishmish Vatkana ÇeĢidinin Gen Ġfade Seviyeleri ... 83
4.4.3.1 Kishmish Vatkana çeĢidinin Myc2 gen ifade seviyeleri ... 83
4.4.3.2 Kishmish Vatkana çeĢidinin WRKY1 gen ifade seviyeleri ... 86
4.4.3.3 Kishmish Vatkana çeĢidinin DHN1a gen ifade seviyeleri ... 89
4.4.4 Cabernet Sauvignon ÇeĢidinin Gen Ġfade Seviyeleri ... 92
4.4.4.1 Cabernet Sauvignon çeĢidinin Myc2 gen ifade seviyeleri ... 92
4.4.4.2 Cabernet Sauvignon çeĢidinin WRKY1 gen ifade seviyeleri ... 95
4.4.4.3 Cabernet Sauvignon çeĢidinin DHN1a gen ifade seviyeleri ... 98
4.4.5 ÇeĢitlere Ait Gen Ġfade Seviyelerinin KarĢılaĢtırılması ... 100
4.4.5.1 ÇeĢitlere ait Myc2 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 100
4.4.5.2 ÇeĢitlere ait WRKY1 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması... 102
4.4.5.3 ÇeĢitlere ait DHN1a gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 104
5. SONUÇ ... 139
KAYNAKLAR ... 142
ÖZGEÇMĠġ ... 159
vii
SĠMGELER DĠZĠNĠ
Ca(NO3)2.4H2O Kalsiyum Nitrit CuSO4.5H2O Bakır Sülfat
g Relatif Santrifüj Kuvveti
h Saat
H2O2 Hidrojen Peroksit
H3BO3 Borik Asit
K2SO4 Potasyum Sülfat
KCl Potasyum Klorür
KH2PO4 Potasyum Hidrojen Fosfat
MgSO4.7H2O Magnezyum Sülfat
NH4 Amonyum
NH4Mo Amonyum Molibdat
NO3 Nitrat
ZnSO4.7H2O Çinko Sülfat
Kısaltmalar
A Adenin
ABA Absisik asit
C Sitozin
cDNA Komplementer Deoksiribo Nükleik Asit
COI1 Coronatine insensitive-1
Ct Threshold cycle
dNTP Deoxynucleotide
DHN Dehidrin
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
G Guanin
GA Giberellik asit
IAA Ġndol asetik asit
IBA Ġndol bütirik asit
JA Jasmonik asit
JAZ Jasmonate-Zim Domain
LOX Lipoksijenaz
MeJa Metil jasmonat
Myc Myelo Cytomatosis
Ns Non significant (anlamsız)
PCR Polimeraz zincir reaksiyonu
RNA Ribonükleik asit
PR Patogenezle iliĢkili genler
ROS Reaktif oksijen türleri
SA Salisilik asit
SAR Systemic acquired resistance
SCFCOI1 Skp/Cullin/F-box complex
Sig. Significant (anlamlı)
SPSS Statistical Package for the Social Sciences
T Timin
TF Transkripsiyon faktörü
viii
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
ġekil 1.1 Bağda görülen külleme etmeninin konidiyumlarının mikroskobik
görünümü ... 2
ġekil 1.2 Bağda görülen külleme etmeninin kazmotesyumunun mikroskobik görünümü ... 2
ġekil 1.3 Jasmonik asit ve Metil jasmonat‘ın molekül formülleri ... 5
ġekil 1.4 Metil jasmonat oluĢumu akıĢ Ģeması ... 5
ġekil 1.5 Jasmonat yolağının ana komponentleri ... 6
ġekil 1.6 Myc2 geni sinyal yolağı ... 12
ġekil 1.7 WRKY1 geni sinyal yolağı ... 14
ġekil 1.8 WRKY gen ailesi sinyal yolağı... 15
ġekil 1.9 Dehidrinler ile ilgili bir sinyal yolağı... 19
ġekil 3.1 16.03.2017 tarihinde dikilen çeliklerin görünümü ... 46
ġekil 3.2 16.04.2017 (1 ay sonra) tarihinde çeliklerideki geliĢiminin görünümü ... 47
ġekil 3.3 30.04.2017 tarihinde inkülasyon öncesi çeliklerin görünümü ... 49
ġekil 4.1 Külleme etmeninin binoküler mikroskop görüntüleri... 54
ġekil 4.2 Külleme etmeninin 30.06.2017 tarihinde Boğazkere çeĢidinde yayılıĢı... 55
ġekil 4.3 Külleme etmeninin 30.06.2017 tarihinde Cabernet Sauvignon çeĢidinde yayılıĢı ... 55
ġekil 4.4 Külleme etmeninin 30.06.2017 tarihinde Regent çeĢidinde yayılıĢı ... 56
ġekil 4.5 Külleme etmeninin 30.06.2017 tarihinde Kishmish Vatkana çeĢidinde yayılıĢı ... 56
ġekil 4.6 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyesi ... 66
ġekil 4.7 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyesi ... 67
ġekil 4.8 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 68
ġekil 4.9 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyesi ... 69
ġekil 4.10 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyesi ... 70
ġekil 4.11 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 71
ix
ġekil 4.12 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyesi ... 72 ġekil 4.13 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde
DHN1a gen ifade seviyesi ... 73 ġekil 4.14 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere
çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 74 ġekil 4.15 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde Myc2 gen ifade
seviyesi ... 75 ġekil 4.16 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde Myc2
gen ifade seviyesi ... 76 ġekil 4.17 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent
çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 77 ġekil 4.18 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde WRKY1 gen
ifade seviyesi ... 78 ġekil 4.19 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde WRKY1
gen ifade seviyesi ... 79 ġekil 4.20 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde
WRKY1 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması... 80 ġekil 4.21 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde DHN1a gen ifade
seviyesi ... 81 ġekil 4.22 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde DHN1a
gen ifade seviyesi ... 82 ġekil 4.23 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde
DHN1a gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 83 ġekil 4.24 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Kishmish Vatkana çeĢidinde Myc2
gen ifade seviyesi ... 84 ġekil 4.25 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Kishmish Vatkana çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyesi ... 85 ġekil 4.26 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Kishmish Vatkana
çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 86 ġekil 4.27 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Kishmish Vatkana çeĢidinde WRKY1
gen ifade seviyesi ... 87 ġekil 4.28 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Kishmish Vatkana çeĢidinde
WRKY1 gen ifade seviyesi ... 88 ġekil 4.29 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Kishmish Vatkana
çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 89 ġekil 4.30 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Kishmish Vatkana çeĢidinde DHN1a
gen ifade seviyesi ... 90
x
ġekil 4.31 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Kishmish Vatkana çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyesi ... 91 ġekil 4.32 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Kishmish Vatkana
çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 92 ġekil 4.33 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Cabernet Sauvignon çeĢidinde Myc2
gen ifade seviyesi ... 93 ġekil 4.34 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Cabernet Sauvignon çeĢidinde
Myc2 gen ifade seviyesi ... 94 ġekil 4.35 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Cabernet Sauvignon
çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 95 ġekil 4.36 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Cabernet Sauvignon çeĢidinde WRKY1
gen ifade seviyesi ... 96 ġekil 4.37 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Cabernet Sauvignon çeĢidinde
WRKY1 gen ifade seviyesi ... 97 ġekil 4.38 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Cabernet Sauvignon
çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 98 ġekil 4.39 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Cabernet Sauvignon çeĢidinde DHN1a
gen ifade seviyesi ... 99 ġekil 4.40 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Cabernet Sauvignon çeĢidinde
DHN1a gen ifade seviyesi ... 99 ġekil 4.41 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Cabernet
Sauvignon çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması ... 100 ġekil 4.42 Külleme uygulanmıĢ örneklerin 4 çeĢitte Myc2 gen ifade seviyelerinin
karĢılaĢtırılması ... 101 ġekil 4.43 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin 4 çeĢitte Myc2 gen ifade
seviyelerinin karĢılaĢtırılması... 102 ġekil 4.44 Külleme uygulanmıĢ örneklerin 4 çeĢitte WRKY1 gen ifade
seviyelerinin karĢılaĢtırılması... 103 ġekil 4.45 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin 4 çeĢitte WRKY1 gen ifade
seviyelerinin karĢılaĢtırılması... 104 ġekil 4.46 Külleme uygulanmıĢ örneklerin 4 çeĢitte DHN1a gen ifade seviyelerinin
karĢılaĢtırılması ... 105 ġekil 4.47 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin 4 çeĢitte DHN1a gen ifade
seviyelerinin karĢılaĢtırılması... 106
xi
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ
Çizelge 3.1 Hogland besi ortamı makro ve mikro besin çözelti içeriği ... 47
Çizelge 3.2 Hogland besi ortamında bulunan iyonların son konsantrasyonu ... 48
Çizelge 3.3 cDNA sentezinin ilk aĢaması ... 51
Çizelge 3.4 cDNA sentezinin ikinci aĢaması ... 51
Çizelge 3.5 Real-time PCR primer dizileri ve eriĢim numaraları ... 52
Çizelge 3.6 Real-time PCR protokolü ve koĢulları ... 52
Çizelge 4.1 Boğazkere çeĢidinin RNA ve cDNA saflık ve miktar değerleri ... 57
Çizelge 4.2 Regent çeĢidinin RNA ve cDNA saflık ve miktar değerleri ... 58
Çizelge 4.3 Cabernet Sauvignon çeĢidinin RNA ve cDNA saflık ve miktar değerleri ... 59
Çizelge 4.4 Kishmish Vatkana çeĢidinin RNA ve cDNA saflık ve miktar değerleri ... 60
Çizelge 4.5 Boğazkere çeĢidine ait 4 gen bölgesinin Ct değerleri ... 61
Çizelge 4.6 Regent çeĢidine ait 4 gen bölgesinin Ct değerleri ... 62
Çizelge 4.7 Cabernet Sauvignon çeĢidine ait 4 gen bölgesinin Ct değerleri ... 63
Çizelge 4.8 Kishmish Vatkana çeĢidine ait 4 gen bölgesinin Ct değerleri ... 64
Çizelge 4.9 Külleme stresi uygulanan Boğazkere örneklerinin WRKY1 genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 107
Çizelge 4.10 Külleme stresi uygulanmıĢ Boğazkere örneklerinin WRKY1 geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 107
Çizelge 4.11 Külleme + MeJa stresi uygulanan Boğazkere örneklerinin WRKY1 genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 108
Çizelge 4.12 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Boğazkere örneklerinin WRKY1 geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 108
Çizelge 4.13 Külleme stresi uygulanan Boğazkere örneklerinin DHN1a genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 109
Çizelge 4.14 Külleme stresi uygulanmıĢ Boğazkere örneklerinin DHN1a geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 109
Çizelge 4.15 Külleme + MeJa stresi uygulanan Boğazkere örneklerinin DHN1a genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 110
xii
Çizelge 4.16 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Boğazkere örneklerinin DHN1a
geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 110 Çizelge 4.17 Külleme stresi uygulanan Boğazkere örneklerinin Myc2 genine ait ... 111 normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart
sapma değerleri ... 111 Çizelge 4.18 Külleme stresi uygulanmıĢ Boğazkere örneklerinin Myc2 geninde
One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 111 Çizelge 4.19 Külleme + MeJa stresi uygulanan Boğazkere örneklerinin Myc2
genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 112 Çizelge 4.20 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Boğazkere örneklerinin Myc2
geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 112 Çizelge 4.21 Külleme stresi uygulanan Cabernet Sauvignon örneklerinin WRKY1 genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata vestandart sapma değerleri ... 113 Çizelge 4.22 Külleme stresi uygulanmıĢ Cabernet Sauvignon örneklerinin
WRKY1geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi)
verileri ... 113 Çizelge 4.23 Külleme + MeJa stresi uygulanan Cabernet Sauvignon örneklerinin
WRKY1 genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama,
standarthata ve standart sapma değerleri ... 114 Çizelge 4.24 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Cabernet Sauvignon örneklerinin WRKY1 geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 114 Çizelge 4.25 Külleme stresi uygulanan Cabernet Sauvignon örneklerinin DHN1a
genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata vestandart sapma değerleri ... 115 Çizelge 4.26 Külleme stresi uygulanmıĢ Cabernet Sauvignon örneklerinin DHN1a geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 115 Çizelge 4.27 Külleme + MeJa stresi uygulanan Cabernet Sauvignon örneklerinin
DHN1a genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama,
standart hata ve standart sapma değerleri ... 116 Çizelge 4.28 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Cabernet Sauvignon örneklerinin DHN1a geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi)
verileri ... 116 Çizelge 4.29 Külleme stresi uygulanan Cabernet Sauvignon örneklerinin Myc2 genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standartsapma değerleri ... 117 Çizelge 4.30 Külleme stresi uygulanmıĢ Cabernet Sauvignon örneklerinin Myc2
geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 117
xiii
Çizelge 4.31 Külleme + MeJa stresi uygulanan Cabernet Sauvignon örneklerinin Myc2 genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 118 Çizelge 4.32 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Cabernet Sauvignon
örneklerinin Myc2 geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 118 Çizelge 4.33 Külleme stresi uygulanan Kishmish Vatkana örneklerinin WRKY1
genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hatave standart sapma değerleri ... 119 Çizelge 4.34 Külleme stresi uygulanmıĢ Kishmish Vatkana örneklerinin WRKY1 geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 119 Çizelge 4.35 Külleme + MeJa stresi uygulanan Kishmish Vatkana örneklerinin
WRKY1 genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama,
standarthata ve standart sapma değerleri ... 120 Çizelge 4.36 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Kishmish Vatkana örneklerinin
WRKY1 geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 120 Çizelge 4.37 Külleme stresi uygulanan Kishmish Vatkana örneklerinin DHN1a genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 121 Çizelge 4.38 Külleme stresi uygulanmıĢ Kishmish Vatkana örneklerinin DHN1a
geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 121 Çizelge 4.39 Külleme + MeJa stresi uygulanan Kishmish Vatkana örneklerinin
DHN1a genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 122 Çizelge 4.40 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Kishmish Vatkana örneklerinin
DHN1a geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 122 Çizelge 4.41 Külleme stresi uygulanan Kishmish Vatkana örneklerinin Myc2 genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 123 Çizelge 4.42 Külleme stresi uygulanmıĢ Kishmish Vatkana örneklerinin Myc2 geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 123 Çizelge 4.43 Külleme + MeJa stresi uygulanan Kishmish Vatkana örneklerinin
Myc2 genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 124 Çizelge 4.44 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Kishmish Vatkana örneklerinin
Myc2geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 124 Çizelge 4.45 Külleme stresi uygulanan Regent örneklerinin WRKY1 genine
ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 125
xiv
Çizelge 4.46 Külleme stresi uygulanmıĢ Regent örneklerinin WRKY1 geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 125 Çizelge 4.47 Külleme + MeJa stresi uygulanan Regent örneklerinin WRKY1
genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 126 Çizelge 4.48 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Regent örneklerinin WRKY1 geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 126 Çizelge 4.49 Külleme stresi uygulanan Regent örneklerinin DHN1a genine ait
normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 127 Çizelge 4.50 Külleme stresi uygulanmıĢ Regent örneklerinin DHN1a geninde
One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 127 Çizelge 4.51 Külleme + MeJa stresi uygulanan Regent örneklerinin DHN1a
genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 128 Çizelge 4.52 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Regent örneklerinin DHN1a
geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 128 Çizelge 4.53 Külleme stresi uygulanan Regent örneklerinin Myc2 genine ait
normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 129 Çizelge 4.54 Külleme stresi uygulanmıĢ Regent örneklerinin Myc2 geninde
One WayANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 129 Çizelge 4.55 Külleme + MeJa stresi uygulanan Regent örneklerinin Myc2
genine ait normalize gen ifade analizlerinde ortalama, standart hata ve standart sapma değerleri ... 130
Çizelge 4.56 Külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ Regent örneklerinin Myc2 geninde One Way ANOVA (Tek Yönlü Varyans Analizi) verileri ... 130
Çizelge 4.57 Boğazkere çeĢidinde WRKY1 geninde külleme stresi uygulanan
örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 131 Çizelge 4.58 Boğazkere çeĢidinde WRKY1 geninde külleme + MeJa stresi
uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 131 Çizelge 4.59 Boğazkere çeĢidinde DHN1a geninde külleme stresi uygulanan
örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 131 Çizelge 4.60 Boğazkere çeĢidinde DHN1a geninde külleme + MeJa stresi
uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 132 Çizelge 4.61 Boğazkere çeĢidinde Myc2 geninde külleme stresi uygulanan
örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 132 Çizelge 4.62 Boğazkere çeĢidinde Myc2 geninde külleme + MeJa stresi
uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 132 Çizelge 4.63 Regent çeĢidinde WRKY1 geninde külleme stresi uygulanan
örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 133
xv
Çizelge 4.64 Regent çeĢidinde WRKY1 geninde külleme + MeJa stresi uygulanan
örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 133
Çizelge 4.65 Regent çeĢidinde DHN1a geninde külleme stresi uygulanan örneklerinPost Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 133
Çizelge 4.66 Regent çeĢidinde DHN1a geninde külleme + MeJa stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 134
Çizelge 4.67 Regent çeĢidinde Myc2 geninde külleme stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 134
Çizelge 4.68 Regent çeĢidinde Myc2 geninde külleme + MeJa stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 134
Çizelge 4.69 Kishmish Vatkana çeĢidinde WRKY1 geninde külleme stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 135
Çizelge 4.70 Kishmish Vatkana çeĢidinde WRKY1 geninde külleme + MeJa stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 135
Çizelge 4.71 Kishmish Vatkana çeĢidinde DHN1a geninde külleme stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 135
Çizelge 4.72 Kishmish Vatkana çeĢidinde DHN1a geninde külleme + MeJa stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 136
Çizelge 4.73 Kishmish Vatkana çeĢidinde Myc2 geninde külleme stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 136
Çizelge 4.74 Kishmish Vatkana çeĢidinde Myc2 geninde külleme + MeJa stresi ... 136
uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 136
Çizelge 4.75 Cabernet Sauvignon çeĢidinde WRKY1 geninde külleme stresi ... 137
uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 137
Çizelge 4.76 Cabernet Sauvignon çeĢidinde WRKY1 geninde külleme + MeJa stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 137
Çizelge 4.77 Cabernet Sauvignon çeĢidinde DHN1a geninde külleme stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 137
Çizelge 4.78 Cabernet Sauvignon çeĢidinde DHN1a geninde külleme + MeJa stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 138
Çizelge 4.79 Cabernet Sauvignon çeĢidinde Myc2 geninde külleme stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 138
Çizelge 4.80 Cabernet Sauvignon çeĢidinde Myc2 geninde külleme + MeJa stresi uygulanan örneklerin Post Hoc Testi Verilerinin Değerlendirilmesi ... 138
1 1. GĠRĠġ
Dünya bağcılığını tehdit eden ve önemli verim ve kalite kayıplarına sebep olan etmenlerinin baĢında külleme (Erysiphe necator Schwein (syn. Unciluna necator (Schw.) (Burr.)) hastalığı gelmektedir. Bu etmen ile mücadele yapılmadığı takdirde yıllara göre değiĢmekle birlikte % 90‘lara varan ürün kayıplarına sebep olabilmektedir.
Külleme hastalığına Vitis vinifera L. türüne ait çeĢitlerin hemen hemen tamamı duyarlıdır. Amerikan türlerinin ise bu hastalığa karĢı farklı düzeylerde dayanıklılık gösterdiği bilinmektedir (Husfeld 1962).
1.1 Külleme Etmeni Erysiphe necator
Külleme etmeni Erysiphe necator obligat biotroph bir fungal patojendir (Blumer 1933).
Özellikle sıcak ve kurak iklimlerde etkisi daha yüksektir. Erysiphe necator‘un hifleri 4–
5 µm geniĢlikte olup epidermis hücrelerinden beslenmelerini sağlayan haustoryumlar yuvarlak Ģekildedir. Konidiler elips veya fıçı Ģeklindedir. 2–4 bölmeli olan konidioforlar 10-140 µm uzunluğunda olup, yatay geliĢen hifler üzerinde dikey olarak ve sık aralıklarla oluĢurlar (Gadoury 1988-1990, Kandilci 2006). Renksiz ve silindirik oval Ģekilli konidiler bir zincir oluĢturacak Ģekilde konidioforlar üzerinde dizilirler. Zincirin ucundaki konidi en yaĢlı olandır ve genelde her zincirde 3-5 konidi bulunur. Bu organların üzerinde bulunan konidiler rüzgâr aracılığı ile diğer asmalara kolayca taĢınırlar. Bu belirtiler sürgün 15-20 cm uzunluğuna ulaĢıncaya kadar dikkati çekmeyebilir. Ġlk belirtiler daha çok sürgün ucunda görülür. Konidiler 25 °C‘de yaklaĢık 5 saat içinde çimlenirler. Ġnkübasyon süresi 7-14 gündür. Ancak 23-30 °C arasında bu süre kısalarak 5-6 güne iner. Genellikle gündüz sıcak, gece serin havalarda hastalık artıĢı görülür (Halleen ve Holz 2001, ġekil 1.1).
Ġlkbaharda olgun kazmotesyumlar yağmurla ıslandıklarında çatlarlar ve askosporları dıĢarı çıkar. YeĢil doku üzerine konan askosporlar bir misel kolonisi oluĢtururlar. Bu koloniler üzerinde meydana gelen konidi uçuĢu genelde asmanın çiçeklenmesinden sonra en yoğun seviyeye çıkar ve sonbahara kadar devam eder. Çiçekten sonra hastalık sap, salkım ve yapraklarda daha belirgin hale gelir. Sonbaharda, koĢullar uygunsa
2
kazmotesyum oluĢumu baĢlar. Böylelikle etmenin yaĢam çemberi tamamlanmıĢ olur (Halleen ve Holz 2001, ġekil 1.2).
ġekil 1.1 Bağda görülen külleme etmeninin konidiyumlarının mikroskobik görünümü (Demir 2014)
ġekil 1.2 Bağda görülen külleme etmeninin kazmotesyumunun mikroskobik görünümü (Demir 2014)
Gözler, vejetasyon döneminde oluĢmaları sırasında enfekte olurlar. Fungus hifleri ile göze yerleĢir ve sonraki mevsime kadar iç tomurcuk pulları üzerinde dormant vaziyette bekler. Asmalara su yürüyüp gözlerin sürmesinden kısa bir süre sonra fungus aktivite kazanır ve geliĢmekte olan sürgünü ve yaprakçıkları beyaz bir miselyum ile kaplar.
Haustoryumlar yardımıyla yüzeyde oluĢturduğu miselyum ve konidilerini besler
3
(Halleen ve Holz 2001). Sürgünlerin uzamaya baĢladığı ilk andan itibaren faaliyete baĢlar ve omcaların bütün yeĢil kısımlarında (yaprak, sap, sürgün, salkım ve taneler) zarar yapabilmektedir. Hastalık ilk önce yaprakların alt kısımlarında yağ damlası ve renk açılması Ģeklinde kendini gösterirken, daha sonra yaprakların alt ve üst yüzeyleri kirli beyaz renkte kül serpilmiĢ gibi bir toz ile kaplanır. Yaprakların kenarları kıvrılır, yaprak dokusu gevrek bir hal alır. Bu yapraklar kısa sürede kurur ve dökülür. Misellerin çiçek, sülük ve salkımlarında kirli beyaz ve tozlu bir görünüm oluĢur. Hastalığa erken yakalanan taneler küçük kalıp geliĢememektedir. Olgun tanelerde ise, kabuklar çatlar, çekirdek evleri dıĢarı çıkarak tohum çatlaması denilen olay meydana gelir. Yaz sürgünleri üzerinde siyahımsı örümcek ağı gibi lekeler meydana gelir. ġiddetli Ģekilde hastalanmıĢ salkımlarda olgunluk gecikir, kırmızı-siyah çeĢitlerde düzensiz renklenme görülür (Çelik vd. 1998, Kandilci 2006, Wilcox 2003).
Bu etmen, tanede ve salkım sapında lekeler meydana getirdiği için, sofralık üzümlerin pazar değerini önemli ölçüde azaltmaktadır. ġaraplık üzümlerde ise, ileri derecede küllemeye maruz kalmıĢ salkımların Ģaraba iĢlenmesi sonucu, Ģarabın kötü tat ve koyu renk kazandığı, kalitesinin bozulduğu görülmüĢtür (Çelik vd. 1998).
Hastalığın bilinen 2 farklı mücadele yöntemi vardır. Bunlar ‗kültürel mücadele‘ ve
‗kimyasal mücadele‘dir. Kültürel mücadelede bağlarda yapılacak budamalarla hastalık etmeninin populasyonu düĢürülebilir. Omcalarda havalandırma ve güneĢlenmenin sağlanması ile fungus geliĢimi önlenebilir. Uygun toprak iĢleme ile yabancı otların temizlenmesi, hastalık etmeni taĢıyan budanmıĢ dalların ve yaprakların bağdan uzaklaĢtırılması hastalığın etmenini azaltmak bakımından önemlidir. Fakat kültürel mücadele hastalıkla mücadele için çoğu zaman yetersiz kalmaktadır. Bu nedenle bağcılar küllemeye karĢı yoğun kimyasal ilaç kullanarak mücadele etmektedir. Bu da üretim maliyetleri için önemli bir girdi sebebi olurken, asıl önemli olan sorun kalıntı problemi nedeniyle insan sağlığına verdiği zararlar ile kimyasalların çevre üzerindeki olumsuz etkileridir. Bu nedenle son yıllarda külleme hastalığına dayanıklı yeni çeĢit geliĢtirme çalıĢmaları hız kazanmıĢtır (Akkurt 2004).
4
1.2 Jasmonik Asit Türevi Metil Jasmonat Fitohormonu
Jasmonatlar bitki savunması ve geliĢiminde yer alan fitohormonlardır (Chico vd. 2008).
Jasmonik asit (JA) ve Metil jasmonat (MeJa) Jasmonat yanıtının anahtar regülatörleridir (Staswick 2008). Jasmonatlar biyotik ve abiyotik uyaranlara karĢı yanıtları kontrol ederek çevreye özgü geliĢim süreçlerini ve bitki adaptasyonunu düzenlerler. Jasmonat yapısındaki küçük değiĢiklikler hormon inaktivasyonu ile sonuçlanır. Bu durum, hem uyarıcı belirli yanıtlar için hem de uzun mesafe sinyal olayları için sinyal kapatmada kullanılabilir (Fonseca vd. 2009). JA biyosentezinin düzenlenmesi substratın kullanılabilirliği ve doku özgünlüğü pozitif geri besleme döngüsü tarafından belirlenir (Dar vd. 2015).
Bitkiler, bitkinin hasar görmüĢ bölgelerinde meydana gelen birçok biyotik ve abiyotik streslere (özellikle beslenme eksikliği ve yaralanma) yanıt olarak Jasmonik asit ve Metil jasmonat üretir. Metil jasmonat, bitkinin kendi savunma sistemini sinyal olarak kullanabilir ya da zarar görmemiĢ bitkilerde savunma reaksiyonu üretmek için fiziksel temas ya da hava yoluyla yayılabilir (Polesani vd. 2010). JA ve MeJa cinsiyet tayini, kök büyümesi, çiçeklenme ve meyve olgunlaĢması, erkek ve diĢi organ, embriyo geliĢimi, tohum çimlenmesi, fide geliĢimi, geotropizma, kök, yumru ve sülük oluĢumu, yaprak hareketi ve yaprak yaĢlanması dahil birçok geliĢim sürecinde düzenleyici moleküller olarak hareket ederler (Mata-Pérez vd. 2015, Zhang vd. 2012). JA gibi sinyal molekülleri, hem biyotik stres tepkilerine hem de kuraklık ve tuzluluk gibi abiyotik streslere karĢı bitkilerin savunmasında önemli rol oynamaktadır (Zhang vd. 2012).
JA‘nın aracılık ettiği diğer iĢlemler, ikincil metabolit oluĢumu ve mevsimsel ve sirkadiyen ritim adaptasyonlarının yanı sıra kuraklık, ozon, UV, osmotik, soğuk ve ıĢık stresine karĢı bitki yanıtlarını içerir (Mata-Pérez vd. 2015). Ayrıca patojenlere, zararlılara, yaralanmaya ve abiyotik strese karĢı aktif bitki savunmasında güçlü sinyaller sağlarlar (Fonseca vd. 2009).
Jasmonik asit (JA) kloroplast zarlarında bulunan linoleik asitten elde edilir ve oktadekanoid yolağı tarafından linolenik asitten sentezlenir. Sentez, uygun (+)-7-iso-JA Jasmonik asit oluĢturmak için bir dönüĢtürme ve oksidasyonun üç basamağından sonra
5
12-okso-fitodienoik asit (OPDA) ile devam eder. Sadece OPDA için linolenik asitin dönüĢümü kloroplastta olur, diğer reaksiyonlar peroksizomda meydana gelir. Uçucu bir bileĢik olan MeJa, Jasmonik asitten elde edilir ve reaksiyon, S-adenosil-L- metionin:Jasmonik asit karboksil metiltransferaz ile katalize edilir (Polesani vd. 2010, ġekil 1.3 - 1.4).
ġekil 1.3 Jasmonik asit ve Metil jasmonat‘ın molekül formülleri (https://quellochemi passaperlatazza.wordpress.com 2018a)
ġekil 1.4 Metil jasmonat oluĢumu akıĢ Ģeması (https://openi.nlm.nih.gov 2018b)
DüĢük biyoaktif Jasmonat seviyeleri içeren hücrelerde JAZ (Jasmonate-Zim Domaın) proteinleri, erken yanıt genlerinin ifadesinde yer alan pozitif transkripsiyon faktörlerinin
6
(örneğin, MYC2 ve MYC3) aktivitesini baskılamaktadır. Hem geliĢimsel hem de çevresel etkiler bitki hücrelerini, JAZ proteinlerinin SCFCOI1 (Skp/Cullin/F-box complex) aracılı bozunumunun indüklenmesine ve MYC2 gibi transkripsiyon faktörlerinin baskılanmasına neden olan biyoaktif Jasmonatların biriktirilmesini sağlar.
JA uygulaması ve çevresel stres koĢulları da JAZ genlerinin ifadesini hızla tetiklemektedir, bu da JA tarafından uyarılmıĢ JAZ ifadesinin, JAZ protein havuzunu dolduran ve JA‘ya verilen yanıtı bastıran negatif bir geri besleme döngüsü oluĢturabileceğini göstermektedir. JAZ gen ifadesinin diferansiyel regülasyonu, JA yanıtlarının hassas bir Ģekilde ayarlanması için olası bir mekanizmadır (Zhang vd. 2012, ġekil 1.5).
ġekil 1.5 Jasmonat yolağının ana komponentleri JA
Gen İfadesinde Değişiklikler Transkripsiyon faktörlerinin (Myc
vb.) aktivasyonu JAZ bozunması
SCFCOI1
7
JA uygulaması herbisit kullanımı, yaralanma, patojen enfeksiyonu, kuraklık, düĢük sıcaklık ve tuzluluk gibi çevresel strese yanıt olarak JAZ genlerinin transkripsiyonel analizini bu uyaranlara karĢı JAZ ifadesinin çok farklı indüklenmesini sağlamıĢtır (Zhang vd. 2012).
Metil jasmonat bitkinin kendi savunma sistemini sinyal olarak kullanabilir ya da zarar görmemiĢ bitkilerde bir savunma reaksiyonu üretmek için fiziksel temas ile veya hava yoluyla yayılabilir. Zarar görmemiĢ bitkiler, yaprak hücre sitoplazması aracılığıyla stomadan veya difüzyon vasıtasıyla havada bulunan MeJa‘yı bünyesine alır. Bir bitki üzerinde otobur saldırısı gerçekleĢtiğinde, diğer bitkiler için iç savunma ve sinyal bileĢiğinin MeJa üretmesini sağlar. MeJa; fitoaleksinler, nikotin ya da proteinaz inhibitörleri gibi farklı türdeki savunma kimyasallarının üretilmesi için bitkide uyarılabilir. MeJa, reseptör aracılı sinyal iletim yolu ile proteinaz inhibitor genleri (bitki içindeki savunma mekanizmasının bir yolağı) aktif hale getirir (Vidhyasekaran 2016).
MeJa, dal/kök geliĢimi, çiçeklenme, tohum ve meyve olgunlaĢmasına katılan bir bitki hormonudur. Hormonun artıĢı çiçeklenme süresi, çiçek morfolojisi ve açık çiçek sayısını etkiler. MeJa meyve olgunlaĢması için gerekli miktarda etilen miktarını arttıran etilen-oluĢturucu enzim aktivitesini uyarır. Bitki köklerinde MeJa‘nın artan miktarları köklerin büyümelerini inhibe ettiği gösterilmiĢtir. Bu, MeJA‘ın yüksek miktarlarının büyümeyi durdurmasından dolayı köklerde daha önce ifade olmamıĢ genlerin aktif olduğunu düĢündürmektedir (Vidhyasekaran 2016).
JA sinyal mekanizması iki adımdan oluĢur. Ġlki, proteazomlar tarafından bozunulmasında iĢaretlemek için ubiquitin ile etiketlenen E3 ubiquitin ligaz komplekslerini içerir. Ġkinci adım ise, fizyolojik değiĢiklikler üzerinde bir etki bırakabilmek için transkripsiyon faktörlerinin kullanılmasıdır. Bu sentez yolağında önemli moleküllerden biri, JA sinyali için açma-kapama düğmesi olarak çalıĢan JAZ‘dır. JA yokluğunda, JAZ proteinler down-stream transkripsiyon faktörlerinin bağlanma ve aktivitesini sınırlarlar. Bununla birlikte, JA veya biyolojik olarak aktif türevlerinin varlığında, JAZ proteinleri stres yanıtlarında genlerin ifadesi için gerekli
8
transkripsiyon faktörlerini serbest bırakarak degradasyona uğrar. Bu transkripsiyon faktörleri, JA sinyalinden sonra JAZ düzeyleri üzerinde farklı etkilere sahiptir. JAZ seviyeleri transkripsiyon faktörü ve gen ifade düzeylerini etkileyebilir. Diğer bir deyiĢle, aktif olan farklı yanıt genleri üzerine, transkripsiyon faktörleri JA sinyallerine yanıt olarak JAZ seviyelerini değiĢtirebilir (Vidhyasekaran 2016).
JA, yaĢlanma ile iliĢkili birçok kinaz ve transkripsiyon faktörleri ile etkileĢimde bulunabilir. JA ayrıca reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikimini uyararak mitokondriyal ölüme neden olabilir. Bu bileĢikler mitokondri zarlarını bozabilir ve apoptoz veya programlanmıĢ hücre ölümü ile hücreyi tehlikeye atabilir. Bu süreçlerde JA‘nın rolü, bitkinin biyotik zorluklar karĢısında kendini savunması ve enfeksiyonların yayılmasını sınırlandırması için mekanizmalara sahip olmasıdır (Vidhyasekaran 2016).
JA yolağı yüksek verimli bir savunma oluĢturmak için, farklı savunma yolakları ve abiyotik ve biyotik stres yanıtlarını belirlemek için cross-talk yeteneğine sahip olmalıdır. Cross-talk, bir sinyal iletim yolağının bir veya daha fazla bileĢeninin bir diğerini etkilediği durumları ifade eder. Burada da, JA cross-talk‘una en iyi örneklerden biri, Salisilik asit (SA)‘tir. SA, patogenez ile iliĢkili genlerin ifadesini ve bütün bitki patojene maruz kaldıktan sonra patojene karĢı direnç kazanan ‗Sistemik KazanılmıĢ Direnç‘i (Systemic Acquired Resistance-SAR) uyararak patojenlere karĢı savunmada aracılık eder. Bazı bitki türlerinde ise, JA‘nın SA ile olan antagonistik iliĢkisi nedeniyle viral partiküller ve diğer patojenlere karĢı artan bir duyarlılık gösterebilir (Vidhyasekaran 2016).
1.3 Transkripsiyon Faktörü Genler
Transkripsiyon faktörleri (TF), bitkilerin doğuĢtan bağıĢıklık sistemlerinde yer alan gen ifadelerinin ana düzenleyicileridir. Transkripsiyon faktörleri, hedef genlerin transkripsiyon baĢlangıç hızını ayarlayarak gen transkripsiyonu süreçlerini düzenler (Du vd. 2009). TF‘leri, savunma gen ifadesini ve bitki savunma yanıtlarını olumlu (Liu vd.
2007, Marchive vd. 2007, Qiu vd. 2007, Century vd. 2008, Moreau vd. 2012) veya olumsuz (Journot-Catalino vd. 2006, Li vd. 2006, Nurmberg vd. 2007, Zheng vd. 2006,
9
2007, Kim vd. 2008, Oh vd. 2008, Qiu vd. 2008, Peng vd. 2010, Sun vd. 2010, Moreau vd. 2012) yönde düzenlemede önemli rol oynamaktadır. Bazı sinyaller, bir sinyal yolağını negatif olarak düzenlerken, baĢka bir sinyal yolağını pozitif olarak düzenleyebilir (Nurmberg vd. 2007). TF‘ler, DNA bağlanma alanlarının türüne göre farklı ailelere veya süper ailelere sınıflandırılır. Bitki savunma yanıtlarının düzenlenmesinde rol oynayan transkripsiyon faktörlerinin önemli aileleri WRKY ailesi, bZIP (basic leucine zipper domain) ailesi, AP2/ERF (APETALA2/Ethylene- Responsıve Element Bındıng Factors), MYB (myeloblastosis related proteins), MYC (myelocytomatosis related family), NAM-ATAF-CUC (NAC) transkripsiyon faktörleri (NAM), ATAF (Arabidopsis transcription activation factor) ve CUC (Cup-shaped cotyledon) transkripsiyon faktörleri ve homeodomain transkripsiyon faktörlerini içerir (Vidhyasekaran 2016).
Transkripsiyon faktörleri, ―patojen iliĢkili moleküler modeller‖ (pathogen-associated molecular patterns-PAMPs) tarafından uyarılan bitki bağıĢıklık sinyal sistemlerinde savunma genlerinin ifadesini düzenlerler (Century vd. 2008, Moreau vd. 2012).
PAMP‘lar ve PIMP‘ler (patojen kaynaklı moleküler modeller- pathogen-induced molecular pattern) / HAMP‘ler (konak ile iliĢkili moleküler model- host-associated molecular pattern), bitki savunma yanıtlarında yer alan çeĢitli transkripsiyon faktör genlerinin açığa çıkmasını sağlar (Denoux vd. 2008, Higashi vd. 2008, Chujo vd. 2013, McLellan vd. 2013). Birçok transkripsiyon faktörünün, bitkilerde savunma yanıtlarının
―priming‖ ve ―Sistemik KazanılmıĢ Direnç (Systemic Acquired Resistance-SAR)‖i uyardığı gösterilmiĢtir (Chavan ve Kamble 2013, Nakayama vd. 2013). Elisitor (SA, MeJa, ABA, Eth gibi) veya patojen ile aktive olan transkripsiyon faktörleri, savunma gen ifadesi ve bitki direnci yanıtlarının kontrolünde önemli bir rol oynamaktadır (Marchive vd. 2007).
1.3.1 Myc2 geni (Myelo Cytomatosis 2)
Myc2 geni, JA sinyal yolağının temel regülatörüdür. Myc2 bitki büyüme ve geliĢmesinde çeĢitli endojen ve eksojen sinyalleri birleĢtiren fitohormon sinyali içinde düzenleyici bir merkez olarak hareket eder. Myc2 zararlılara ve patojenlere karĢı direnci
10
belirleyen JA sinyal yolağının iki farklı yolunu antagonistik olarak düzenleyerek JA aracılı savunma yanıtlarını koordine eder. Myc2‘nin baĢka önemli fonksiyonu ABA, SA, GA ve IAA gibi diğer fitohormonların ve JA‘nın sinyal yolakları arasında cross- talk‘ını, JA sinyali ve ıĢık, fitokrom sinyali ve sirkadiyen ritim arasındaki etkileĢimleri düzenler (Montiel vd. 2011). Myc2 ortologlar ise, ikincil metabolitlerin JA aracılı biyosentezini düzenler. Böcek ve patojen saldırısı veya yaralanmaya yanıt olarak, JA-IIe (JA ile konjüge amino asit izolösin) hızla bitki dokusunda sentezlenir (Kazan ve Manners 2013).
Myc2 tarafından salgılanan Transkripsiyon Faktörü (TF) JA sinyal yolağını açan bir transkripsiyonal aktivatördür. Myc2, JA kaynaklı genlerin promotorlarındaki sekanslardan elde edilir ve JA yolağının iki kolunu düzenler (Chico vd. 2008). Myc2, JA sinyal yolağının belirli yönlerine katılan TF‘lerinin, JA duyarlı genlerinin büyük bir bölümünün ifadesini düzenler (Pauwels vd. 2009). Gen ifadesi analizleri ve fonksiyon testlerine dayanarak, Myc2‘nin JA sinyali sırasında böceklere karĢı savunma, yaralara karĢı tepkiler, flavonoid metabolizması ve oksidatif stres toleransını pozitif bir regülatör olduğu bulunmuĢtur. Bunun aksine, Myc2 negatif olarak JA sinyali sırasında patojen savunması ve ikincil metabolizma ifadesini düzenler. Bir diğer anlatımla, Myc2 hem transkripsiyonel aktivatör hem de JA sinyallemesinin farklı yönlerinde transkripsiyonel bir baskılayıcı gibi davranır (Kazan ve Manners 2013).
Stres koĢulları JA biyosentezini uyarır. Myc2 yaralanma ve böcek zararı yanıtı, oksidatif stres yanıtı ve flavanoid sentezinde rol oynayan çeĢitli genleri pozitif yönde düzenler. Myc2 ayrıca patojen savunması ve triptofan metabolizması için ise genleri negatif olarak etkiler. Bu pozitif ve negatif geri besleme döngüleri Jasmonat yanıtının baskılayıcılarına takviye yapar. Jasmonatlar dahil bilinen birçok JAZ geninin transkripsiyonel aktivasyonu yaralanma, ozon uygulaması, tuz stresi, reaktif oksijen türleri ve bazı bakteriyel ve fungal hastalıklara karĢı bir yanıt olarak ortaya çıkar. Myc2 kendi gen ifadesi tarafından negatif olarak düzenlenir. Jasmonat yanıtının negatif otoregülasyonu Jasmonat yolağına geliĢmekte olan bir özellik katar, hem pozitif hem negatif geri besleme (feed-back) ile düzenlenmiĢ olur (Staswick 2008, ġekil 1.6).
11
Myc transkripsiyon faktörleri, yaralanma ile ilgili direnç genlerini pozitif olarak düzenler ve patojen savunma genlerinin ifadesi sırasında negatif regülatörler olarak hareket ederler (van Verk vd. 2009, Lorenzo vd. 2004). Patojen ve herbivor saldırısı altında, bitkiler, reseptörü Coronatıne Insensıtıve-1 (COI1) tarafından tanınan ve bağlanan izolösin (JA-Ileu, bir JA biyoaktif formu) ile konjuge JA üretirler. COI1 proteini, birlikte SCFCOI1 kompleksini oluĢturan; kullin, SKP1 ve RBX1 proteinleri ile birleĢen bir F-box proteinidir. JA-Ileu ve onun etrafındaki dizinin varlığı, proteinin COI1‘e bağlanmasına izin vererek, çiçek meristeminde Jasmonat-çinko-parmak protein ifadesinde bir anahtar görevi yapar. Jasmonate-Zım-Domaın (JAZ) proteinleri ve bağlanma ortakları Myc‘den ayrılarak JAZ‘a bağlanır. JAZ, Jas domain ile SCFCOI1 kompleksi ile etkileĢir. JAZ‘ın daha sonra bu kompleks tarafından yapısı değiĢtirilir ve 26S proteazomu tarafından ayrıĢtırılır (Lorenzo vd. 2004, Yan vd. 2013). Böylece, JA- Ileu‘nun varlığında, JAZ hızla Myc salınmasını ve aktivasyonunu teĢvik ederek proteolize (protein sindirim iĢlemi) olur (ġekil 1.5). Myc aktivasyonu, stres savunmasında önemli olan MYB‘ler ve WRKY‘ler gibi diğer transkripsiyon faktörlerinin ifadesi ile de sonuçlanmaktadır (Yan vd. 2013). Ek olarak Myc, JAZ proteininin transkripsiyonunu aktive eder ve JA‘nın bazal seviyede düzenlenmesini sağlar (Memelink 2009). JAZ proteinleri JA yanıtının baskılayıcıları olarak hareket eder ve JA-Ileu‘nun yokluğunda JAZ proteinlerinin (JAZ3 ve JAZ10.1 gibi) çoğunluğu Myc ile etkileĢime girme ve aktivitesini negatif olarak düzenleme yeteneğine sahiptir (Chini vd. 2007, Alves vd. 2014)
12
ġekil 1.6 Myc2 geni sinyal yolağı (https://www.sciencedirect.com 2018f)
JAZ proteinleri Myc2 ile N-terminali kısımları arasında etkileĢirler ve Jas domain çıkarıldığında, JAZ proteini bozulmaz, geri dönüĢümsüz olarak Myc2‘ye bağlanır ve dominant negatif bir baskılayıcı olarak davranır. Bu etki, JAZ proteinlerinin Myc2 ile etkileĢime girmesi için bir Jas domainine ihtiyaç duymadığını ve bu baskının, Myc2 ile JAZ N-terminal domaininin etkileĢimiyle gerçekleĢtiğini göstermektedir (Memelink 2009). Myc‘nin bu etkileĢim ve düzenleme modeli, tüm JAZ proteinlerine uygulanamaz çünkü JAZ3 proteininin Myc2 ile etkileĢimi, farklı bir mekanizma ile meydana gelmektedir. JAZ3‘teki bir Jas domain delesyonu, bu proteinin Myc2 ile etkileĢime girememesini sağlar ve JAZ3‘ün Myc2 ile etkileĢimi için Jas domain‘in kendisinin
13
yeterli olduğu gösterilmiĢtir (Chini vd. 2009). Bu nedenle, JAZ3‘ün Jas domaininden Myc2‘ye bir dimer olarak bağlanmasının etkilediği ve JAZ‘ın etkisini bastırdığı öne sürülmektedir. Ġlginç olan ise, Myc2‘nin, JAZ3‘ün C-terminal bölgesindeki bir delesyondan türetilen kısaltılmıĢ bir protein tarafından geri döndürülemeyecek Ģekilde etkisiz hale getirilmesidir. Bu etkileĢimin, N-terminal domain aracılığıyla baĢka bir JAZ proteini ile heterodimerizasyon yoluyla gerçekleĢtiği ve bunun da, geri dönüĢü olmayan bir Ģekilde Myc2‘ye bağlandığı ve böylece dominant negatif bir baskılayıcı görevi gördüğü öne sürülmüĢtür (Memelink 2009, Alves vd. 2014).
1.3.2 WRKY1 geni
WRKY ailesinden birçok gen, embriyogenez (Lagace ve Matton 2004), çekirdek katmanı ve trikom geliĢimi (Johnson vd. 2002), yaprak yaĢlanması (Miao ve Zhetgraf 2007, Zhou vd. 2011) ve çeĢitli bitki abiyotik ve biyotik stres yanıtlarının yanı sıra çeĢitli bitki geliĢim ve fizyolojik süreçlerinde (Du ve Chen 2000, Eulgem vd. 2000) önemli rol oynamaktadır (Guo vd. 2014) WRKY proteinleri tohum geliĢimi, yaĢlanma, dormansi ve çimlenme ve diğerlerinin yanı sıra abiyotik ve biyotik stresler gibi bitkilerde çeĢitli moleküler olaylarda rol oynamaktadır (Rushton vd. 2010, 2012).
WRKY ailesinin çok sayıda üyesi patojen enfeksiyonu ile iliĢkilidir ve bu nedenle bitki bağıĢıklığı için önemli faktörlerdir. Asmada toplam 59 putatif VvWRKY transkripsiyon faktörü tanımlanmıĢtır (Wang vd. 2014e). WRKY ve WRKY ile iliĢkili elisitörler arasındaki etkileĢimler sinyalizasyon, transkripsiyon, kromatinin yeniden biçimlendirilmesi ve diğer hücresel süreçlerde rol oynayabilir (Chi vd. 2013).
WRKY genlerinin oluĢturduğu transkripsiyon faktörleri, Salisilik asit veya Jasmonik asit bağımlı sinyal yolağında savunma genlerinin ifadesini aktive eder. Jasmonik asit sinyal yolağının aktivasyonu ile küllemeye karĢı asmanın direncinin arttığı bulunmuĢtur. Salisilik asit ve Jasmonik asit birçok genin aktivasyonu için antagonisttirler ve savunma mekanizmalarına farklı etki ederler. Patojen saldırısı veya yaralanma ile JA birikir ve sekonder metabolitlerin (alkaloidler, fenolik bileĢikler, terpenler) ve patogenez ile iliĢkili proteinlerin birikmesi gibi savunma yanıtlarının farklı bir yolağını oluĢturur (Marchive vd. 2013, Guo vd. 2014).
14
JA, çeĢitli transkripsiyon faktörlerinin ifadesini tetikleyebilir. WRKY transkripsiyon faktörünün ifadesi ve fonksiyonu birçok çalıĢmada, Metil jasmonat (MeJA) ile indüklenmiĢtir (Mao vd. 2007, Peng vd. 2012, Li vd. 2014, Sun vd. 2013, Jiang vd.
2014, Le Hénanff vd. 2013). JA ayrıca bazı transkripsiyon faktörlerinin ifadesini azaltabilir (Wang vd. 2009).
WRKY transkripsiyon faktörleri, hedef genlerin promotorlarında bulunan "W-box"
olarak bilinen bir cis elementine bağlanarak iĢlev görür (Rushton vd. 1996, Eulgem vd.
1999). Savunmayla iliĢkili çok sayıda genin promotorları, WRKY proteinleri tarafından tanınan W-box sekansları içerir ve WRKY transkripsiyon faktörleri, bu savunma genlerinin uyarılabilir ifadesi için gerekli olduğu gösterilmiĢtir (Eulgem vd. 1999, 2000, Yu vd. 2001, Ülker ve Somssich 2004, Shimono vd. 2007, van Verk vd. 2008).
Patogenezle iliĢkili (PR) genler ve düzenleyici NPR1 geni içeren çok sayıda bitki savunması veya savunma ile ilgili genler, WRKY proteinleri tarafından tanınan promotorlarında W-box dizileri içerir (Yu vd. 2001, Eulgem ve Somssich 2007, ġekil 1.7).
ġekil 1.7 WRKY1 geni sinyal yolağı (http://emboj.embopress.org/content/18/17/4689 2018c)
15
WRKY transkripsiyon faktörleri, SA‘ya bağımlı savunma yanıtlarının önemli düzenleyicileridir (Maleck vd. 2000, Wang vd. 2006). WRKY proteinlerinin, SA uygulamasına yanıt olarak gen ifadesinin değiĢtirilmesinde güçlü bir Ģekilde rol oynadığı gösterilmiĢtir (Dellagi vd. 2000, Asai vd. 2002, Chen ve Chen 2002, Yoda vd.
2002, Kalde vd. 2003). PR genleri de dahil olmak üzere çok sayıda savunmayla ilgili genin promotorları, WRKY proteinleri tarafından tanınan W-box dizileri içerir (Yu vd.
2001). WRKY transkripsiyon faktörlerinin bazıları, SA-aracılı savunma geni ifadesinin negatif düzenleyicileri olarak rol oynayabilir ve patojenin neden olduğu PR gen ifadesini negatif olarak düzenledikleri gösterilmiĢtir (Journot-Catalino vd. 2006, Wang vd. 2006, Xu vd. 2006, Zheng vd. 2007, ġekil 1.8).
ġekil 1.8 WRKY gen ailesi sinyal yolağı (https://bmcgenomics.biomedcentral.com 2018d)
JA biyosentez yolağının aktivasyonunda bazı transkripsiyon faktörlerinin rol oynadığı bildirilmiĢtir. LOX, JA biyosentez enzim lipoksijenazı kodlar. Linolenik asit, hidroperoksit türevlerine lipoksijenazlar (LOX‘ler) ile oksijenlenmektedir. Diğer
16
reaksiyon, 13-hidroperoksi-linolenik asidi (13-HPOT) bir kararsız allen oksit ara maddeye dönüĢtüren allen oksit sentaz (AOS) ile katalize edilir ki bu da bir allen oksit siklaz (AOC) tarafından 12-okso-fito- dienoik asit (OPDA) oluĢturmak üzere modifiye edilmiĢtir. OPDA, JA biyosentez yolunda önemli bir aracıdır (Balbi ve Devoto 2008, Sun vd. 2011, Kombrink 2012, Wasternack ve Hause 2013). AOS2, allen oksit sentazını kodlar ve WRKY, hem LOX hem de AOS2 gen ifadesini tetikler (Peng vd. 2012).
WRKY ailesine ait transkripsiyon faktörleri, histondaki asetil gruplarının çıkarılmasını katalize eden histon deasetilazlar gibi kromatin yeniden modelleme proteinleri ile de etkileĢime girebilir. Bu etkileĢim DNA‘nın daha eriĢilmez hale gelmesine neden olmakta, böylece bu bölgede mevcut olan bir genin ifadesini bastırmaktadır (Zhou vd.
2005). Kalmodulin proteini (CaM), ökaryotik hücrelerde Ca2 + sinyalinin bir modülatörüdür (Hoeflich ve Ġkura 2002). Kalmodulin, WRKY‘ler dahil olmak üzere çeĢitli proteinlerle etkileĢir (Park vd. 2005).
Bir transkripsiyon faktörü olan VvWRKY‘nin, hastalıklara dirençli bitkileri geliĢtirmek için potansiyel bir araç olduğu bulunmuĢtur. Vitis vinifera L.‘den izole edilen transkripsiyon faktör geni, VvWRKY1, transgenik asma bitkilerini geliĢtirmek için kullanılmıĢtır. VvWRKY1 ifadesinin meyve spesifik olmadığını ve meyve ve yapraklarda geliĢim sırasında güçlü bir Ģekilde düzenlendiği bilinmektedir. VvWRKY1 ifadesi ‗Ben düĢme‘den önce meyvelerde çok zayıf görülmüĢtür ancak ‗Ben düĢme‘de devam ederek önemli bir artıĢ olmuĢtur. Bu genlerden bazıları duyarlı bir çeĢitte patojen enfeksiyonu tarafından indüklense bile, PR genlerinin artan ifadesi külleme direnci ile iliĢkili görünmektedir (Marchive vd. 2007). VvWRKY1‘i aĢırı ifade edilen genler, JA biyosentezinde rol alan iki lipoksijenaz genini (LOXO ve LOXA) ve JA sinyalizasyonunda transkripsiyonel baskılayıcılar olan JAZ1 ve JAZ2‘ye benzer proteinleri kodlayan iki gen içermektedir (Marchive vd. 2013). VvWRKY1‘i ifade eden bitkilerde patojenin sporulasyonu önemli ölçüde azalmıĢtır (Marchive vd. 2007).
Transkripsiyon faktörlerini aĢırı ifade eden bitkiler, değiĢmiĢ yaprak morfolojiler ve çiçeklenme zamanında değiĢiklikler göstermiĢtir (Chen ve Chen 2002, Robatzek ve Somssich 2002, Li vd. 2004). Bununla birlikte, VvWRKY1‘i aĢırı ifade eden bitkileri, kontrol bitkileriyle karĢılaĢtırıldığında herhangi bir fenotipik değiĢiklik görülmemiĢtir
17
(Marchive vd. 2007). Bu gözlemler transkripsiyon faktörü VvWRKY1‘in hastalığa dirençli bitkilerin geliĢtirilmesinde yararlı olabileceğini düĢündürmektedir (Vidhyasekaran 2016).
Asma mildiyö patojeni, enfekte asma yapraklarında VvWRKY2 ifadesini tetikler.
VvWRKY2 genini ifade eden bitkiler, bu bitkilerinin farklı kısımlarını enfekte eden patojenlere karĢı direnç göstermiĢtir. Botrytis cinerea yaprakları enfekte ederken, Pythium spp. kökleri enfekte eder ve Alternaria tenuis tütün bitkilerinin tohumlarını enfekte eder. VvWRKY2, her üç fungal patojen grubuna karĢı direnç göstermiĢtir (Mzid vd. 2007). ÇalıĢmalar, VvWRKY2‘nin hastalığa dirençli bitkileri geliĢtirmek için tasarlanabilen bir baĢka potansiyel WRKY transkripsiyon faktörü olduğunu düĢündürmektedir. VpWRKY3, Çin yabani asması Vitis pseudoreticulata‘dan izole edilen bir transkripsiyon faktörüdür. VpWRKY3, özellikle Vitis pseudoreticulata‘da Erysiphe necator tarafından enfeksiyona yanıt olarak birikmiĢtir (Zhu vd. 2012b).
Vitis pseudoreticulata, VpWRKY1 ve VpWRKY2‘den diğer iki WRKY proteininin, Vitis pseudoreticulata’daki külleme patojeni Erysiphe necator‘a karĢı direnç oluĢturduğu bulunmuĢtur (Li vd. 2010). Bu çalıĢmalar, VpWRKY proteinlerinin farklı bitkilerde patojenlere karĢı direnç kazandırmada önemli bir rol oynayabileceğini düĢündürmektedir. Sonuçlar, özellikle VvWRKY1‘in mildiyö ve küllemeye dayanıklı asma türü geliĢtirmek için potansiyel bir araç olduğunu göstermektedir (Vidhyasekaran 2016).
1.3.3 Dehidrin geni
Asma dehidrin (DHN) ailesi dört üyeden oluĢmaktadır. Bunlar DHN 1, 2, 3, 4‘tür. Bu 4 genin iĢlevlerinin birbiri içine geçme olasılığı yüksek iken, DHN1‘in ana stres yanıt fonksiyonunu sağladığı anlaĢılmıĢtır. Dehidrinler, çevresel stres sırasında kuruma hasarından bitki hücrelerini korurlar ve çeĢitli patojenlere karĢı konak direnci sağlarlar.
Özellikle DHN1 geni stres koĢullarında ifade bulur. Bu genler geç embriyogenez safhasında kuraklık, düĢük sıcaklık, yüksek tuz, Erysiphe necator ile tetiklendiğinde vejetatif dokularda ifade bulmuĢtur (Nylander vd. 2001, Xu vd. 2008, Kim vd. 2010).
18
DHN‘ler külleme enfeksiyonuna karĢı yüksek derecede ifade göstererek yanıt vermektedir. Özellikle DHN1 geninin küllemeye karĢı dirençte rol oynadığı görülmüĢtür (Yang vd. 2012). Bununla birlikte, dehidrasyon veya yüksek sıcaklık koĢulları altında proteinlerin bir araya toplanmasını veya inaktivasyonunu önlemek için Ģaperonlar gibi davranarak membran stabilizasyonu yoluyla iĢlevlerini yerine getirebildikleri bildirilmiĢtir (Peng vd. 2008, Kovacs vd. 2008, Brini vd. 2011).
Fosforilasyonun DHN‘lerin substrat bağlanması için önemli bir faktör olduğu bulunmuĢtur (Riera vd. 2004, Alsheikh vd. 2005, Rahman vd. 2011).
Bitkilerde DHN‘lerin birikimi desikasyon (kuruma) toleransı ile iliĢkili olduğu düĢünülmektedir ve bitkisel dokularda bu genlerin ifade seviyeleri genel olarak duyarlı muadillerine göre kuraklığa daha dayanıklı çeĢitlerde daha yüksek olduğu belirlenmiĢtir.
Ancak toleranslı ve duyarlı genotipler arasındaki ifade seviyelerinin farklılığı, stres süresince DHN genlerine bağlıdır (Hanana vd. 2014).
Normal büyüme koĢulları altında DHN1‘in esas olarak tohumlarda ifade edilmekte ve köklerde çok düĢük seviyelerde bulunmaktadır. DHN2, tüm dokularda yapısal olarak ifade bulurken, yaprak ve saplarda, çalıĢılan diğer organlardan daha düĢük seviyelerde ifade bulmaktadır. DHN1 ve DHN2, çiçeklenmeden 6 gün önce çiçek tomurcuklarında ifade bulmakta, sonra transkriptleri embriyogenezin orta evrelerinde azalmakta ve ilerleyen safhalarda bir kez daha artan ifade göstermektedir. DHN3 geni son derece düĢük seviyelerde tohum geliĢimi sırasında ifade bulmuĢtur. Tohum geliĢiminin hem orta hem de geç dönemlerinde düĢük DHN3 seviyeleri tespit edilirken, DHN4 transkriptleri ‗Ben-düĢme‘den hemen önce geliĢen pik ifadesi ile sadece embriyogenezin geç safhaları sırasında saptanabilmiĢtir. Bu sonuçlar, sırasıyla Vitis vinifera L. ve Vitis yeshanensis DHN gen ailelerini oluĢturan dört DHN geninin, çalıĢılan organlarda çok farklı ifade Ģekilleri sergilediğini göstermektedir (Yang vd.
2012).
DHN1 geni kuraklık, soğuk, sıcak, embriyogenezis ve absisik asit (ABA), Salisilik asit (SA) ve Metil jasmonat (MeJA) uygulaması ile Vitis vinifera L. ve Vitis yeshanensis’de indüklenmiĢtir. DHN2 geni soğuk, sıcak, embriyogenez ve ABA ile Vitis vinifera L. ve
19
Vitis yeshanensis’de indüklenmiĢtir. Ancak kuraklık, Erysiphe necator enfeksiyonu, SA veya MeJA‘ya yanıt vermemiĢtir. Ne DHN3 ne de DHN4, yapılan herhangi bir uygulamaya (biyotik ve abiyotik streslere ve sinyal moleküllerine) yanıt vermemiĢtir (Yang vd. 2012, ġekil 1.9).
ġekil 1.9 Dehidrinler ile ilgili bir sinyal yolağı (https://bmcplantbiol.biomedcentral.com 2018e)
Asma külleme etmeni Erysiphe necator ile inokülasyondan sonra Vitis yeshanensis ve Vitis vinifera L.‘de DHN1 artan bir ifade göstermiĢtir. DHN1‘in ifade seviyesi, dirençli Vitis yeshanensis’de duyarlı Vitis vinifera L.‘den daha yüksek bulunmuĢtur ve Vitis vinifera L.‘de eksik olan ikinci bir indüksiyon olayı Vitis yeshanensis‘de de görülmüĢtür (Yang vd. 2012). MeJA uygulanmıĢ yapraklardan DHN1 transkriptleri, uygulamadan bir süre sonra maksimum indüksiyona ulaĢmıĢtır. Vitis vinifera L.‘de DHN1, savunma yanıtında yer aldığı bilinen SA ve MeJA sinyal molekülleri tarafından indüklenerek sistemik kazanılmıĢ dirençte (Systemic Acquired Resistance-SAR) rol oynamaktadır (Pieterse vd. 2009).
