Primer Tasarımı
PCR
PCR
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
• DNA ya da RNA dizilerini eksponensiyal olarak amplifiye etmeye yarayan yöntem.
• Temel gerekliler
– kalıp DNA ya da RNA
– Kalıp DNA’nın farklı iki yerine spesifik 2 oligonükleotid primeri
– Isıya dayanıklı DNA polimeraz
– 4 dNTP ve tampon
Primer nedir?
Primer, PZR’den sekanslamaya pek çok moleküler
teknikte kullanılan kısa sentetik oligonükleotitlerdir.
Primerler nereden gelir ?
• Tek sarmal DNA olarak kimyasal olarak sentezlenir.
• Genellikle 15-25 nükleotid uzunluğundadır.
• Nükleotid sekansı bilinen kalıp DNA sekansı
kullanılarak belirlenir.
Dikkat edilemesi gereken noktalar
Spesifiklik
Hedef sekansa 100% uyum (
nonspesifik bağlanmalardan kaçınılmalı)
Stabilite
PZR koşullarında kalıp DNA ile stabil hibrit oluşturma
Uyumluluk
Çift olarak kullanılan primerlerin aynı PZR
kondisyonlarında çalışması gereklidir
Tek, özgün Uzunluk
Bağlanma sıcaklığı
Primer Çiftinin Uyumu Internal yapı
Baz kompozisyonu İnternal stabilite
Primerlerin Nitelikleri: Primer Tasarımı:
Erime sıcaklığı
Özgünlük
Kalıp DNA üzerinde primerlerin bağlanabileceği sadece bir tek hedef bağlanma bölgesi olabilir. Primereri özgün kılan bu özelikleridir.
Olası kontaminant kaynaklarda bağlanma bölgesi omamalı.
BLAST!!
Primer adayı 1 5’-TGCTAAGTTG-3’
Primer adayı 2 5’- CAGTCAACTGCTAC-3’
TGCTAAGTTG CAGTCAACTGCTAC
Template DNA
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3
’
Eşsiz değil ! Eşsiz!
TGCTGAGTTG
Uzunluk
Primer uzunlukları primerin özgünlüğünü, erime/bağlanma sıcaklığını etkiler Primer uzun oldukça = daha özgün
Primer uzun oldukça = Yüksek erime/bağlanma sıcaklığı.
Genel olarak, primerin uzunluğu, özgünlüğü sağlamak amacıyla en az 15 nukleotid omalıdır.
Primerler genel olarak 17-28 baz uzunluğunda tasarlanır. Bu aralık doğru Tm ve
uzunluk ilşkisi yakalamaya bağlı olarak değişiklik gösterir.
Baz Kompozisyonu
Baz kompozisyonu hibridizasyon spesifisitesini, erime/bağlanma sıcaklığını ve internal stabiliteyi etkiler.
Rastgele baz kompozisyonu tercih edilir. (A+T) ve (G+C) bazları açısından zengin bölgelerden kaçınılır.
• Genellikle ortalama (G+C) içeriği %50-60 civarında olan primerler en optimum erime/bağlanma sıcaklığını verirler. Ancak bu sıcaklıkları
etkileyen diğer faktörler de vardır.
Kalıp DNA
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGCA...AAGATGCACGGGCCTGTACACAA...3’
TGCCCG
GCCCGATCATGCT T GC CAT CG CG AT GCC GCC T
Erime Sıcaklığı
Erime sıcaklığı, T
m– DNA sarmalının yarısının tekli sarmal yarısının çift sarmal haline geldiği sıcaklıktır.
Tm DNA kompozisyonundan etkilenir. G+C içeriği fazla ise Tm, H
bağları sebebiyle yüksek olur.
Primer Erime Sıcaklığı
Basit metod (Thein ve Wallace 1986):
A ve T = 2
oC
G ve C = 4
oC Tm: 2*(A+T)+4*(G+C)
Primer dizisinde bulunan A ve T sayısı toplanır ve 2 ile çarpılır,
Primer dizisinde bulunan G ve C sayısı toplanır ve 4 ile çarpılır.
Bu iki sayı birbiri ile toplanır, bu değer yaklaşık erime sıcaklığını verir.
Bağlanma sıcaklığı: Tm-4
oC
Melting Temperature T
m(
oK)=
{ΔH/ ΔS + R ln(C)}, Or Melting Temperature T
m(
oC) = {ΔH/ ΔS + R ln(C)} - 273.15
where
ΔH (kcal/mole) : H is the Enthalpy. Enthalpy is the amount of heat energy
possessed by substances. ΔH is the change in Enthalpy. In the above formula the ΔH is obtained by adding up all the di-nucleotide pairs enthalpy values of each nearest neighbor base pair.
ΔS (kcal/mole) : S is the amount of disorder a system exhibits is called entropy.
ΔS is change in Entropy. Here it is obtained by adding up all the di-nucleotide pairs entropy values of each nearest neighbor base pair. An additional salt
correction is added as the Nearest Neighbor parameters were obtained from DNA melting studies conducted in 1M Na+ buffer and this is the default condition used for all calculations.
ΔS (salt correction) = ΔS (1M NaCl )+ 0.368 x N x ln([Na+])
WhereN is the number of nucleotide pairs in the primer ( primer length -1).[Na+] is salt equivalent in mM.
[Na+] calculation:
[Na+] = Monovalent ion concentration +4 x free Mg2+.
T
a= 0.3 x T
m(primer) + 0.7 T
m(product) – 14.9
where,T
m(primer) = Melting Temperature of the primers T
m(product) = Melting temperature of the product
Annealing Temperature
Primer Bağlanma “Stringency”
Stringency çoğalan DNA ürününün spesifikliğini belirler.
T
bağlanmaprimerin bağlanmasındaki stringency’i etkileyen en belirgin faktördür.
• T
bağlanma:
çok düşük ise daha az stringent primer başka bölgelere bağlanabilir çok yüksek ise daha fazla stringent primer bağlanamayabilir
Diğer Faktörler:
• GC%: GC çiftleri AT çiftlerine göre daha stringenttır.
• Tuz & Tampon
Internal Yapı
Eğer primerler kalıp DNA’ya bağlanmak yerine kendi kendilerine ya da birbirleri ile bağlanırlarsa PZR’nin verimi büyük ölçüde düşer.
Bu 2 yapılar eğer bağlanma sıcaklığı izin vermezse zararlı olmayabilirler.
Mesela bazı dimerler ve saç tokası yapıları 30 C’de oluşurlar, ancak PZR
sırasında en düşük sıcaklık 60 C bağlanma sıcaklığı ise bu ikincil yapılar
oluşamazlar.
Primer Çifti Uyumu
Primerler çift olarak çalışırlar– ileri ve geri primerler
İki primer de aynı PZR reaksiyonunda çalışacağı için, PZR koşullarının her iki primer için de uygun olması gerekir.
Önemli özelliklerden bir tanesi bağlanma sıcaklığıdır. Primer
çiftinin sıcaklığı birbiri ile uyumlu olmalıdır. Aralarındaki
kabul edilebilinecek maksimum fark 3 C olabilir.
Özet ~ Primer Tasarım Kriterleri
1. Özgünlük: doğru bağlanma bölgesi;
2. Uzunluk: 17-28 baz. değişken;
3. Baz kompozisyonu: ortalama (G+C) içeriği %50-60 civarında olmalıdır; uzun (A+T) ve (G+C) zengin bölgelerden kaçınılmalı;
4. Baz çiftleşmesinin optimizasyonu: Yanlış eşleşmeyi engellemek için 5’ ucunudaki stabilitenin fazla 3’stabilitenin az olması gerekmektedir.
5. Erime sıcaklığı (Tm) 55-80 C arasında olmalıdır;
6. Primer çiftleri arasındaki Tm farkı en fazla 2-3 C olabilir.
7. Internal ikincil yapılar engellenmelidir: dimerler ve saç tokası
yapıları
Özet ~ “primer” ne zaman primerdir?
Özet ~ “primer” ne zaman primerdir?
5’ 3’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
Dejenere Primerler
• Benzerlik ilişkisini göz önünde bulundurarak yeni genler bulmak için kullanılır.
• Bir organizmanın genomunda korunmuş bölgeleri amplifiye etmek için kullanılır.
• Hizalanan diziler arasında özgün bir bölge bulunmadığı taktirde “Universal” primer
tasarlamak için kullanılır.
Dejenere Primerler
• eg:
5’-TCG AAT TCI CCY AAY TGR CCN T-3’
Y = pYrimidines = C / T (degeneracy = 2X) R = puRines = A / G (degeneracy = 2X) I = Inosine = C / G / A / T
N = Nucleotide = C / G / A / T (degeneracy = 4X)
Abbreviation Letter Nucleotide Represented
A A
C C
G G
T T
R AG
Y CT
M AC
K GT
W AT
S CG
B CGT
D AGT
H ACT
V ACG
N ACGT
Dejenere Primerler
ATG A[T/C]A AA[T/C] ATC CGA AAA AC[T/A/C]C A A potential degenerate primer:
Y Y H
Dejenere Primerler
• Dejenerasyonu kompanse etmek için primer konsantrasyonlarının fazla kullanılması gerekir (>50 pmol).
• Birden fazla bağlanma bölgesi
• Ürün oluşmayabilir
Universal Primers
Primers can also be designed to amplify multiple products. We call such primers “universal primers”. For example, design primers to amplify all HPV genes.
Strategy:
1. Align groups of sequences you want to amplify.
2. Find the most conservative regions at 5’ end and at 3’ end.
3. Design forward primer at the 5’ conservative region.
4. Design reverse primer at the 3’ conservative regions.
5. Matching forward and reverse primers to find the best pair.
6. Ensure uniqueness in all template sequences.
7. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.
Semi-Universal Primers
Primers can be designed to amplify only a subset of template sequences from a large group of similar sequences. For example, design primer to amplify HPV type 1 and type 6 gene, but not other types.
Strategy:
1. Align all types of HPV genes.
2. Identify a subset of genes that are more similar to each other than to other subsets. In this case, type 1 and type 6.
3. Find the 5’ and 3’ regions that are conserved between type 1 and type 6, but are variable in other types.
4. Design forward primers from the 5’ region and reverse primers from the 3’ region.
5. Matching forward and reverse primers to find the best pair.
6. Ensure uniqueness in all template sequences.
7. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.
Primer Design Tools
• AutoPrime Primer design for real-time PCR measurement of eukaryotic gene expression.
• ExonPrimer Design intronic primers for PCR amplification of exons. Input needed: a cDNA and the corresponding genomic sequence.
• IDT AntiSense Design Antisense oligo design and selection tool.
• IDT Oligo Analyzer Online calculation of oligonucleotide parameters such as melting temperature. Shows self-dimers, hairpin, and performs Blast.
• IDT PrimerQuest Primer and probe design and selection.
• Oligonucleotide Analyzer Generates Tm, free energy, molecular weight and hairpin and dimer formation structures.
• Primer3 Utility for locating oligonucleotide primers for PCR amplification of DNA sequences.
• PrimerX Automated design of mutagenic primers for site-directed mutagenesis.
• Primo Pro PCR Primer Design.
• RNAi Design Design duplexed RNA oligos for RNA interference.
• SiteFind Design of oligonucleotide primers for site-directed-
mutageneis that include a novel restriction for use as a
marker of successful mutation.
MethPrimer (Long-Cheng Li, UCSF)
A free online program for designing primers for methylation specific PCR (MSP) and bisulfite sequencing PCR.
Primerfinder (Univ. of Texas-SW Med. Ctr)
Easy to use, free, online primer design program Primo (Chang Bioscience)
Primo online is a friendly PCR primer design tool. It reduces PCR noise by lowering the probability of random primering.
The PCR Suite (Van Baren MJ, Heutink P, Erasmus Medical Center)
Primer Design Tools
Primer3
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/
Primer3
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/
