Dr. Güven Toksoy, PhD İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD
Moleküler Dizileme Teknolojileri
31.10.2014 22:44 1
• Klasik dizileme
– Sanger dizileme
– Maxim Gilbert dizileme tekniği
• Yeni nesil dizileme teknolojileri
2. Nesil dizileme
Illumina (Reversible Dye Terminator)
Ion Torrent (native dNTP proton detection)
Roche (Pyrosequencing) (çekildi, teknoloji değişikliği ?) Solid ABI (Ligation based) (çekildi)
3. Nesil dizileme (henüz rutinde yok 2-3 yıl)
PacBio Real time sequencing (amplifikasyon gerekmiyor)
Helicos (Reversible Dye Terminator) (amplifikasyon gerekmiyor)
Oxford Nanopore (porotic ion detection) (amplifikasyon gerekmiyor)
31.10.2014 22:44 2
Karşılaştırma
SANGER DİZİLEME YENİ NESİL DİZİLEME (2. nesil)
Sınırlı büyüklük Tüm genoma kadar
900-1000 bp 75-400 bp
Tüm dizi tek çıktı Her bir hedef için çok kopya Mozaiklik için yetersiz Mozaiklik için uygun
Dizi başına ~5 USD (baz başına 5/1000USD) Exom ~500 USD (500/30x10
3USD) Motiften bağımsız yüksek özgünlük Motife göre değişen özgünlük Altyapı göreceli ucuz Altyapı pahalı
Run maliyeti ucuz* Run maliyeti pahalı*
31.10.2014 22:44 3
+ +
MgCL2
+
MgCL2
MgCL2
MgCL2 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4
(NH4)2SO4 KCl
KCl KCl
+
Dizilenecek PCR ürünü
Dizilenecek hedef bölgeye uygun
primer
İşaretli dNTP ve ddNTP karışımı
Polimeraz enzimi
SANGER Dizileme PCR
31.10.2014 22:44 4
3 ’ G A C T A G A T A C G A G C G T G A 5’Template DNA 5 ’ C T G A TCTATGCTCGCACT 3 ’
Elektroforez*
C T G A TC T G A T CC T G A T C TC҉ T҉ A҉ C T G A T C T A TG҉ C T G A T C T A T GC҉ C T G A T C T A T G CT҉ C T G A T C T A T G C TC҉
C T G A T C T A T G C T CC T G A T C T A T G C T C GC T G A T C T A T G C T C G CC T G A T C T A T G C T C G C AC T G A T C T A T G C T C G C A CG҉ C҉ A҉ C҉ T҉
z a m a n
C T G A T C T AT҉
A G T C T
C A C G C T C G T A T C
O K U M A
Y Ö N Ü
*işaretli nükleotid ile sonlanmış binlerce kopya içeren fragmanlar
Primer dizisi
31.10.2014 22:44 5
Yeni Nesil Dizileme
• Next generation sequencing (Yeni nesil dizileme)
• Deep sequencing (Derin dizileme)
• Massivelly parallel sequencing (Masif paralel dizileme)
• High-throughput sequencing (Yüksek kapasiteli dizileme)
Second generation sequencing Illumina (Reversible Dye Terminator)
Roche (Pyrosequencing) (??)
Solid ABI (Ligation based) (çekildi)
Ion Torrent (native dNTP proton detection)
Third generation sequencing
PacBio Real time sequencing (amplifikasyon gerekmiyor)
Helicos (Reversible Dye Terminator) (amplifikasyon gerekmiyor)
Oxford Nanopore (porotic ion detection) (amplifikasyon gerekmiyor)
31.10.2014 22:44 6
İş akışı
Dizileme (Sequencing)
Kütüphane hazırlanması (Library preparation)
Veri analizi (Data analysis)
DNA örnekleri fragmante edilir (ya da hedef fragmanlar elde edilir), fragmanların ucuna platforma özgün
adaptörler takılır
PCR ile amplifiye edilir (platforma spesifik ortamda)
Yeni nesil dizilemede DNA sentezi ve okuma işlemi aynı anda gerçekleşir ve eşzamanlı olarak bir çok dizileme yapılır (Massively parallel sequencing)
(kısa okuma ve hatalı okumanın ana nedeni de bu işlem sırasındaki desenkronizasyondur)
RAW data analizi, dizilerin filtrelenmesi, assambling, varyasyon analizi, biyoinformatik analiz
31.10.2014 22:44 7
• De novo sequencing
• Resequencing
• Targeted sequencing
• Shotgun Targeted sequencing
VERİ BÜYÜKLÜĞÜ
normal
Polimorfizm
Patolojik/
olası patolojik Gri bölge
Terimler
• Whole genome sequencing
• Exom sequencing
• Targeted sequencing
• Sanger sequencing
31.10.2014 22:44 8
Yeni nesil dizileme ile tanı
İşlem sonrası Elde edilen bilgi
Sonuç
Lab iş gücü
Nadir/de novo varyasyonlar
ya da etkisi bilinmeyen mutasyonlar Polimorfizm
Normal diziler
Fenotip ilişkili mutasyon
Biyoinformatikçi
31.10.2014 22:44 9
31.10.2014 22:44 10
Yeni nesil dizileme ve cfDNA çalışmaları
cfDNA ile anöplodi taraması
FİRMA-MARKA PLATFORM ANALİZ TEKNİĞİ ve ALGORİTMA
BGI:NIFTY Illumina Hiseq& İon proton MPSS
SEQUENOIM: Materni T21Plus Illumina Illumina Hiseq t-MPSS Verinata Health: Verifi Prenatal test Illumina Hiseq S-MPSS
Integrated Genetics: Ariosa: Harmony Illumina Hiseq DANSR + FORTE (t-MPSS)
Natera:Panorama Illumina Hiseq Non kantatif - SNP tabanlı targeted
dizileme ~20.000 SNP
Premaitha healt: Iona test (2015 ocak) İon proton S-MPSS + Fetal fraksiyon düzeltmesi
MPSS:Massively parallel signature sequencing
FORTE:Fetal-fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation
NIFTY, Natera ve Sequanom Digeorge ve diğer mikro del/dup sendromları için sonuç veriyor.
31.10.2014 22:44 11
Sayılar
- 10 milyon adet 25-30 bp uzunlukta dizi elde edildiinde total genomun yaklaşık %4 ü dizilenmiş oluyor. Bunlardan %50 si unique dizi. Chr13 için ~154.000, chr18 135.000 ve chr21 için 65.700 dizi haritalanabiliyor.
(H. Christina Fan, PNAS, October 2008)- Trizomi21 li fetus taşıyan gebelikte örnekten 10.800.000. okuma elde edililirken sadece bu okunan dizilerden 21. kromozoma ait 32 000 tanesi (%0,3) anöploidi hesaplamasında kullanılabiliyor
(Chiu RW, Proc Natl Acad Sci USA 2008)- Fetal plasental DNA fraksiyonu kromozomal dozun hesaplanmasında çok önemli ve spesifiteyi arttırıyor.21. Kromozoma ait %4 oranında DNA taşıyorsa bunun trizomi durumunda %2 artış beklenmelidir. Yüksek güvenilirlik için yaklaşık 93.000 adet 21. kromozoma ait dizinin elde edilmesi gerekir. Bu da 21. kromozom DNA yükü total genomun % 1,5 olduğu için toplam okunabilir dizi sayısının minimum 6.3 milyon, ortalama MPSS verimi %25 olduğundan yaklaşık örnek başına toplam 25.000.000 okuma yapmak gerekmektedir.
(Andrew B. Sparks, P APRIL American Journal of Obstetrics & Gynecology, 2012)- Targeted SNP çalışmalarında yaklaşık 25.000 yüksek polimorfizm gösteren SNP bölgesi taranıyor.
31.10.2014 22:44 12
cfDNA
Plazmada serbest DNA fragmanları ≤300bp
Köken: Plasenta sitotrofoblast ve sinsisyotrofoblast hücreleri apoptosis ve yıkımı
Plasenta kökenli DNA <%10
Maternal DNA ≥%90
Eritrositler Lenfositler
Plazma
- İnsan genomu ~3 milyar baz uzunluğunda
- Rastgele kırılmış halde milyonlarca küçük fragman - chr13 %3,7; chr18 %2,5 chr21 %1.5’ ini oluşturuyor
- Plasental DNA parçacıkları total havuzda fraksiyon %10 ise chr13 % 0,37; chr18 %0,25; chr21 %0,15
Perferik kan
31.10.2014 22:44 13
cfDNA nın yeni nesil dizilemede kullanımı
Kantitatif: Amplifikasyon sonrası karşılaştırmalı ürün artışının
saptanması Kalitatif: Plasental DNA dan elde edilen
baba kökenli dizide anneden farklı baz değişiminin gösterilmesi
Plasental DNA Maternal lokus
Plasental DNA Paternal lokus
G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G TCG T C A T T G C A T C G A Plasental DNA Pat
Plasental DNA Mat
G A C T A G A A G C G T G T CG T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A Maternal DNA
Fetusa ait DNA fragmanları
Maternal DNA
Plasental DNA
amplifikasyon
fark 31.10.2014 22:44
14
cfDNA da plasental DNA nın saptanması
• Y kökenli dizilerin total DNA havuzuna oranı
• SNP farklılılarının saptanması
SNP : Genomda bulunan ve fenotipi etkilemeyen kısa baz değişiklikleridir. Toplumda değişik sıklıklarda saptanan SNP ler vardır. Genomda şimdilik bilinen SNP sayısı >70.000.000
ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCAGATACAGTAG
GTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG CTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGAT
GGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG GCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAG ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG TAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGG
GGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG AGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATA
GGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGC
TTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG AGGAGGTGATTTCGCCAAT
. . .
ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCG ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCA ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGC
. .
ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCAGAT
%92
%8
!!! Aynı yöntem nokta mutasyonları ve Rh analizlerinde de kullanılmaktadır.
31.10.2014 22:44 15
SNP tabanlı targeted dizileme (PANORAMA )
31.10.2014 22:44 16
G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
ANNE SNP PROFİLİ
G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A
G A C T A G A A G C G T G T A G TGA T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T GA T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T GA T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G TGA T T G C A T C G A
cfDNA SNP PROFİLİ
G A C T A G A A G C G T GGA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GGA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GGA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GGA G T C A T T G C A T C G A
T/A C/C
G/C
T/G
Örnek alımı
• Maternal periferik kan ~10 ml
• standard EDTA içeren tüp (~8 saat)
• Özel CF DNA örnekleme tüpü (14 gün oda ısısı) (Streck Cellfree DNA BCT CE)
31.10.2014 22:44 17
Genel Protokol
• Library preparation
• Cluster generation / Clonal amplification
• Massively parallel sequencing
• Mapping reads (Alignment)
• Quantifying reads
• Interpreting data
• Reporting
31.10.2014 22:44 18
• Library preparation
Adaptör ve barkod eklenmesi
- Adaptör DNA nın tutunmasını sağlar ve amplifikasyon sırasında primer görevi yapar.
- Barkod aynı çalışmada çalışılan örneklerin birbirinden ayrılmasını sağlar
31.10.2014 22:44 19
• Cluster generation / Clonal amplification
İllumina
İon torrent
PCR reaksiyonu DNA polimeraz
31.10.2014 22:44 20
• Massively parallel sequencing
Illumina
Ion torrent
31.10.2014 22:44 21
Başlangıçtaki DNA Havuzu
Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon
tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Anne ye ait DNA fragmanları
Fetusa ait DNA fragmanları
Kantitatif Yöntem; Fetus NORMAL
Kromozom 18 13 21
Kromozom
18 13 21
1 : 1 : 1
Anne 46 kromozom + fetus 46 kromozom
Kantitatif Yöntem
Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Chr 21 fragmanları Chr 21 fragmanları
Amplifikasyon öncesi DNA Havuzu
maternal
fetal
Aynı kromozomun
fragmanlarında farklı oranlarda
artış?
DNA baz dizilimi ve CG zenginliğine göre amplifikasyon veriminin değişimi
• Mavi pikler CG zenginliği göz önüne alınmadan elde edilen sonuç
• Kırmızı pikler CG zenginliği dikkate alınarak normalizasyon yapılmış durum
H. Christina Fan, 2010
!!! Problem : Lokasyon (CNV varlığı) ve motife (CG/AT oranı) dayalı
amplifikasyon farklılıkları dozun değişmesine yol açar!!
Çözüm: CG zenginliği paralel dizilerin kullanılarak normalizasyon yapılması ve stabil bölgelerin analize alınması
31.10.2014 22:44 24
Başlangıçtaki DNA Havuzu
Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon
tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Anne ye ait DNA fragmanları
Fetusa ait DNA fragmanları
Kantitatif Yöntem; Fetus NORMAL
Kromozom 18 13 21
Kromozom
18 13 21
1 : 1 : 1
Anne 46 kromozom + fetus 46 kromozom
Başlangıçtaki DNA Havuzu
Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon
21. Kromozom AMPLİKONLARINDA artış Fetusa ait
DNA fragmanları Anne ye ait
DNA fragmanları
Kantitatif Yöntem; Fetus TRİZOMİK
Kromozom 18 13 21
Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Kromozom
18 13 21
9:1 ; 9/1 : 9/1,5
Anne 46 kromozom + fetus 47 kromozom (47,+21)
Kalitatif yYöntem :Targeted sequencing
Önceden belirlenmiş hedef bölgeler için
tasarlanmış oligolar
Amplifikasyon
DNA havuzundan istenen bölgelerin ayıklanması
hedef bölgeler için
Havuzdaki miktarla orantılı elde edilen oligolar
Veri analizi
atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgagcatg atgagcatg
cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgttcgaa cgttcgaa
ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcctgca ggcctgca
31.10.2014 22:44 27
Targeted sequencing/ SNP sequencing/ MPSS/s-MPSS
MPSS SNP sequencing Targeted sequencing Dizilenen
bölge sayısı
Yüksek sayıda dizi elde edilir
Sınırlı sayıda okuma elde edilir
Sınırlı sayıda okuma elde edilir
Tekrar sayısı Yüksek Yüksek Yüksek Akraba evliliğinde
hassasiyet
Yumurta
donasyonunda Hassasiyet*
Değişmez Değişmez Değişmez
*Fetal plasental DNA nın fraksiyonunun hesaplanmasında ve SNP tabanlı
çalışmalarda analiz optimizasyonu gerektirir. Çalışan firmalar var (Harmony, Materni21), çalışmayan (Panorama)
31.10.2014 22:44 28
Gelecekteki beklentiler
• Mikrodelesyon ve mikroduplikasyonların yüksek hassasiyetle ve güvenilirlikle yapılması
• Tek gen hastalıklarının topluca taranabilmesi
• Tüm genom dizileme
Daha uzun dizilerin amplifikasyon olmadan okunabilmesi, Maliyetlerin düşmesi
Teşekkürler
31.10.2014 22:44 29