• Sonuç bulunamadı

GÜVEN TOKSOY

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "GÜVEN TOKSOY"

Copied!
29
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

Dr. Güven Toksoy, PhD İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD

Moleküler Dizileme Teknolojileri

31.10.2014 22:44 1

(2)

• Klasik dizileme

– Sanger dizileme

– Maxim Gilbert dizileme tekniği

• Yeni nesil dizileme teknolojileri

2. Nesil dizileme

Illumina (Reversible Dye Terminator)

Ion Torrent (native dNTP proton detection)

Roche (Pyrosequencing) (çekildi, teknoloji değişikliği ?) Solid ABI (Ligation based) (çekildi)

3. Nesil dizileme (henüz rutinde yok 2-3 yıl)

PacBio Real time sequencing (amplifikasyon gerekmiyor)

Helicos (Reversible Dye Terminator) (amplifikasyon gerekmiyor)

Oxford Nanopore (porotic ion detection) (amplifikasyon gerekmiyor)

31.10.2014 22:44 2

(3)

Karşılaştırma

SANGER DİZİLEME YENİ NESİL DİZİLEME (2. nesil)

Sınırlı büyüklük Tüm genoma kadar

900-1000 bp 75-400 bp

Tüm dizi tek çıktı Her bir hedef için çok kopya Mozaiklik için yetersiz Mozaiklik için uygun

Dizi başına ~5 USD (baz başına 5/1000USD) Exom ~500 USD (500/30x10

3

USD) Motiften bağımsız yüksek özgünlük Motife göre değişen özgünlük Altyapı göreceli ucuz Altyapı pahalı

Run maliyeti ucuz* Run maliyeti pahalı*

31.10.2014 22:44 3

(4)

+ +

MgCL2

+

MgCL2

MgCL2

MgCL2 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4

(NH4)2SO4 KCl

KCl KCl

+

Dizilenecek PCR ürünü

Dizilenecek hedef bölgeye uygun

primer

İşaretli dNTP ve ddNTP karışımı

Polimeraz enzimi

SANGER Dizileme PCR

31.10.2014 22:44 4

(5)

3 ’ G A C T A G A T A C G A G C G T G A 5’Template DNA 5 ’ C T G A TCTATGCTCGCACT 3 ’

Elektroforez*

C T G A TC T G A T CC T G A T C TC҉ T҉ A҉ C T G A T C T A T C T G A T C T A T G C T G A T C T A T G C C T G A T C T A T G C T

C T G A T C T A T G C T CC T G A T C T A T G C T C GC T G A T C T A T G C T C G CC T G A T C T A T G C T C G C AC T G A T C T A T G C T C G C A CC҉ A҉ C҉ T҉

z a m a n

C T G A T C T A

A G T C T

C A C G C T C G T A T C

O K U M A

Y Ö N Ü

*işaretli nükleotid ile sonlanmış binlerce kopya içeren fragmanlar

Primer dizisi

31.10.2014 22:44 5

(6)

Yeni Nesil Dizileme

• Next generation sequencing (Yeni nesil dizileme)

• Deep sequencing (Derin dizileme)

• Massivelly parallel sequencing (Masif paralel dizileme)

• High-throughput sequencing (Yüksek kapasiteli dizileme)

Second generation sequencing Illumina (Reversible Dye Terminator)

Roche (Pyrosequencing) (??)

Solid ABI (Ligation based) (çekildi)

Ion Torrent (native dNTP proton detection)

Third generation sequencing

PacBio Real time sequencing (amplifikasyon gerekmiyor)

Helicos (Reversible Dye Terminator) (amplifikasyon gerekmiyor)

Oxford Nanopore (porotic ion detection) (amplifikasyon gerekmiyor)

31.10.2014 22:44 6

(7)

İş akışı

Dizileme (Sequencing)

Kütüphane hazırlanması (Library preparation)

Veri analizi (Data analysis)

DNA örnekleri fragmante edilir (ya da hedef fragmanlar elde edilir), fragmanların ucuna platforma özgün

adaptörler takılır

PCR ile amplifiye edilir (platforma spesifik ortamda)

Yeni nesil dizilemede DNA sentezi ve okuma işlemi aynı anda gerçekleşir ve eşzamanlı olarak bir çok dizileme yapılır (Massively parallel sequencing)

(kısa okuma ve hatalı okumanın ana nedeni de bu işlem sırasındaki desenkronizasyondur)

RAW data analizi, dizilerin filtrelenmesi, assambling, varyasyon analizi, biyoinformatik analiz

31.10.2014 22:44 7

(8)

• De novo sequencing

• Resequencing

• Targeted sequencing

• Shotgun Targeted sequencing

VERİ BÜYÜKLÜĞÜ

normal

Polimorfizm

Patolojik/

olası patolojik Gri bölge

Terimler

• Whole genome sequencing

• Exom sequencing

• Targeted sequencing

• Sanger sequencing

31.10.2014 22:44 8

(9)

Yeni nesil dizileme ile tanı

İşlem sonrası Elde edilen bilgi

Sonuç

Lab iş gücü

Nadir/de novo varyasyonlar

ya da etkisi bilinmeyen mutasyonlar Polimorfizm

Normal diziler

Fenotip ilişkili mutasyon

Biyoinformatikçi

31.10.2014 22:44 9

(10)

31.10.2014 22:44 10

Yeni nesil dizileme ve cfDNA çalışmaları

(11)

cfDNA ile anöplodi taraması

FİRMA-MARKA PLATFORM ANALİZ TEKNİĞİ ve ALGORİTMA

BGI:NIFTY Illumina Hiseq& İon proton MPSS

SEQUENOIM: Materni T21Plus Illumina Illumina Hiseq t-MPSS Verinata Health: Verifi Prenatal test Illumina Hiseq S-MPSS

Integrated Genetics: Ariosa: Harmony Illumina Hiseq DANSR + FORTE (t-MPSS)

Natera:Panorama Illumina Hiseq Non kantatif - SNP tabanlı targeted

dizileme ~20.000 SNP

Premaitha healt: Iona test (2015 ocak) İon proton S-MPSS + Fetal fraksiyon düzeltmesi

MPSS:Massively parallel signature sequencing

FORTE:Fetal-fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation

NIFTY, Natera ve Sequanom Digeorge ve diğer mikro del/dup sendromları için sonuç veriyor.

31.10.2014 22:44 11

(12)

Sayılar

- 10 milyon adet 25-30 bp uzunlukta dizi elde edildiinde total genomun yaklaşık %4 ü dizilenmiş oluyor. Bunlardan %50 si unique dizi. Chr13 için ~154.000, chr18 135.000 ve chr21 için 65.700 dizi haritalanabiliyor.

(H. Christina Fan, PNAS, October 2008)

- Trizomi21 li fetus taşıyan gebelikte örnekten 10.800.000. okuma elde edililirken sadece bu okunan dizilerden 21. kromozoma ait 32 000 tanesi (%0,3) anöploidi hesaplamasında kullanılabiliyor

(Chiu RW, Proc Natl Acad Sci USA 2008)

- Fetal plasental DNA fraksiyonu kromozomal dozun hesaplanmasında çok önemli ve spesifiteyi arttırıyor.21. Kromozoma ait %4 oranında DNA taşıyorsa bunun trizomi durumunda %2 artış beklenmelidir. Yüksek güvenilirlik için yaklaşık 93.000 adet 21. kromozoma ait dizinin elde edilmesi gerekir. Bu da 21. kromozom DNA yükü total genomun % 1,5 olduğu için toplam okunabilir dizi sayısının minimum 6.3 milyon, ortalama MPSS verimi %25 olduğundan yaklaşık örnek başına toplam 25.000.000 okuma yapmak gerekmektedir.

(Andrew B. Sparks, P APRIL American Journal of Obstetrics & Gynecology, 2012)

- Targeted SNP çalışmalarında yaklaşık 25.000 yüksek polimorfizm gösteren SNP bölgesi taranıyor.

31.10.2014 22:44 12

(13)

cfDNA

Plazmada serbest DNA fragmanları ≤300bp

Köken: Plasenta sitotrofoblast ve sinsisyotrofoblast hücreleri apoptosis ve yıkımı

Plasenta kökenli DNA <%10

Maternal DNA ≥%90

Eritrositler Lenfositler

Plazma

- İnsan genomu ~3 milyar baz uzunluğunda

- Rastgele kırılmış halde milyonlarca küçük fragman - chr13 %3,7; chr18 %2,5 chr21 %1.5’ ini oluşturuyor

- Plasental DNA parçacıkları total havuzda fraksiyon %10 ise chr13 % 0,37; chr18 %0,25; chr21 %0,15

Perferik kan

31.10.2014 22:44 13

(14)

cfDNA nın yeni nesil dizilemede kullanımı

Kantitatif: Amplifikasyon sonrası karşılaştırmalı ürün artışının

saptanması Kalitatif: Plasental DNA dan elde edilen

baba kökenli dizide anneden farklı baz değişiminin gösterilmesi

Plasental DNA Maternal lokus

Plasental DNA Paternal lokus

G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G TCG T C A T T G C A T C G A Plasental DNA Pat

Plasental DNA Mat

G A C T A G A A G C G T G T CG T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A Maternal DNA

Fetusa ait DNA fragmanları

Maternal DNA

Plasental DNA

amplifikasyon

fark 31.10.2014 22:44

14

(15)

cfDNA da plasental DNA nın saptanması

• Y kökenli dizilerin total DNA havuzuna oranı

• SNP farklılılarının saptanması

SNP : Genomda bulunan ve fenotipi etkilemeyen kısa baz değişiklikleridir. Toplumda değişik sıklıklarda saptanan SNP ler vardır. Genomda şimdilik bilinen SNP sayısı >70.000.000

ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCAGATACAGTAG

GTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG CTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGAT

GGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG GCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAG ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG TAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGG

GGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG AGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATA

GGAGGTGATTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCGGC

TTTCGCCAATGCGGCAGATACAGTAG AGGAGGTGATTTCGCCAAT

. . .

ATGCTAGGAGGTGATTTCGCCAATGCG ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCA ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGC

. .

ATGCTAGGAGGTGATTTCACCAATGCGGCAGAT

%92

%8

!!! Aynı yöntem nokta mutasyonları ve Rh analizlerinde de kullanılmaktadır.

31.10.2014 22:44 15

(16)

SNP tabanlı targeted dizileme (PANORAMA )

31.10.2014 22:44 16

G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A

ANNE SNP PROFİLİ

G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GAA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T C A T T G C A T C G A

G A C T A G A A G C G T G T A G TGA T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T GA T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G T GA T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T G T A G TGA T T G C A T C G A

cfDNA SNP PROFİLİ

G A C T A G A A G C G T GGA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GGA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GGA G T C A T T G C A T C G A G A C T A G A A G C G T GGA G T C A T T G C A T C G A

T/A C/C

G/C

T/G

(17)

Örnek alımı

• Maternal periferik kan ~10 ml

• standard EDTA içeren tüp (~8 saat)

• Özel CF DNA örnekleme tüpü (14 gün oda ısısı) (Streck Cellfree DNA BCT CE)

31.10.2014 22:44 17

(18)

Genel Protokol

• Library preparation

• Cluster generation / Clonal amplification

• Massively parallel sequencing

• Mapping reads (Alignment)

• Quantifying reads

• Interpreting data

• Reporting

31.10.2014 22:44 18

(19)

• Library preparation

Adaptör ve barkod eklenmesi

- Adaptör DNA nın tutunmasını sağlar ve amplifikasyon sırasında primer görevi yapar.

- Barkod aynı çalışmada çalışılan örneklerin birbirinden ayrılmasını sağlar

31.10.2014 22:44 19

(20)

• Cluster generation / Clonal amplification

İllumina

İon torrent

PCR reaksiyonu DNA polimeraz

31.10.2014 22:44 20

(21)

• Massively parallel sequencing

Illumina

Ion torrent

31.10.2014 22:44 21

(22)

Başlangıçtaki DNA Havuzu

Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon

tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu

Anne ye ait DNA fragmanları

Fetusa ait DNA fragmanları

Kantitatif Yöntem; Fetus NORMAL

Kromozom 18 13 21

Kromozom

18 13 21

1 : 1 : 1

Anne 46 kromozom + fetus 46 kromozom

(23)

Kantitatif Yöntem

Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu

Chr 21 fragmanları Chr 21 fragmanları

Amplifikasyon öncesi DNA Havuzu

maternal

fetal

Aynı kromozomun

fragmanlarında farklı oranlarda

artış?

(24)

DNA baz dizilimi ve CG zenginliğine göre amplifikasyon veriminin değişimi

• Mavi pikler CG zenginliği göz önüne alınmadan elde edilen sonuç

• Kırmızı pikler CG zenginliği dikkate alınarak normalizasyon yapılmış durum

H. Christina Fan, 2010

!!! Problem : Lokasyon (CNV varlığı) ve motife (CG/AT oranı) dayalı

amplifikasyon farklılıkları dozun değişmesine yol açar!!

Çözüm: CG zenginliği paralel dizilerin kullanılarak normalizasyon yapılması ve stabil bölgelerin analize alınması

31.10.2014 22:44 24

(25)

Başlangıçtaki DNA Havuzu

Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon

tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu

Anne ye ait DNA fragmanları

Fetusa ait DNA fragmanları

Kantitatif Yöntem; Fetus NORMAL

Kromozom 18 13 21

Kromozom

18 13 21

1 : 1 : 1

Anne 46 kromozom + fetus 46 kromozom

(26)

Başlangıçtaki DNA Havuzu

Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon

21. Kromozom AMPLİKONLARINDA artış Fetusa ait

DNA fragmanları Anne ye ait

DNA fragmanları

Kantitatif Yöntem; Fetus TRİZOMİK

Kromozom 18 13 21

Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu

Kromozom

18 13 21

9:1 ; 9/1 : 9/1,5

Anne 46 kromozom + fetus 47 kromozom (47,+21)

(27)

Kalitatif yYöntem :Targeted sequencing

Önceden belirlenmiş hedef bölgeler için

tasarlanmış oligolar

Amplifikasyon

DNA havuzundan istenen bölgelerin ayıklanması

hedef bölgeler için

Havuzdaki miktarla orantılı elde edilen oligolar

Veri analizi

atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgatcatgg atgagcatg atgagcatg

cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgtacgaa cgttcgaa cgttcgaa

ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcatgca ggcctgca ggcctgca

31.10.2014 22:44 27

(28)

Targeted sequencing/ SNP sequencing/ MPSS/s-MPSS

MPSS SNP sequencing Targeted sequencing Dizilenen

bölge sayısı

Yüksek sayıda dizi elde edilir

Sınırlı sayıda okuma elde edilir

Sınırlı sayıda okuma elde edilir

Tekrar sayısı Yüksek Yüksek Yüksek Akraba evliliğinde

hassasiyet

Yumurta

donasyonunda Hassasiyet*

Değişmez Değişmez Değişmez

*Fetal plasental DNA nın fraksiyonunun hesaplanmasında ve SNP tabanlı

çalışmalarda analiz optimizasyonu gerektirir. Çalışan firmalar var (Harmony, Materni21), çalışmayan (Panorama)

31.10.2014 22:44 28

(29)

Gelecekteki beklentiler

• Mikrodelesyon ve mikroduplikasyonların yüksek hassasiyetle ve güvenilirlikle yapılması

• Tek gen hastalıklarının topluca taranabilmesi

• Tüm genom dizileme

Daha uzun dizilerin amplifikasyon olmadan okunabilmesi, Maliyetlerin düşmesi

Teşekkürler

31.10.2014 22:44 29

Referanslar

Benzer Belgeler

- Tüm algoritma uygulansa bile olguların %35-38 inde hala genetik tanı yok - YND testlerinde yüksek «VUS oranları ve rastlantısal bulgular». - Doğru ve etkin genetik

Bu sürpriz başarının mimarı, şüphesiz İGP ile ivme kazanan DNA dizileme sektörüne Yeni Nesil Dizileme (YND, Next Generation Sequencing-NGS) teknolojilerinin

İncelenen ihmal istismar türüne göre, %45.31 oranında genel çocuk ihmali ve istismarının çalışıldığı, %36.72 oranında cinsel ihmal ve istismar, %8.59 fiziksel ihmal

Bir yandan okuma- yazma bilmeyenlerin sayılarının hızla artmasına karşılık diğer yandan Halk Dershaneleri yoluyla okuma-yazma öğretilenlerin sayısının giderek

2012 yılının sonlarında Çin’deki Tang devrinin başkenti, eski adıyla Chang’an şimdiki adıyla Xi’an’de Çince uzun bir metin ile 17 satırdan oluşan runik harfli

Rutin uygulanan kemoterapi, kanser veya normal hücre ayrımı olmaksızın tüm hızlı bölünen hücreler üzerinde etkili olduğu için seçici olmayan bir şekilde

Okuyucuların yazılı metinlerde yer alan kelimeleri uygun ortografik, sesbilgisel, morfolojik bilgi ve becerilerini kullanarak çözümledikleri, ardından çözümlenen

Bu dönemde sözcükler genellikle bütünsel olarak okunur, tanınmayan sözcükleri okumak için yazıbirim-sesbirim ilişkisi kurulur, bağlam ipuçlarından yararlanılır ya